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人体运动性骨骼肌损伤的诱导与评估

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DOI：

10.3791/54859

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2016年12月11日

 ,  , 
1Exercise Sciences, Brigham Young University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在人体受试者中安全、可靠地诱导并量化运动性骨骼肌损伤的方法。

摘要

通过自愿进行的离心（拉长）收缩引发肌肉收缩性损伤，为研究人类肌肉的适应与恢复提供了一个极佳的模型。本文讨论了一种用于诱导股四头肌损伤的离心运动方案设计，该损伤表现为力量变化、肌肉酸痛以及血浆肌酸激酶水平升高。该方法简便、符合伦理且具有广泛适用性，因其在人类受试者中实施，避免了跨物种结果外推的问题。受试者以特定速度完成300次膝伸肌的最大离心收缩 在等速测力仪上以120°/秒的速度进行。通过运动后数天内相对非侵入性的等速和等长力量损失、肌肉酸痛以及血浆肌酸激酶水平的测量，可量化损伤程度。因此，该方法可应用于特定人群，以期揭示肌肉适应与再生的机制。

引言

该实验方案的总体目标是诱导产生运动性损伤 股四头肌 在人体受试者中利用自主拉长（离心）收缩来锻炼肌肉。

由收缩引起的骨骼肌损伤是运动后的常见后果，其特征表现为延迟性肌肉酸痛1、短暂性的肌力下降以及血液中肌肉特异性酶水平升高2。当受试者进行其不习惯的运动，尤其是涉及离心收缩的运动时，运动性肌肉损伤尤为明显3。运动性肌肉损伤通常为良性过程，酸痛症状会逐渐缓解，血清蛋白水平和肌力通常在损伤发生后的数天至数周内恢复至损伤前水平。在极端情况下，运动性肌肉损伤可导致一种危及生命的综合征，称为横纹肌溶解症。然而，在无其他叠加因素（包括热应激、脱水5、感染6或罕见的遗传易感性7）的情况下，健康个体的运动性肌肉损伤通常不足以引发临床意义上的横纹肌溶解症4。

由收缩引起的肌肉损伤通常比毒素诱导或冷冻诱导的损伤更轻微，后两种方法常用于啮齿类动物研究8,9。然而，由收缩引起的损伤为研究肌肉损伤反应提供了一种有用的方法，并具有显著优势。首先，该方法在人体受试者中应用时安全且符合伦理要求1-3。因此，数据可直接从人体受试者获得，无需进行跨物种结果的推导。此外，由于啮齿类动物损伤模型中的损伤程度远超对人体受试者实施损伤的伦理可接受范围，从啮齿类动物研究中获得的数据很难进行有效转化。其次，由收缩引起的损伤在运动过程中普遍存在，是运动的一种自然现象。因此，这种损伤诱导方式适用于研究运动背景下的肌肉损伤、运动适应性以及明显的肌肉损伤。本文介绍了一种在人体中通过拉长收缩安全且可靠地诱导和评估骨骼肌损伤的方法。

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方案

以下操作程序符合杨百翰大学机构审查委员会（IRB）的标准。

1. 准备收缩实验方案

注意：以下实验方案的操作说明基于 Biodex Advantage 软件。若使用其他系统，软件操作与测力计的使用方法将有所不同。

  1. 等速肌力测试方案
    1. 要创建等速协议，请在计算机上打开测力计控制软件并选择 "实验方案" 标签，然后选择 "记录" 屏幕顶部工具栏上的标签。选择 "新方案" 从下拉列表中。
    2. 在 "研究类型" 盒中，选择 "测试" 选项
    3. 从下拉菜单中选择以下参数：在 "模式" 菜单选择等速。在下方 "关节" 菜单选择膝盖。在下方的 "模式" 菜单选择伸展/屈曲。为伸展和屈曲运动均选择向心收缩。选择 "重复" 在……之下 "结束" 下拉菜单
    4. 在 "单侧" 程序1设置为向远和向近收缩均以60°/秒的速度进行3次重复。操作方法为输入 "1" 进入 "# 设置" 领域与类型 "3" 在 "由 Reps 结束" 行。然后在两个框中均输入 60 "快速离开" 和 "速度朝向" 行。
    5. 以90°作为解剖学参考点，将活动范围限制设置为约从该点起始向外10°、向内至110°（0° = 完全伸展，135°） = 完全屈曲）。为此，请选择 "设置关节活动范围" 屏幕左侧的按钮。校准杠杆臂，使90°时与地面平行（可通过计算机屏幕上提供的杠杆臂角度指示器确认）。然后以90°作为解剖学参考点，将活动范围限制设置为约10°伸展（远离）和110°屈曲（靠近）（0° = 完全伸展，135° = 完全屈曲）。
      注意：此处给出的关节角度设置为推荐值，但应根据具体情况调整，尤其是在处理存在固定屈曲畸形或其他活动受限的受试者时。
    6. 将该方案命名为 "描述" 屏幕左下方的字段，然后选择顶部菜单栏中的保存按钮。
  2. 等长肌力测试方案
    1. 重复步骤 1.1.1 以开始创建等长收缩实验方案。
    2. 选择 "测试" 选项从 "研究类型" 盒子
    3. 从下拉菜单中选择以下参数：在 "模式" 菜单选择 "等距的". 在……之下 "关节" 菜单选择 "膝". 在……之下 "模式" 菜单选择 "伸展/屈曲". 在……之下 "收缩方向" 菜单选择 "远离". 在 "结束" 菜单选择 "重复".
    4. 设置一项测试程序，包含1组3次等长收缩，每次持续5秒，关节角度为70°。为此，请输入 "1" 进入 "职位" 领域上的 "单侧" 在位置编号1列下，输入 "3"在 "以 Reps 结束" 行。在标记为 "角度" 选择 "70".
    5. 选择90°作为解剖学参考点，并将远离限制设为70°。
    6. 将方案命名为 "描述" 屏幕左下角的字段，然后选择顶部菜单栏中的保存按钮。
  3. 肌肉损伤性离心运动实验方案
    1. 为了制定偏心运动方案，请在计算机上打开测力计控制软件并进行选择 "实验方案" 选项卡，然后选择 "记录" 点击屏幕顶部工具栏中的标签。现在点击 "新方案" 从下拉列表中。
    2. 选择 "运动" 选项从 "研究类型" 盒子
    3. 从下拉菜单中选择以下参数：在 "模式" 菜单选择 "等速". 在……之下 "关节" 菜单选择 "膝关节". 在……之下 "模式" 菜单选择 "伸展/屈曲". 在……之下 "收缩" 菜单选择 "Con/ECC".
    4. 在 "单侧" 以180°/秒的速度离心、120°/秒的速度向心，进行10组，每组10次重复，组间休息60秒。
      1. 类型 "10" 进入 "# 集合" 领域
      2. 在第一列（标记为 #1）中输入 "10" 标记为的行中 "以重复次数结束"然后输入 "180" 在下一个标有标签的行中 "快速离开". 在下一个标有 "速度朝向"，类型 "120". 在标记为的行中 "扭矩"，根据受试者预期的力量水平输入200至600。
      3. 对第2至第10组重复步骤1.3.4.2。
      4. 60 型 "休息时间（秒）" 领域
    5. 输入90° "解剖学参考" 领域
    6. 选择 "设定关节活动范围" 屏幕左侧的按钮，将运动范围限制设置为远离方向40°，朝向方向110°（0°为完全伸展，135°为完全屈曲）。这些设置定义了受试者需对测力计臂施加阻力的运动范围。作为安全预防措施，若受试者在此指定范围内停止施加阻力，测力计将自动停止运动。
      1. 为设定运动范围，选择 "设置关节活动范围" 屏幕左侧的按钮。校准杠杆臂，使90°时与地面平行（以计算机屏幕上提供的杠杆臂角度指示器为准）。然后以90°作为解剖学参考点，将活动范围限制设置为远离40°、靠近110°（0° = 完全伸展，135° = 完全屈曲）。
        注意：这些关节角度设置是针对典型健康受试者的建议，应根据个体间的能力差异进行调整。
    7. 将该方案命名为 "描述" 领域并选择 "保存" 顶部工具栏中的按钮。

2. 基线测量

  1. 疼痛程度测量
    1. 在页面上水平绘制一条100 mm的直线，制成视觉模拟评分尺。
    2. 在线条左侧标明 "无疼痛感" 在线的右侧标明 "极度疼痛" (图1）。该方法常用于评估延迟性肌肉酸痛1,10,11.
    3. 指导受试者完成两个自重深蹲。进行深蹲时，双臂应伸直前平举，与肩同高，双脚分开与肩同宽。下蹲至大腿上部与地面平行为正确深度，随后返回起始位置。
    4. 要求受试者指出其感到的酸痛强度 股四头肌 在视觉模拟量表的适当位置画一条垂直线，以评估深蹲时肌肉的用力程度。
    5. 通过测量视觉模拟量表上无疼痛端到受试者标记处的毫米距离，量化受试者的疼痛程度。
  2. 血清肌酸激酶
    注意：处理血液前应佩戴防护手套，并按照医院或大学的规定，将使用后的针头立即丢弃至锐器容器中。
    1. 在空腹条件下，按照标准静脉采血操作规程，从受试者手臂肘前区采集5至6 ml血液12.
    2. 将血样在3℃条件下以15 × g离心15分钟 °C 以分离血清与血细胞。
    3. 使用移液管将血清样本转移至已正确标记受试者编号和采样时间点的微量离心管中。
    4. 将样品于 -80 °C 保存以备后续使用。
    5. 使用市售试剂盒，按照生产商提供的方案检测血清样本中的肌酸激酶活性。或者，可将血清样本送至当地医学诊断实验室进行分析。
  3. 受试者准备
    1. 在受试者就诊前48小时，指导其避免剧烈或不习惯的运动、非甾体抗炎药及酒精。
    2. 受试者到达后，在准备开始前收集其体重、身高、性别和优势腿信息。优势腿可通过询问受试者习惯用哪条腿踢球来确定。
    3. 让受试者在进行力量测试前，在功率自行车上以50至150 W的负荷热身10分钟。
    4. 热身后，让受试者坐在测力计的座椅上。根据受试者体型调整座椅的倾斜度、高度、前后位置、靠背角度以及轴臂的旋转角度。以股骨外侧髁为参考点，使膝关节的旋转轴与测力计轴臂的旋转轴对齐。调节轴臂长度，使其位于内踝近端附近，并用绑带固定。受试者应能舒适地完成足底屈曲的全范围运动。
    5. 在座椅前缘与腿部后方之间预留足够的空间（25 mm），以确保膝关节最大程度屈曲时不会产生压迫或不适。
    6. 用肩部、髋部、踝部和大腿绑带固定受试者。为孤立膝伸肌并避免辅助肌群参与，必须确保受试者被牢固固定。
    7. 让受试者进行3-5次膝关节伸展/屈曲的练习动作，监测其关节活动范围及是否存在不适症状（这些症状可能在开始收缩实验方案之前即已存在），并根据需要进行调整。
    8. 现在，当测力计的可调节部件已正确安装到受试者身上后，记录座椅位置设置和轴臂位置，以便在后续访问时能够重复相同的设置。
      注意：确保受试者的安全与舒适至关重要。测力计配备有紧急停止按钮，供受试者和操作者在紧急情况下使用。
  4. 力测量
    1. 受试者正确就座并加载等长肌力测试程序后，指导受试者如何进行测试。
      1. 告诉受试者，他们将对抗保持静止的杠杆臂进行收缩。指导受试者根据计算机屏幕的提示，完成3次收缩，每次持续5秒。
      2. 嘱受试者在每次收缩期间保持最大努力。指导受试者在收缩过程中正常呼吸。要求受试者在测试期间将双臂交叉置于胸前。
      3. 启动等长收缩实验方案，让受试者以次最大努力进行测试练习。该练习试验可使受试者熟悉测试流程，同时提供针对该测试的热身。允许受试者练习2至3次。
    2. 受试者准备就绪后，开始测试，并口头鼓励受试者在每次收缩时尽力达到最大努力。
    3. 记录扭矩、功率和做功。软件还会计算变异系数（基于表现可重复性的测试有效性的统计学表示，数值越低表示可重复性越高）。如果变异系数超过15%，则重复测试，最多重复4次。若受试者在4次尝试后仍无法使变异系数低于15%，则采用变异系数最小的一组数据。
    4. 让受试者休息两到三分钟，然后加载等速测试方案以获取等速力量数据。
    5. 受试者固定在座椅上后，指导其如何进行等速测试。
      1. 告知受试者，他们将对以恒定速度移动的杠杆臂进行三次伸展和屈曲收缩。告知受试者，每次收缩时应在整个运动范围内尽可能用力地进行收缩。
      2. 告诉受试者，当达到活动范围的极限时，杠杆臂将停止移动。要求受试者在测试过程中将双臂交叉抱于胸前。提醒受试者在收缩过程中不要屏住呼吸。
        注意：尽管研究者可能对收缩过程中屈曲阶段的数据不感兴趣，但在屈曲和伸展动作中均付出最大努力的受试者，通常在伸展动作期间表现出更稳定的力输出。
    6. 开始测试，并口头鼓励受试者尽最大努力完成。
    7. 记录扭矩、功率和做功。软件还会计算变异系数（基于表现可重复性的测试有效性的统计表示，数值越低表示可重复性越高）。如果变异系数超过15%，则需重复测试。
      1. 重复测试最多4次。如果受试者在4次尝试后仍无法使变异系数低于15%，则采用变异系数最小的一组数据。

3. 损伤诱导

  1. 在第二部分基线测量后的1至3天内，让受试者返回实验室，进行本方案的损伤诱导部分
  2. 让受试者在功率自行车上进行10分钟的热身，功率设定为50至150 W。
  3. 热身结束后，根据步骤2.3.7中记录的调整设置，将受试者正确固定在测力计上，加载肌肉损伤性离心运动方案，并指导受试者正确执行该运动。
    1. 告知受试者，在每次收缩时需对抗杠杆臂以启动轴臂的运动；当轴臂以固定速度向其移动时，其目标是以最大力量对抗该运动。
    2. 允许受试者握住座椅两侧的手柄。
    3. 提醒受试者在收缩过程中保持呼吸，离心阶段应呼气。
  4. 当受试者准备就绪后，按下屏幕上的开始按钮，启动第一组收缩运动。
  5. 口头鼓励受试者在每次收缩中保持最大努力。
  6. 根据屏幕提示，指导受试者完成10组、每组10次的运动，组间休息1分钟。
  7. 完成10组后，让受试者休息1至5分钟，然后重复该方案。
    注意：离心运动方案中最多可设置10组，但具体数量可能因所使用的测力计和软件而异。休息时间可用于操作人员必要时重新加载方案。
  8. 重复该过程两次，共完成总计300次以离心为主的收缩运动。

4. 肌肉损伤评估

  1. 在损伤性运动后立即以及24、48、72和96小时后，重复进行2.4节所述的等速和等长肌力测试。
  2. 在损伤性运动后24、48、72和96小时，重复2.1节所述的酸痛程度评估。每次评估务必使用新的视觉模拟量表，以确保受试者无法看到其先前的回答。
  3. 根据实验方案规定的时间点，在损伤性运动后48小时和120小时，或按实验设计指定的时间，重复2.2节所述的采血操作，用于肌酸激酶测定。
  4. 将肌酸激酶、肌力和酸痛数据绘制于图表的纵轴，时间绘制于横轴。
  5. 观察这些变量在运动后数日内偏离基线值及恢复至基线值的变化趋势，分别反映肌肉损伤与修复过程。

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结果

采用本文所述方法，对7名未经训练的年轻男性进行了基础肌肉酸痛、血清肌酸激酶活性以及力量（等长和等速）的测量。次日，受试者接受了上述肌肉损伤性离心收缩实验方案。为评估肌肉损伤程度，在运动后对力量、酸痛感及血清肌酸激酶活性进行了随访检测。力量测量分别在运动后即刻以及24、48、72和96小时进行；酸痛感测量在运动后24、48、72和96小时进行；血清肌酸激酶则在运动后48和120小时进行检测。这些数据采用单因素重复测量方差分析，并结合Dunnett多重比较检验，将运动后各时间点的数值与运动前基线值进行比较。与运动前相比，等长收缩力和等速收缩力分别在运动后24小时和48小时内下降，并在此后恢复至接近运动前水平（图2）。运动后24、48和72小时，肌肉酸痛感显著增加（图3）。血清肌酸激酶在运动后48小时显著升高（图4）。图5展示了在造成肌肉损伤的运动后数日内一条非典型的等长收缩力曲线。

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讨论

要获得本实验方案的预期结果，有几个步骤至关重要。首先，受试者必须充分熟悉收缩实验流程，尤其是力量测量部分。务必确保受试者清楚了解他们需要完成的任务，并在正式采集数据前给予其练习力量测试的机会。若受试者未能充分熟悉这些操作，可能在肌肉损伤诱导后的数天内表现出学习效应，这会成为一个混杂变量，导致力量测量结果无效。图5展示了一位可能未充分熟悉流程的受试者的数据。该受试者表现出力量逐渐增加的趋势，这可能是由于在实验过程中不断学习所致，尽管其接受了造成肌肉损伤的运动。其次，受试者人群的选择对该实验方案也可能至关重要。运动性肌肉损伤的程度在不同个体之间可能存在显著差异，这取决于多种因素，包括个体的训练状态。习惯于离心运动的个体所表现出的肌肉损伤程度通常远低于不习惯此类运动的个体。因此，在选择受试者人群时，这一点可能是重要的考虑因素。如果研究者希望观察到明显的肌肉损伤反应，则应选择不习惯离心运动的人群，以最有可能获得预期结果。最后，在多次测试过程中，受试者在测力计上的体位必须保持一致。研究人员应记录每位受试者在测力计上各个可调节部件的位置设置，并在每次随访测试时准确复现该体位。这将最大限度地减少因姿势差异引起的数据变...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
博德克斯动力计Biodex Medical Systems850-000其他型号也可使用，且应产生相似结果
肌酸激酶检测试剂盒Sigma-Aldrich MAK116
血清分离真空采血管BD Bioscience367812
带翼安全推钮式采血套装BD Bioscience367338
冷冻保存管Sigma-AldrichV5007我们使用 2 ml 的保存管来储存血清分装样品

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