利用重组古菌蛋白酶体和非变性PAGE分析蛋白酶体组装：整合方法的必要性

摘要

本方案采用亚基共表达和裂解后亚基混合两种方法，以更全面地研究重组蛋白酶体的组装过程。

摘要

蛋白酶体存在于所有生命域中。在真核生物中，它们是细胞内蛋白质降解的主要途径，但其组装过程尚未被完全阐明。所有蛋白酶体都包含一个结构保守的核心颗粒（CP），即20S蛋白酶体，其结构由两个七聚体的β亚基环夹在两个七聚体的α亚基环之间构成。与真核生物的对应物相比，古菌20S蛋白酶体在组成上更为简单，但两者共享一种共同的组装机制。因此，古菌20S蛋白酶体仍然是研究真核蛋白酶体组装的重要模型。具体而言，通过重组表达古菌20S蛋白酶体并结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），已为理解蛋白酶体的生物发生提供了许多重要见解。本文中，我们探讨了一种改进常规共表达策略的方法，该策略用于在进行非变性PAGE前共表达古菌蛋白酶体的α和β亚基。我们证明，尽管共表达方法快速且高效，但单独使用该方法可能遗漏关键的组装中间体。以蛋白酶体为例，仅靠共表达可能无法检测到“半蛋白酶体”这一中间体，该中间体包含一个完整的α环和一个完整的β环。然而，通过裂解液混合的方法可轻易检测到该中间体。我们建议，将共表达与裂解液混合相结合，可提供一种更为全面且劳动强度较低的组装分析方法。该方法可能也适用于其他重组多蛋白复合物的研究。

引言

多蛋白复合物执行多种关键的细胞活动¹。对于其中许多复合物而言，其结构与功能的研究远比其组装过程更为深入^2,3。蛋白酶体便是其中之一，存在于所有生命域中。在真核生物中，这一分子机器是泛素/蛋白酶体系统（UPS）的核心，介导细胞内蛋白质降解的主要途径⁴。真核生物的蛋白酶体（称为26S蛋白酶体）由两个主要亚复合物组成：一个20S蛋白酶体，即核心颗粒（CP）⁵，其一端或两端可结合19S调节颗粒（RP）⁶。

20S 蛋白酶体 是一种大型区室化蛋白酶。其四级结构在所有生命域中均完全保守，由四个七聚环堆叠而成，包含两种结构相关的亚基类型，即 α 和 β^5,7,8。在真核生物中，两个外环各自由七种不同的 α 亚基组成，两个内环各自由七种不同的 β 亚基组成；其中三种 β 亚基具有蛋白水解活性。相比之下，古菌和细菌的 CP 环通常仅由一种类型的 α 亚基和一种类型的 β 亚基组成。由于古菌蛋白酶体组成简单，并且与其真核同源物共享相同的组装机制，因此已成为研究蛋白酶体组装的重要模型系统^9-13。简而言之，α 亚基首先组装成 α 环，作为 β 亚基组装的支架。形成的半蛋白酶体（α₇β₇）发生二聚化，生成完全组装的 CP（α₇β₇β₇

方案

1. 细菌表达。

注意：本研究中使用的表达质粒详见表1。本研究中使用的溶液、培养基和缓冲液详见表2。古菌蛋白酶体亚基基因的克隆及表达质粒的构建方法已在其他文献中描述^18,20。简而言之，用于亚基共表达的质粒采用双顺反子操纵子策略，有助于获得各亚基相近的表达水平^18,20。下所列的表达参数是经实验确定对本研究中的蛋白酶体亚基最为适宜的条件。对于其他蛋白酶体突变体、来自其他古菌物种的蛋白酶体，或其他重组蛋白复合物，可能需要优化表达条件（见讨论部分）。

1. 将目标表达质粒转化至化学感受态细胞中 E.coli BL21(DE3) 细胞
2. 加入 1 - 2 μL 质粒（通常为 50 - 100 ng）加入至一份 DE3 中 在冰上 freshly thawed 的细胞，并继续在冰上孵育 20 分钟。
3. 将细胞在 42 °C 下热激 45 秒，然后将离心管放回冰上继续冰浴 2 分钟。
4. 加入1 mL LB培养基，37 °C振荡培养（150 rpm）1小时。
5. 铺加 100 - 200 μL 将转化混合物涂布于LB-kan平板（含固体LB培养基并添加卡那霉素的平板，本研究中使用的所有质粒均编码对该抗生素的抗性....

结果

蛋白酶体的组装（图1）始于α亚基结合形成环状结构⁹。这一过程可通过在大肠杆菌（E. coli）中表达嗜热古菌Methanococcus maripaludis S2的C末端六组氨酸标签（his标签）α亚基来说明（表1）。当通过ICAR方法纯化重组α-his蛋白并进行非变性PAGE分析时，观察到两条条带（图2A，第1泳道）。我们先前已证实，这两条条带分别对应单α环（SR）和双α环（DR）¹⁸。其中，DR是一种无法进一步参与后续组装的终末产物^9,18。

当α-his亚基与β亚基共表达时（这是检测重组古菌蛋白酶体组装的常用方法），观察到一种新型物种，其迁移位置接近670 kDa大小标准（图2A，第3泳道）。该物种具有蛋白水解活性（图2B，第3泳道），且仅包含前肽已被完全切除的成熟β亚基（mβ）（图2C

讨论

我们通过使用重组古菌蛋白酶体进行非变性PAGE分析，展示了研究蛋白酶体组装的联合方法的优势。通常采用的细菌共表达蛋白酶体亚基的方法^9,11虽可实现快速分析，但可能无法揭示关键的组装中间体。我们建议将共表达与裂解液混合相结合，以更全面地揭示组装过程中的事件。

这种联合方法的优势在于，尽管需要分别表达α和β亚基以进行裂解液混合，但整体操作仍然相对简便。如果能够确保各个蛋白的表达水平具有可比性且保持一致，则结果还可以实现半定量。为此，我们建议对重组蛋白表达进行常规优化，以确定在裂解液混合前能使各蛋白表达量相当的条件。优化可包括调整诱导时间、诱导温度、诱导时的光密度、细菌表达菌株等因素，直至获得理想水平的可溶性蛋白。在比较蛋白质的野生型与突变体版本时，这一步骤尤为重要，因为有时突变体可能表达水平相当，但可溶性降低。我们还强调在上样进行非变性PAGE前，必须测定ICAR纯化样品的蛋白浓度。即使已进行了表达优化，并且在纯化过程中尽可能确保平行样品处理方式一致，仍可能无意中引入差异。通过浓度测定可确保每个样品孔中加载的总蛋白量相同，从而使同一迁移条带在不同泳道间的强度比较更.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺（40%）溶液	Biorad	1610104	未聚合的丙烯酰胺是一种神经毒素。请佩戴适当的防护装备
Amicon ultra 0.5 mL 离心过滤器	EMDMillipore	UFC501024
过硫酸铵	Sigma	A3678
ATP	Sigma	A7699
BCA 检测试剂盒	Pierce	23225
双丙烯酰胺（2%）溶液	Biorad	1610142
溴酚蓝	Sigma	B8026
DNaseI	Sigma	DN25
二硫苏糖醇（DTT）	Thermo Fisher	BP172
E. coli BL21 感受态细胞	EMD Millipore	69450
GelCode Blue	Thermo Fisher	24592	胶体考马斯亮蓝染色试剂，用于凝胶染色
Gel doc EZ 系统	Biorad	1708270	凝胶成像系统
凝胶分离器	Biorad	1653320	楔形塑料工具，用于分离凝胶板；有助于液体均匀铺展
玻璃棒	Thermo Fisher	11-380B
甘油	Sigma	49767
甘氨酸	Thermo Fisher	BP3865
Hamilton 注射器	Thermo Fisher	14-813-38	用于上样凝胶的玻璃注射器
HEPES	US Biologicals	H2010
HMW Native 校准试剂盒	GE Healthcare	170445-01	高分子量蛋白质标准品
Hoefer SG30	Thermo Fisher	03-500-277	梯度生成器
咪唑	US Biologicals	280671
IPTG	US Biologicals	I8500	用于诱导蛋白表达
异丙醇	Thermo Fisher	BP26181
硫酸卡那霉素	US Biologicals	K0010
溶菌酶	Sigma	L6876
MgCl2	Fluka analytical	630680
Mini Protean Tetra Cell	Biorad	1658002EDU	凝胶电泳装置
NaCl	Thermo Fisher	S640-3
NaOH	Thermo Fisher	S318-1
Pefabloc SC	Roche	11429876001	蛋白酶抑制剂
pET42	EMD Millipore	70562	表达质粒
Precision plus 全蓝标准品	Biorad	1610373	SDS-PAGE 用分子量蛋白标准品
Quickchange 定点突变试剂盒	Agilent technologies	200521
十二烷基硫酸钠（SDS）	Thermo Fisher	BP166
Suc-LLVY-AMC	Enzo lifesciences	BML P802-0005	荧光底物
Talon 金属亲和树脂	Clontech	635502	固定化钴亲和树脂
TEMED	Sigma	T7024
Tris	US Biologicals	T8600
吐温-100	Sigma	93426
胰蛋白胨	Bacto BD	211699
UV 样品托盘	Biorad	1708271	用于凝胶的紫外成像
酵母提取物	Bacto BD	212720