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方法文章

利用重组古菌蛋白酶体和非变性PAGE分析蛋白酶体组装：整合方法的必要性

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DOI：

10.3791/54860

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2016年12月17日

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

本文内容

摘要

本方案采用亚基共表达和裂解后亚基混合两种方法，以更全面地研究重组蛋白酶体的组装过程。

摘要

蛋白酶体存在于所有生命域中。在真核生物中，它们是细胞内蛋白质降解的主要途径，但其组装过程尚未被完全阐明。所有蛋白酶体都包含一个结构保守的核心颗粒（CP），即20S蛋白酶体，其结构由两个七聚体的β亚基环夹在两个七聚体的α亚基环之间构成。与真核生物的对应物相比，古菌20S蛋白酶体在组成上更为简单，但两者共享一种共同的组装机制。因此，古菌20S蛋白酶体仍然是研究真核蛋白酶体组装的重要模型。具体而言，通过重组表达古菌20S蛋白酶体并结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），已为理解蛋白酶体的生物发生提供了许多重要见解。本文中，我们探讨了一种改进常规共表达策略的方法，该策略用于在进行非变性PAGE前共表达古菌蛋白酶体的α和β亚基。我们证明，尽管共表达方法快速且高效，但单独使用该方法可能遗漏关键的组装中间体。以蛋白酶体为例，仅靠共表达可能无法检测到“半蛋白酶体”这一中间体，该中间体包含一个完整的α环和一个完整的β环。然而，通过裂解液混合的方法可轻易检测到该中间体。我们建议，将共表达与裂解液混合相结合，可提供一种更为全面且劳动强度较低的组装分析方法。该方法可能也适用于其他重组多蛋白复合物的研究。

引言

多蛋白复合物执行多种关键的细胞活动1。对于其中许多复合物而言，其结构与功能的研究远比其组装过程更为深入2,3。蛋白酶体便是其中之一，存在于所有生命域中。在真核生物中，这一分子机器是泛素/蛋白酶体系统（UPS）的核心，介导细胞内蛋白质降解的主要途径4。真核生物的蛋白酶体（称为26S蛋白酶体）由两个主要亚复合物组成：一个20S蛋白酶体，即核心颗粒（CP）5，其一端或两端可结合19S调节颗粒（RP）6。

20S 蛋白酶体 是一种大型区室化蛋白酶。其四级结构在所有生命域中均完全保守，由四个七聚环堆叠而成，包含两种结构相关的亚基类型，即 α 和 β5,7,8。在真核生物中，两个外环各自由七种不同的 α 亚基组成，两个内环各自由七种不同的 β 亚基组成；其中三种 β 亚基具有蛋白水解活性。相比之下，古菌和细菌的 CP 环通常仅由一种类型的 α 亚基和一种类型的 β 亚基组成。由于古菌蛋白酶体组成简单，并且与其真核同源物共享相同的组装机制，因此已成为研究蛋白酶体组装的重要模型系统9-13。简而言之，α 亚基首先组装成 α 环，作为 β 亚基组装的支架。形成的半蛋白酶体（α7β7）发生二聚化，生成完全组装的 CP（α7β7β7α7）。在二聚化过程中，β 亚基上的前肽通过自催化方式被切除，暴露出催化性的 N 端苏氨酸。利用古菌蛋白酶体模拟组装过程时，通常借助在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达重组古菌蛋白酶体蛋白。这一方法具有重要意义，因为它能够在不自身产生蛋白酶体的宿主中，以野生型和突变型形式，灵活地组合表达各种亚基。

监测多蛋白复合物的生化组装过程需要某种分级分离方法，以将完全组装的复合物与组装中间体及前体分离开。由于具有优异的分辨能力，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）已被证明在多种大型多蛋白复合物的分级分离中尤为有效14-17重组古菌蛋白酶体的表达与非变性PAGE相结合，已成为解析蛋白酶体组装过程的有力方法9,11,12,18。然而，该方法通常的应用方式（即通过α和β亚基的重组共表达）存在一个重要缺陷：组装反应具有协同性，且强烈依赖于浓度3. 鉴于细胞内的蛋白质浓度非常高19由于排除体积效应，组装反应迅速进行 体内因此，当α和β亚基共表达时，可能会遗漏重要的组装中间体。

本文提出了一种结合使用重组古菌蛋白酶体亚基研究蛋白酶体组装的综合方法。该方法同时采用共表达和裂解液混合两种策略。前者因操作简便、耗时较少，可实现对组装过程的快速分析；后者则依赖于α和β亚基的分别表达，随后进行混合。尽管此方法比共表达略为繁琐，但其优势在于能够检测到共表达过程中被忽略的中间产物。这两种方法相结合，可更全面地揭示蛋白酶体的组装过程。

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方案

1. 细菌表达。

注意：本研究中使用的表达质粒详见表1。本研究中使用的溶液、培养基和缓冲液详见表2。古菌蛋白酶体亚基基因的克隆及表达质粒的构建方法已在其他文献中描述18,20。简而言之，用于亚基共表达的质粒采用双顺反子操纵子策略，有助于获得各亚基相近的表达水平18,20。下所列的表达参数是经实验确定对本研究中的蛋白酶体亚基最为适宜的条件。对于其他蛋白酶体突变体、来自其他古菌物种的蛋白酶体，或其他重组蛋白复合物，可能需要优化表达条件（见讨论部分）。

  1. 将目标表达质粒转化至化学感受态细胞中 E.coli BL21(DE3) 细胞
  2. 加入 1 - 2 μL 质粒（通常为 50 - 100 ng）加入至一份 DE3 中 在冰上 freshly thawed 的细胞，并继续在冰上孵育 20 分钟。
  3. 将细胞在 42 °C 下热激 45 秒，然后将离心管放回冰上继续冰浴 2 分钟。
  4. 加入1 mL LB培养基，37 °C振荡培养（150 rpm）1小时。
  5. 铺加 100 - 200 μL 将转化混合物涂布于LB-kan平板（含固体LB培养基并添加卡那霉素的平板，本研究中使用的所有质粒均编码对该抗生素的抗性）上，37 °C过夜培养。
  6. 次日早晨，从LB-kan平板上挑取单菌落，接种于玻璃培养管中的3 mL液体LB-kan培养基中。37 ºC、150 rpm振荡培养约2.5–3小时，或培养至观察到培养基变浑浊。
  7. 在600 nm处测定培养物的光密度（OD）600) 在分光光度计中测定。用适量预热的LB-kan培养基将细胞培养液稀释至OD600 在最终体积为6 mL时，OD600达到0.4。在37 ºC下继续振荡40分钟。
  8. 通过加入IPTG母液至终浓度为1 mM，诱导液体培养物中的蛋白表达。在37 ºC、150 rpm振荡条件下孵育约6 - 7小时。
  9. 将整个细菌培养物收集至 1.5 mL 离心管中 微量离心管
  10. 加入 1.5 mL 将培养物转移至微量离心管中。在10,000 × g 1 分钟。
  11. 弃去上清液，再加入 1.5 mL 将同一批培养物加入沉淀中。在10,000 × g 1 分钟。
  12. 重复步骤 1.11，直至将全部培养物收获至微量离心管中。
  13. 将诱导后的菌体沉淀于 -80 °C 保存，直至裂解。

2. 细菌裂解与裂解液混合。

注意： 对于通过共表达研究的样品，请遵循第2.1节（及其子章节）。对于需要裂解液混合的样品，请遵循第2.2节（及其子章节）。本方案中包含的TSP（总蛋白、可溶性蛋白、沉淀）分析有助于优化蛋白表达，从而确保在裂解液混合过程中α和β亚基能够以大致相等的量进行结合（见讨论部分）。如果下游实验结果与预期不符，该分析也可提供重要的对照依据。即 它可验证蛋白是否表达且可溶。因此，我们强烈建议在初期包含TSP分析。一旦针对特定亚基组合建立了最佳方案，TSP分析便非必需，因此下文将其描述为可选步骤。

  1. 细菌细胞裂解及可溶性组分的制备。
    1. 将诱导后的细胞沉淀置于冰上解冻5分钟，用600 µL 裂解缓冲液重悬沉淀。
    2. 将悬液在30 ºC下振荡孵育30分钟（150 rpm），以制备总粗裂解液。
      注意： 下一步骤及后续小节为可选步骤。
    3. 从总粗裂解液中取出两份25 μL 等分试样，分别加入两个独立的1.5 mL 微量离心管中，并按以下步骤进行总蛋白（TSP）分析。
      1. 向其中一份25 μL 等分试样中加入5X SDS 上样缓冲液，使其终浓度为1X。将该管标记为"T"，代表"总粗裂解液"。
      2. 将标记为"T"的样品在100 ºC下孵育5分钟，以完全变性蛋白质。
      3. 同时，取另一份25 μL 等分试样，在10,000 × g下离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动微量沉淀，并将其转移至一个新的1.5 mL 微量离心管中。将此新管标记为"S"，代表"可溶性组分"。
      4. 向前述步骤中残留的微量沉淀中加入25 μL 裂解缓冲液，涡旋振荡以重悬沉淀。将该管标记为"P"，代表"沉淀组分"。
      5. 向标记为"S"和"P"的管中各加入6 μL 5X SDS 上样缓冲液，并如上所述在100 ºC下孵育。
        注意： 若当日不立即使用TSP样品进行表达分析，可将其在-20 ºC冷冻保存至需要时使用。解冻后，必须在上样至12%和/或15%标准SDS-PAGE凝胶前，立即按上述方法重新在100 ºC下孵育。
    4. 在进行TSP分析的同时，将剩余的550 μL 总粗裂解液（或若未进行TSP分析，则为全部600 μL 总粗裂解液）在10,000 × g下离心10分钟。将上清液收集至一个新的1.5 mL 微量离心管中。此即用于纯化的可溶性裂解液。
  2. 裂解液混合。
    1. 按照上述步骤2.1.1和2.1.2所述进行裂解。
    2. 将表达目标α亚基的细菌来源的600 µL 总粗裂解液与表达目标β亚基的细菌来源的600 µL 总粗裂解液混合，在37 ºC下缓慢振荡孵育30分钟。
      注意： 可能需要优化孵育时间以在裂解液混合过程中实现最大组装效率（见讨论部分）。此处提供的时间和温度适用于本研究中的重组蛋白，且已在其他研究中确定18。
    3. 将混合裂解液在10,000 × g下离心10分钟，以分离可溶性物质与不溶性沉淀。将上清液转移至一个新的1.5 mL 微量离心管中。使用此混合可溶性裂解液进行蛋白质纯化。

3. 通过固定化蛋白纯化 钴亲和树脂（ICAR）

  1. 平衡树脂。
    1. 通过倒置瓶子充分重悬树脂，并将50 µL 浆液转移至1.5 mL 微量离心管中。在700 × g 条件下离心2分钟以沉淀树脂。小心吸除上清液。
      注意：我们使用蓝色1 mL 移液器吸头去除大部分液体，再用白色2 μL 吸头精细控制剩余上清液的移除，仅保留覆盖在珠粒表面的一层极薄液体。
    2. 加入1 mL 缓冲液A。轻轻混匀以重悬树脂，在700 × g 条件下离心2分钟以沉淀树脂。小心吸除上清液，并重复此洗涤步骤一次。
  2. 将之前在第2.1或2.2节中获得的可溶性裂解液加入已平衡的树脂中。在4 ºC条件下轻轻旋转孵育60分钟。将离心管在700 × g 条件下离心5分钟，小心吸除上清液。
  3. 按以下步骤洗涤树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。
    1. 用1 mL 缓冲液A重悬树脂，在4 ºC条件下轻轻摇动孵育10分钟。将离心管在700 × g 条件下离心5分钟，小心吸除上清液。重复此洗涤步骤一次。
    2. 用1 mL 缓冲液B（含5 mM咪唑的缓冲液A）重悬树脂，在4 ºC条件下轻轻摇动孵育5分钟。将离心管在700 × g 条件下离心5分钟，小心吸除上清液。重复此洗涤步骤一次。
    3. 用1 mL 缓冲液C（含10 mM咪唑的缓冲液A）重悬树脂，在4 ºC条件下轻轻摇动孵育5分钟。将离心管在700 × g 条件下离心5分钟，小心吸除上清液。
  4. 向树脂中加入400 µL洗脱缓冲液E（含200 mM咪唑的缓冲液A）以洗脱目标蛋白。在4 ºC条件下轻轻摇动孵育5分钟。在700 × g 条件下离心5分钟。
  5. 将含有纯化蛋白的上清液转移至新的1.5 mL 离心管中。
  6. 通过连续离心法对纯化蛋白进行脱盐处理，步骤如下。
    1. 向400 μL 纯化蛋白中加入100 μL 缓冲液A（使咪唑浓度从200 mM降至160 mM）。将纯化蛋白加入截留分子量为10 kDa的0.5 mL 超滤离心管中。在14,000 × g 条件下离心5分钟。
    2. 弃去滤液，向截留物中加入400 μL 缓冲液A进行稀释，再次离心。重复离心/稀释循环，直至咪唑浓度降至4 mM以下。例如，若每次离心将500 μL浓缩至约70 μL（约7倍浓缩），则经过两个循环后（7×7 = 49倍稀释），初始160 mM的咪唑浓度可降至约3.3 mM。
    3. 使用BCA法测定脱盐后样品的蛋白浓度21。
      注意：根据试剂生产商说明书，BCA法对咪唑浓度敏感，因此必须进行脱盐处理以将咪唑浓度降至检测耐受限以下。本实验室偏好使用BCA法，因其灵敏度高、动态范围广，且不同蛋白间的测定差异较小。然而，也可使用其他蛋白浓度测定方法替代BCA法。关键在于了解每种方法的优势与局限性。
  7. 加入5倍浓度的天然上样缓冲液，使其终浓度为1倍，随后进行电泳分析。或者，将样品在-20 ºC保存以备后续分析。

4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

注意：未聚合的丙烯酰胺是一种神经毒素。请佩戴适当的防护装备。

  1. 按以下步骤制备非变性PAGE凝胶：
    1. 使用洁净的玻璃板和制胶架组装凝胶模具。将梯度混合器置于小型磁力搅拌器上方，并在每个腔室中放入一根微型搅拌子。
    2. 使用40% (w/v) 丙烯酰胺和2% (w/v) 双丙烯酰胺储备液，在天然分离缓冲液中配制5%和10% (w/v) 的丙烯酰胺凝胶溶液。确保总丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例为37.5:1。灌胶前将溶液置于冰上预冷。
      注意： 此处使用的非变性PAGE系统与Laemmli SDS-PAGE系统基本相同，仅省略了SDS22。
    3. 向丙烯酰胺溶液中加入过硫酸铵（使用水中配制的10% (w/v) 储备液），以启动聚合反应。过硫酸铵的终浓度为0.1% (w/v)。
    4. 将丙烯酰胺溶液分别倒入梯度混合器的两个腔室中。将出口管插入凝胶模具的玻璃板之间，启动磁力搅拌器并打开梯度混合器的阀门，灌注5–10%非变性梯度凝胶。
    5. 灌胶完成后，在凝胶表面覆盖一层薄薄的异丙醇，并让凝胶在室温下聚合30分钟。在此期间，用天然分离缓冲液新鲜配制5%丙烯酰胺凝胶溶液。凝胶聚合完成后，倾去异丙醇，并用洗瓶中的去离子水冲洗凝胶顶部。
    6. 向上述配制的5%凝胶溶液中加入过硫酸铵（具体操作同步骤4.1.3），然后将其倒入已聚合的凝胶上方，直至充满玻璃板间隙。插入梳子。让上层凝胶继续聚合30分钟。
    7. 凝胶完全聚合后，将凝胶模具安装至电泳装置中。或者，可将凝胶用湿润的纸巾和塑料膜包裹后，于4 ºC保存，待后续使用。
  2. 将非变性PAGE凝胶安装至电泳装置后，向电泳槽中加入新鲜稀释的1X天然电泳缓冲液（由10X天然电泳缓冲液储备液稀释而成）。
  3. 使用玻璃注射器，将第3部分末尾获得的纯化蛋白各10 μg上样至每个加样孔中。
  4. 取2 μL 高分子量天然蛋白标准品（用1X天然电泳缓冲液稀释）上样至其中一个加样孔中。
  5. 在55 V、4 ºC条件下电泳，直至染料前沿跑出凝胶（约4–4.5小时）。
  6. 除非变性凝胶外，还需通过标准SDS-PAGE22分析第3部分末尾获得的纯化蛋白等分试样：
    1. 取纯化蛋白样品等分试样（10 μg），与5X SDS上样缓冲液混合，使终浓度为1X。
    2. 在100 ºC孵育5分钟，然后上样至标准的12%和/或15% SDS-PAGE凝胶22。
    3. 先以80 V电泳20分钟，然后调至120 V继续电泳，直至染料前沿跑出凝胶（对于12%凝胶约需额外75分钟，15%凝胶约需120分钟）。

5. 活性与蛋白质染色的可视化。

  1. 电泳结束后，小心分离玻璃板，将非变性凝胶转移至含有 50 mL 去离子水的凝胶托盘中。轻轻振荡洗涤 5 分钟。弃去水，重复此洗涤步骤三次。
  2. 进行底物覆盖检测，步骤如下：
    1. 加入 1 mL 含有荧光肽底物 Suc-LLVY-AMC 的显色缓冲液，均匀覆盖凝胶表面。37 ºC 孵育 30 分钟。
      注意：可使用玻璃棒或凝胶分离器（用于分离玻璃板的小型塑料楔形工具）将液体均匀铺展在凝胶上。
    2. 小心将凝胶转移至凝胶成像系统的紫外透射仪上，观察因肽底物被切割而产生的荧光信号。记录图像。随后小心将凝胶移回凝胶托盘中。
    3. 用 50 mL 去离子水轻轻振荡洗涤凝胶两次，每次 5 分钟。
    4. 用 10 mL 胶体考马斯亮蓝染色试剂轻轻振荡染色 60 分钟。用 50 mL 水脱色至背景清晰。该染色步骤同样适用于标准 SDS-PAGE 凝胶。

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结果

蛋白酶体的组装（图1）始于α亚基结合形成环状结构9。这一过程可通过在大肠杆菌（E. coli）中表达嗜热古菌Methanococcus maripaludis S2的C末端六组氨酸标签（his标签）α亚基来说明（表1）。当通过ICAR方法纯化重组α-his蛋白并进行非变性PAGE分析时，观察到两条条带（图2A，第1泳道）。我们先前已证实，这两条条带分别对应单α环（SR）和双α环（DR）18。其中，DR是一种无法进一步参与后续组装的终末产物9,18。

当α-his亚基与β亚基共表达时（这是检测重组古菌蛋白酶体组装的常用方法），观察到一种新型物种，其迁移位置接近670 kDa大小标准（图2A，第3泳道）。该物种具有蛋白水解活性（图2B，第3泳道），且仅包含前肽已被完全切除的成熟β亚基（mβ）（图2C

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讨论

我们通过使用重组古菌蛋白酶体进行非变性PAGE分析，展示了研究蛋白酶体组装的联合方法的优势。通常采用的细菌共表达蛋白酶体亚基的方法9,11虽可实现快速分析，但可能无法揭示关键的组装中间体。我们建议将共表达与裂解液混合相结合，以更全面地揭示组装过程中的事件。

这种联合方法的优势在于，尽管需要分别表达α和β亚基以进行裂解液混合，但整体操作仍然相对简便。如果能够确保各个蛋白的表达水平具有可比性且保持一致，则结果还可以实现半定量。为此，我们建议对重组蛋白表达进行常规优化，以确定在裂解液混合前能使各蛋白表达量相当的条件。优化可包括调整诱导时间、诱导温度、诱导时的光密度、细菌表达菌株等因素，直至获得理想水平的可溶性蛋白。在比较蛋白质的野生型与突变体版本时，这一步骤尤为重要，因为有时突变体可能表达水平相当，但可溶性降低。我们还强调在上样进行非变性PAGE前，必须测定ICAR纯化样品的蛋白浓度。即使已进行了表达优化，并且在纯化过程中尽可能确保平行样品处理方式一致，仍可能无意中引入差异。通过浓度测定可确保每个样品孔中加载的总蛋白量相同，从而使同一迁移条带在不同泳道间的强度比较更...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由印第安纳大学-普渡大学印第安纳波利斯分校的研究支持基金拨款（RSFG）资助，部分由美国心脏协会授予 A.R.K. 的奖项（14GRNT20390154）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺（40%）溶液Biorad1610104未聚合的丙烯酰胺是一种神经毒素。请佩戴适当的防护装备
Amicon ultra 0.5 mL 离心过滤器EMDMilliporeUFC501024
过硫酸铵SigmaA3678
ATPSigmaA7699
BCA 检测试剂盒Pierce23225
双丙烯酰胺（2%）溶液Biorad1610142
溴酚蓝SigmaB8026
DNaseISigmaDN25
二硫苏糖醇（DTT）Thermo FisherBP172
E. coli BL21 感受态细胞EMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592胶体考马斯亮蓝染色试剂，用于凝胶染色
Gel doc EZ 系统Biorad1708270凝胶成像系统
凝胶分离器Biorad1653320楔形塑料工具，用于分离凝胶板；有助于液体均匀铺展
玻璃棒Thermo Fisher11-380B
甘油Sigma49767
甘氨酸Thermo FisherBP3865
Hamilton 注射器Thermo Fisher14-813-38用于上样凝胶的玻璃注射器
HEPESUS BiologicalsH2010
HMW Native 校准试剂盒GE Healthcare170445-01高分子量蛋白质标准品
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277梯度生成器
咪唑US Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500用于诱导蛋白表达
异丙醇Thermo FisherBP26181
硫酸卡那霉素US BiologicalsK0010
溶菌酶SigmaL6876
MgCl2Fluka analytical630680
Mini Protean Tetra CellBiorad1658002EDU凝胶电泳装置
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRoche11429876001蛋白酶抑制剂
pET42EMD Millipore70562表达质粒
Precision plus 全蓝标准品Biorad1610373SDS-PAGE 用分子量蛋白标准品
Quickchange 定点突变试剂盒Agilent technologies200521
十二烷基硫酸钠（SDS）Thermo FisherBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005荧光底物
Talon 金属亲和树脂Clontech635502固定化钴亲和树脂
TEMEDSigmaT7024
TrisUS BiologicalsT8600
吐温-100Sigma93426
胰蛋白胨Bacto BD211699
UV 样品托盘Biorad1708271用于凝胶的紫外成像
酵母提取物Bacto BD212720

参考文献

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