一种优化的协议电泳迁移分析使用红外荧光染料标记的寡核苷酸

Summary

我们在这里描述使用纯化SOX-2蛋白与红外荧光染料标记的DNA探针作为案例研究解决的重要生物学问题一起荧光电泳迁移实验（FEMSA）的优化方案。

Abstract

电泳迁移率变动分析（EMSA）为表征的蛋白质和它们的靶DNA序列之间的相互作用的仪器工具。放射性已经在EMSAs DNA标记的主要方法。然而，最近在荧光染料和扫描方法的进步促使使用的DNA的荧光标记的作为替代的放射性为容易处理的优点，节省时间，降低成本，并提高安全性。我们最近使用的荧光EMSA（FEMSA）成功地解决一个重要的生物学问题。我们FEMSA分析提供机械洞察的错义突变，G73E的效果，在高度保守的HMG转录因子SOX-2上嗅神经元类型多样化。我们发现，突变的SOX-2蛋白^G73E具体改变DNA结合活性，从而导致嗅觉神经元的身份转换。这里，我们提出一种优化和成本效益的一步一步协议使用FEMSA含有作为生物例如LIM-4 / SOX-2的相邻目标站点和纯化的SOX-2蛋白（WT和突变体SOX-2 ^G73E蛋白）红外荧光染料标记的寡核苷酸。

Introduction

EMSAs用于通过使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），以解决感兴趣的蛋白和含有该蛋白¹的潜在目标位点的标记的DNA探针的混合物，以分析DNA和蛋白质之间的相互作用。与蛋白结合的DNA探针将与自由DNA探针下迁移较慢进行比较，因此在通过聚丙烯酰胺基质其迁移延迟。通过³² p的DNA的放射性标记已经用于检测EMSAs的主要方法。虽然放射性标记的生化研究中的应用一直是有益的，可替代DNA标记的具有可比性的灵敏度方法正在使用由于与处理放射性有关的健康和安全风险。这些替代方法包括用生物素²或洋地黄毒苷^{（DIG）3（}两者都然后通过化学发光系统检测）的DNA的共轭，所述PAGE凝胶⁴的SYBR绿染色，或通过扫描凝胶^5,6直接检测DNA的荧光染料结合物。

用放射性标记的DNA探针EMSAs的解决凝胶需要通过放射自显影胶片或磷光系统检测到的放射性信号^1,7后运行处理。使用生物素²或地高辛共轭³ DNA探针EMSAs的凝胶还必须处理并转移到合适的膜，然后通过化学发光⁶检测。凝胶的SYBR绿染色需要后运行凝胶染色和荧光扫描器^4。因为需要使用这些DNA标记技术EMSAs后运行凝胶处理步骤，解析的凝胶可仅一次测定。与此相反，标有荧光团的DNA探针，可以直接在....

Protocol

注:使用荧光标记的DNA探针或其它形式的标记的DNA的EMSAs分担蛋白或细胞提取物制备，蛋白质-DNA结合反应，和PAGE凝胶制备和运行（ 图1A）相同的协议。关键的区别是DNA标记程序，运行后的凝胶处理步骤和检测方法。

1.凝胶制备

1. 制备含有0.5×TBE（45毫摩尔Tris-硼酸，1mM EDTA中）和2.5％甘油5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用微型蛋白凝胶系统（8.3厘米宽×7.3厘米长×0.75毫米厚）。
   1. 制备30毫升凝胶溶液4凝胶，混合5毫升30％丙烯酰胺/双（37.5:1），3 5×TBE（0.45M的Tris-硼酸，10mM EDTA的），1.5毫升50％甘油的溶液， 300微升10％过硫酸铵，TEMED 15μL，20.2毫升DDH ₂ O的彻底。
      注:丙烯酰胺是有毒有害，配备适当的个人防护设备处理。
2. 立即施放凝胶溶液。聚合后，敷在凝胶的透明塑料包装预先润湿0.5X TBE，并将它们存储在4℃。

2.红外线荧光染料标记的探针的制备

注:在制备，储存和实验保持红外荧光色素标记寡核苷酸从光尽可能远。

1. 设计和秩序的寡核苷酸。
   1. 设计长寡核苷酸〜51聚体。
      注:LIM-4 / SOX-2探头的长链寡核苷酸序列是TATCATATCTATTCTA....

Results

橙G样染料（6×0.12橙G在100毫升30％甘油）可被加入到结合反应装载前形象化电泳的进度。其它加载染料包括溴酚蓝将在扫描过程中检测到的，因此，用图像分析（ 图1B）产生干扰。

在EMSAs的一些情况下，尤其是当使用核提取物制剂，聚deoxyinosinic-脱氧胞苷（DI-DC）被包括在结合反应以降低蛋白质的非特异性结合的DNA ^11。然而，二-DC的50微克/毫升废除纯化的6xHis-SOX-2 5'Dye DNA探针（ 图1B）的结合。

以显示红外荧光染料标记的DNA探针的结合特异性，我们用野生型或突变冷探针作为竞争对手（ G73E（ 图1C，泳道3-6 VS

Discussion

fEMSAs是调查蛋白-DNA相互作用的有效工具，并且是对DNA的放射性标记的替代方案。荧光染料诸如红外染料可商购的，并与放射性DNA标记提供更安全和更环境友好的方法。使用红外荧光染料标记的寡核苷酸EMSAs不需要后运行凝胶处理步骤，因此，节省时间和成本相对于其它DNA标记技术。的时间来检测使用放射性EMSAs频带的范围可以从30分钟至数天，这取决于测试¹的DNA探针的放射性和浓度。与此相反，FEMSA凝胶扫描平均需要25分钟，从而显著减少协议的时间。 fEMSAs还提供一个显著优于放射性标记，作为凝胶不必从用于分析玻璃板除去。这使得凝胶重新扫描，如果在初始运行时间是不充分解决蛋白质-DNA复合物。延长电泳的选项，使用放射性同位素或生物素/链不可用。最重要的是，处理放射性物质造成了安全风险实验室人员，而DNA探针的荧光标记是不危险的，并且可以容易地处置。使用链霉亲和的也需要较长的时间，直到检测（约3小时^）12。该协议这里提出的结果表明，FEMSA是生物医学研究的有效和方便的工具。我们已经成功地使用FEMSA提供机械洞察SOX-2突变^G73E具体的DNA结合活性，导致嗅觉.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% 丙烯酰胺/双溶液，37.5：1	Bio-Rad	1610158	丙烯酰胺有害且有毒。
6x-His 表位标签抗体 （HIS.H8）	ThermoFisher	MA1-21315
抗 Flag M2 抗体	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
牛血清白蛋白 （BSA） 分子生物学级	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700 标记的 DNA 寡核苷酸	集成 DNA	技术 定制 DNA 寡核苷酸	这些在手稿中被称为"5'染料标记或红外荧光染料标记的 DNA 寡核苷酸"。该公司将定制合成 5' IRDye 标记的 DNA 寡核苷酸。至少需要 100 μM 级合成和 HPLC 纯化。
Klenow片段（3'-->5'外泌-）	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly （dI-dC）	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN 垂直电泳槽	Bio-Rad	1658000FC	这在手稿中被称为"微型蛋白质凝胶系统"。任何电泳系统都可以使用，只要它们是尺寸小于 25 cm x 25 cm 的透明玻璃板。
Odyssey CLx 红外成像系统	LI-COR 生物技术	Odyssey CLx 红外成像系统	这在手稿中被称为"高级红外成像系统"。
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc 双模式成像系统	这在手稿中被称为"主要用于蛋白质印迹的近红外荧光成像系统"。
Image Studio 软件 （版本 4.0）	LI-COR Biotechnology	Image Studio 软件	这在手稿中被称为"特定成像软件"。
橙 G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x 橙上样染料			0.25% 橙 G;30% 甘油
0.5x TBE			45 mM Tris-硼酸盐;1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl，pH 8.0;1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl;10 mM Tris-HCl，pH 8.0;1 mM EDTA
5x 结合缓冲液			50 mM Tris-HCl，pH 7.5;50 毫米氯化钠;200 毫米氯化钾;5 毫米 MgCl2;5 mM EDTA，pH 值 8.0;5 毫米 DTT;250 μ克/毫升 BSA