使用红外荧光染料标记寡核苷酸的电泳迁移率 shift 实验优化方案

摘要

本文以纯化的SOX-2蛋白与红外荧光染料标记的DNA探针为例，介绍了一种优化的荧光电泳迁移率变动分析（fEMSA）实验方案，用于解决一个重要生物学问题。

摘要

电泳迁移率变动分析（EMSA）是用于表征蛋白质与其靶DNA序列相互作用的重要工具。在EMSA中，放射性标记一直是DNA标记的主要方法。然而，近年来荧光染料和扫描技术的进步促使荧光标记DNA逐渐成为替代放射性的可行方案，其优势在于操作简便、节省时间、降低成本并提高安全性。我们近期成功应用荧光EMSA（fEMSA）解决了一个重要的生物学问题。我们的fEMSA分析揭示了高度保守的HMG转录因子SOX-2中错义突变G73E对嗅觉神经元类型多样化的影响机制。我们发现，突变型SOX-2^G73E蛋白改变了其特异性DNA结合活性，从而导致嗅觉神经元身份的转变。在此，我们以含有LIM-4/SOX-2相邻靶位点的红外荧光染料标记寡核苷酸，以及纯化的SOX-2蛋白（野生型和突变型SOX-2^G73E蛋白）作为生物学实例，提供了一套优化且经济高效的fEMSA逐步操作方案。

引言

电泳迁移率变动分析（EMSA）通过使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来分析DNA与蛋白质之间的相互作用，该方法用于分离目标蛋白质与含有潜在蛋白质结合位点的标记DNA探针的混合物¹。与游离的DNA探针相比，与蛋白质结合的DNA探针在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度较慢，因而出现迁移延迟。在EMSA中，³²P放射性标记DNA一直是主要的检测方法。尽管放射性标记在生物化学研究中的应用具有显著优势，但由于操作放射性物质带来的健康与安全风险，目前正越来越多地采用具有相当灵敏度的替代性DNA标记方法。这些替代方法包括将DNA与生物素²或地高辛（DIG）³偶联（两者均通过化学发光系统进行检测）、使用SYBR Green对PAGE凝胶染色⁴，或通过凝胶扫描直接检测DNA-荧光染料偶联物^5,6。

使用放射性标记DNA探针的EMSA凝胶在电泳后需要通过放射自显影胶片或磷屏成像系统来检测放射性信号^1,7。使用生物素²或DIG偶联³ DNA探针的EMSA凝胶也必须经过处理并转移至适当的膜上，再通过化学发光法进行检测⁶。SYBR Green染色则需要电泳后对凝胶进行染色，并使用荧光扫描仪检测⁴。由于上述DNA标记技术在EMSA中均需进行电泳后的凝胶处理步骤，因此分....

方案

注意：使用荧光标记DNA探针或其他形式标记DNA的EMSA实验，在蛋白质或细胞提取物制备、蛋白质-DNA结合反应以及PAGE凝胶制备与电泳步骤上均采用相同方案（图1A）。主要差异在于DNA标记程序、电泳后凝胶的处理步骤以及检测方法。

1. 凝胶制备

1. 使用微型蛋白凝胶系统（8.3 cm 宽 × 7.3 cm 长 × 0.75 mm 厚）制备含有 0.5× TBE（45 mM Tris-硼酸盐，1 mM EDTA）和 2.5% 甘油的 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶。
   1. 为制备 4 块凝胶所需的 30 mL 凝胶溶液，充分混合以下组分：5 mL 30% 丙烯酰胺/Bis（37.5:1）、3 mL 5× TBE（0.45 M Tris-硼酸盐，10 mM EDTA）、1.5 mL 50% 甘油、300 µL 10% 过硫酸铵、15 µL TEMED 以及 20.2 mL ddH₂O。
      注意：丙烯酰胺具有毒性和危害性，操作时需佩戴适当的个人防护装备。
2. 立即灌注凝胶溶液。聚合完成后，用预先用 0.5× TBE 浸润的塑料膜包裹凝胶，并于 4 °C 保存。

2. 红外荧光染料标记探针的制备

注意：在制备、储存和实验过程中，应尽量避免红外荧光染料标记的寡核....

结果

在上样前可将橙G加样染料（6×：0.12 g 橙G溶于100 mL 30%甘油中）加入结合反应体系，以观察电泳的迁移进程。其他加样染料（如溴酚蓝）会在扫描时被检测到，从而干扰图像分析（图1B）。

在某些 EMSA 实验中，尤其是使用核提取物制备时，结合反应中会加入聚脱氧次黄嘌呤-脱氧胞嘧啶酸（dI-dC）以减少蛋白质与 DNA 的非特异性结合¹¹。然而，50 µg/mL 的 dI-dC 会完全抑制纯化的 6xHis-SOX-2 与 5'荧光标记 DNA 探针的结合（图 1B）。

为了验证红外荧光染料标记的DNA探针结合的特异性，我们使用了野生型（WT）或突变型冷探针作为竞争物（图1C）。在此情况下，LIM-4结.......

讨论

荧光凝胶迁移实验（fEMSA）是一种研究蛋白质-DNA相互作用的有效工具，可作为DNA放射性标记的替代方法。市面上有售的荧光染料（如红外染料）相比放射性DNA标记更为安全且更环保。使用红外荧光染料标记的寡核苷酸进行EMSA时，无需电泳后凝胶处理步骤，因此相较于其他DNA标记技术更节省时间和成本。采用放射性EMSA检测条带所需时间可从30分钟到数天不等，具体取决于所用DNA探针的放射性强度和浓度¹。相比之下，fEMSA凝胶扫描平均仅需25分钟，显著缩短了实验周期。fEMSA相较于放射性标记还具有显著优势：分析时无需将凝胶从玻璃板间取出，这使得在初始扫描时间不足、未能充分分辨蛋白质-DNA复合物时，可对凝胶重新扫描。而使用放射性同位素或生物素/链霉亲和素系统则无法延长电泳时间。最重要的是，操作放射性物质对实验室人员存在安全风险，而DNA探针的荧光标记无此类危害，且废弃物易于处理。此外，使用链霉亲和素检测所需等待时间较长（约3小时）¹²。本文所展示的实验方案与结果表明，fEMSA是生物医学研究中一种高效且便捷的工具。我们已成功应用fEMSA揭示SOX-2^G73E突变对特异性DN.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30% 丙烯酰胺/Bis 溶液，37.5:1	Bio-Rad	1610158	丙烯酰胺有害且具毒性。
6x-His 表位标签抗体 (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 抗体	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
牛血清白蛋白 (BSA)，分子生物学级	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700 标记的 DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	定制 DNA 寡核苷酸	在文稿中称为 "5'染料标记或红外荧光染料标记的 DNA 寡核苷酸"。该公司将定制合成 5' IRDye 标记的 DNA 寡核苷酸。要求最小合成规模为 100 μM，并进行 HPLC 纯化。
Klenow 片段 (3'-->5' 外切酶缺陷型)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN 垂直电泳槽	Bio-Rad	1658000FC	在文稿中称为“小型蛋白凝胶系统”。只要使用尺寸小于 25 cm × 25 cm 的透明玻璃板，任何电泳系统均可使用。
Odyssey CLx 红外成像系统	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	在文稿中称为“高级红外成像系统”。
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	在文稿中称为“主要用于 Western 印迹的近红外荧光成像系统”。
Image Studio 软件（版本 4.0）	LI-COR Biotechnology	Image Studio 软件	在文稿中称为“特定成像软件”。
橙 G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x 橙色上样染料			0.25% 橙 G；30% 甘油
0.5x TBE			45 mM Tris-硼酸盐；1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl；10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA
5x 结合缓冲液			50 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM NaCl；200 mM KCl；5 mM MgCl2；5 mM EDTA，pH 8.0；5 mM DTT；250 μg/mL BSA