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方法文章

使用红外荧光染料标记寡核苷酸的电泳迁移率 shift 实验优化方案

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DOI：

10.3791/54863

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2016年11月29日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

本文内容

摘要

本文以纯化的SOX-2蛋白与红外荧光染料标记的DNA探针为例，介绍了一种优化的荧光电泳迁移率变动分析（fEMSA）实验方案，用于解决一个重要生物学问题。

摘要

电泳迁移率变动分析（EMSA）是用于表征蛋白质与其靶DNA序列相互作用的重要工具。在EMSA中，放射性标记一直是DNA标记的主要方法。然而，近年来荧光染料和扫描技术的进步促使荧光标记DNA逐渐成为替代放射性的可行方案，其优势在于操作简便、节省时间、降低成本并提高安全性。我们近期成功应用荧光EMSA（fEMSA）解决了一个重要的生物学问题。我们的fEMSA分析揭示了高度保守的HMG转录因子SOX-2中错义突变G73E对嗅觉神经元类型多样化的影响机制。我们发现，突变型SOX-2G73E蛋白改变了其特异性DNA结合活性，从而导致嗅觉神经元身份的转变。在此，我们以含有LIM-4/SOX-2相邻靶位点的红外荧光染料标记寡核苷酸，以及纯化的SOX-2蛋白（野生型和突变型SOX-2G73E蛋白）作为生物学实例，提供了一套优化且经济高效的fEMSA逐步操作方案。

引言

电泳迁移率变动分析（EMSA）通过使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来分析DNA与蛋白质之间的相互作用，该方法用于分离目标蛋白质与含有潜在蛋白质结合位点的标记DNA探针的混合物1。与游离的DNA探针相比，与蛋白质结合的DNA探针在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度较慢，因而出现迁移延迟。在EMSA中，32P放射性标记DNA一直是主要的检测方法。尽管放射性标记在生物化学研究中的应用具有显著优势，但由于操作放射性物质带来的健康与安全风险，目前正越来越多地采用具有相当灵敏度的替代性DNA标记方法。这些替代方法包括将DNA与生物素2或地高辛（DIG）3偶联（两者均通过化学发光系统进行检测）、使用SYBR Green对PAGE凝胶染色4，或通过凝胶扫描直接检测DNA-荧光染料偶联物5,6。

使用放射性标记DNA探针的EMSA凝胶在电泳后需要通过放射自显影胶片或磷屏成像系统来检测放射性信号1,7。使用生物素2或DIG偶联3 DNA探针的EMSA凝胶也必须经过处理并转移至适当的膜上，再通过化学发光法进行检测6。SYBR Green染色则需要电泳后对凝胶进行染色，并使用荧光扫描仪检测4。由于上述DNA标记技术在EMSA中均需进行电泳后的凝胶处理步骤，因此分离后的凝胶只能检测一次。相比之下，用荧光染料标记的DNA探针可在玻璃板内的凝胶中直接通过扫描仪检测，从而可在电泳过程中不同时间点多次监测和分析DNA-蛋白质相互作用，显著节省时间和成本。已用于EMSA的DNA-荧光染料偶联物包括Cy36,8、Cy56,8、荧光素（fluorescein）9以及红外荧光染料4-6。

转录调控依赖于转录因子与其靶基因之间的蛋白质-DNA相互作用。在动物发育过程中，这些相互作用的协调作用能够从一个共同的前体细胞产生多种不同类型的细胞。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）转录因子SOX-2的高保守HMG DNA结合结构域中存在一个错义突变G73E，该突变是通过无偏倚的正向遗传筛选鉴定得到的。该突变在分子、形态和功能水平上均导致AWB嗅觉神经元向AWC嗅觉神经元的细胞身份转化5,10。SOX-2通过与依赖于细胞环境的辅助转录因子及其相应的DNA靶位点相互作用，差异性地调控AWB和AWC神经元的终末分化过程5,10。在AWB神经元的终末分化中，SOX-2与LIM-4（LHX）相互协作；而在AWC神经元的终末分化中，SOX-2则与CEH-36（OTX/OTD）相互协作。荧光素酶报告基因实验表明，SOX-2及其突变体SOX-2G73E蛋白均能与转录共调节因子LIM-4和CEH-36协同作用，激活在AWB和AWC神经元中表达的启动子。然而，SOX-2与突变体SOX-2G73E对启动子的激活能力表现出差异性。为了探究SOX-2与SOX-2G73E在DNA结合活性上差异的分子基础，我们利用这两种蛋白及其潜在靶位点进行了荧光标记电泳迁移率变动分析（fEMSAs）。

首先，采用生物信息学方法鉴定荧光素酶报告基因实验中所用1 kb启动子区域内具有生物学意义的DNA结合序列。由于启动子区域中存在多个潜在的SOX-2结合位点，我们重点关注预测位于潜在CEH-36或LIM-4结合位点附近且在多种线虫物种间进化保守的SOX-2结合位点。对这些序列进行缺失或突变处理后，进一步开展功能验证实验 体内 通过检测其在AWB或AWC神经元中表达GFP报告转基因的活性，我们鉴定出LIM-4/SOX-2和CEH-36/SOX-2相邻的潜在靶位点，这些位点分别对GFP在AWB和AWC神经元中的表达具有特异性需求5我们研究了SOX-2与SOX-2在DNA结合能力上的潜在差异G73E 使用fEMSA检测鉴定出的LIM-4/SOX-2和CEH-36/SOX-2相邻靶位点。我们的EMSA分析表明，SOX-2G73E 未能像野生型SOX-2那样高效地结合含有LIM-4/SOX-2相邻靶位点（AWB中基因表达所必需）的DNA探针。然而，SOX-2与SOX-2G73E 在结合含有CEH-36/SOX-2相邻靶位点（AWC中基因表达所必需）的DNA探针方面无差异5,10我们的fEMSA分析为SOX-2的作用机制提供了深入的见解G73E 突变对AWB至AWC细胞身份转换表型中特异性DNA结合活性的影响。本文中，我们描述了一种优化的fEMSA实验方案，使用纯化的6xHis-SOX-2或6xHis-SOX-2G73E 结合红外荧光染料标记的DNA探针（包含LIM-4/SOX-2相邻靶位点）作为案例研究，以解决一个重要生物学问题。

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方案

注意：使用荧光标记DNA探针或其他形式标记DNA的EMSA实验，在蛋白质或细胞提取物制备、蛋白质-DNA结合反应以及PAGE凝胶制备与电泳步骤上均采用相同方案（图1A）。主要差异在于DNA标记程序、电泳后凝胶的处理步骤以及检测方法。

1. 凝胶制备

  1. 使用微型蛋白凝胶系统（8.3 cm 宽 × 7.3 cm 长 × 0.75 mm 厚）制备含有 0.5× TBE（45 mM Tris-硼酸盐，1 mM EDTA）和 2.5% 甘油的 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶。
    1. 为制备 4 块凝胶所需的 30 mL 凝胶溶液，充分混合以下组分：5 mL 30% 丙烯酰胺/Bis（37.5:1）、3 mL 5× TBE（0.45 M Tris-硼酸盐，10 mM EDTA）、1.5 mL 50% 甘油、300 µL 10% 过硫酸铵、15 µL TEMED 以及 20.2 mL ddH2O。
      注意：丙烯酰胺具有毒性和危害性，操作时需佩戴适当的个人防护装备。
  2. 立即灌注凝胶溶液。聚合完成后，用预先用 0.5× TBE 浸润的塑料膜包裹凝胶，并于 4 °C 保存。

2. 红外荧光染料标记探针的制备

注意：在制备、储存和实验过程中，应尽量避免红外荧光染料标记的寡核苷酸暴露于光线下。

  1. 设计并订购寡核苷酸。
    1. 设计约51个碱基的长寡核苷酸。
      注意：LIM-4/SOX-2 探针的长寡核苷酸序列为 TATCATATCTATTCTATGATTAAATACCTATTCATTTCAAAATCTTCTCCC。长寡核苷酸无需聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或高效液相色谱（HPLC）纯化。
    2. 设计约14个碱基的互补短寡核苷酸，其5'端（5'Dye）修饰红外荧光染料，且熔解温度高于37 °C。
      注意：LIM-4/SOX-2 探针的短寡核苷酸序列为 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG。5'Dye 标记的短寡核苷酸最小合成规模为 100 nM，因此寡核苷酸需要进行高效液相色谱（HPLC）纯化。
  2. 将寡核苷酸重悬于1× Tris-EDTA缓冲液（TE：10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA）中，终浓度为100 µM。
  3. 退火短链（5'标记荧光染料）与长链寡核苷酸。
    1. 混合 0.6 µL 100 µM 5'荧光标记短链寡核苷酸 1.2 µL 的长寡核苷酸（100 µM）以及 28.2 µL 氯化钠-三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（STE：100 mM NaCl； 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 1 mM EDTA）置于1.5 mL离心管中 管
    2. 将试管置于沸水中5分钟。关闭热源，让含有退火寡核苷酸的水在避光条件下过夜冷却。
  4. 使用Klenow DNA聚合酶填补退火后的5'荧光标记短/长寡核苷酸的5'突出端，以制备双链DNA探针。
    1. 将30 µL反应物混合以准备反应 退火的带5'端染料标记的短/长寡核苷酸，8.5 µL 10× Klenow 缓冲液，1.7 µL 10 mM dNTPs 1.7 µL Klenow（3'->5' 外切酶阴性（5 U/µL）和 43.1 µL 去离子水20.2 mL 中的 O PCR管
    2. 在PCR仪中37 °C孵育60分钟。
    3. 加入 3.4 µL 加入0.5 M EDTA终止反应，并在PCR仪中于75 °C加热失活20 min。
  5. 将填满的探针用STE稀释至终浓度为0.1 µM（初始浓度为0.7 µM）。
  6. 将寡核苷酸在-20 °C避光保存至使用前。在此条件下可保存长达一年。
    注意：为了生成含有突变结合位点的DNA探针，将含有突变的长链寡核苷酸与5'端标记荧光染料的短链寡核苷酸退火，随后用Klenow酶补平5'突出端。已有研究表明，仅一条链标记红外荧光染料的探针，其信号强度仅为双链均标记染料探针的30%。若需增强信号强度，可将两条长链寡核苷酸的5'端均标记红外荧光染料，再退火形成双标记红外荧光染料探针。

3. 未标记/冷探针（竞争物）的制备

注意：将互补序列的长寡核苷酸（Long 和 LongR）退火，以制备未标记探针，用于与红外荧光染料标记探针进行竞争分析。

  1. 在1.5 mL 离心管中加入20 µL 100 µM Long寡核苷酸、20 µL 100 µM LongR寡核苷酸以及60 µL STE缓冲液，混匀。
  2. 将离心管置于沸水中加热5分钟，关闭热源，使含有退火后寡核苷酸的水自然冷却过夜。

4. 结合反应与电泳

  1. 准备 1 mL 5×结合缓冲液，通过混合50 µL 1 M Tris-HCl，pH 7.5 10 µL 5 M NaCl溶液 200 µL 1 M KCl 5 µL 1 M MgCl 溶液2, 10 µL 0.5 M EDTA，pH 8.0 5 µL 1 M DTT 溶液 25 µL 10 mg/mL BSA 和 695 µL 去离子水2O.
    注意：5×结合缓冲液可分装后于-20 °C保存。另一个需要考虑的问题是，不同的转录因子对结合缓冲液的组分可能有不同的要求。
  2. 在准备结合反应前，先将5%的天然聚丙烯酰胺凝胶在含有2.5%甘油的0.5×TBE缓冲液中以80 V预电泳30分钟，以去除所有痕量的过硫酸铵 - 60 分钟， 或直至电流不再随时间变化。
  3. 在终体积为 20 µL 的体系中进行结合反应。
    1. 混合 4 µL 5×结合缓冲液，80–200 ng 纯化的蛋白A（溶于50%甘油中） 即，SOX-2），1 µL 0.1 µM 荧光染料标记探针（终浓度：5 nM）和 ddH₂O2O.
    2. 可选：当需要冷探针竞争物时，加入不同浓度（2x, 10x, 25x, 50x, 100x） 等等。冷探针的数量。
    3. 可选：当蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用（即，SOX-2 和 LIM-4）进行检测时，加入 80 - 200 ng 纯化的蛋白质 B（溶于 50% 甘油中， 即，LIM-4。
    4. 可选：当使用核提取物制备且需验证蛋白A的特异性结合时，加入针对蛋白A的特异性抗体（即， 抗-6xHis，抗-FLAG， 等等。).
    5. 室温避光孵育15分钟。
  4. 将全部结合反应产物上样至凝胶，并以10 V/cm的电压电泳至目标距离。

5. 成像

注意：凝胶使用高级红外成像系统直接在玻璃板中进行扫描。因此，凝胶可进一步解析并重复扫描（图1C 和 2）。也曾尝试使用主要用于 Western 印迹的近红外荧光成像系统对凝胶进行扫描，但仅有高级红外成像系统能够以良好的分辨率完成扫描。所描述的方法针对特定的红外成像软件，尽管也可使用其他软件包。

  1. 使用ddH2O清洁扫描仪床面，并在扫描前彻底擦干。将凝胶的玻璃板擦干后，把含有凝胶的玻璃板放置在扫描仪床面上。
  2. 打开红外成像软件，进入“Acquire”选项卡。当较薄的玻璃板（1 mm）放置在扫描仪床面上时，使用以下设置：通道（Channel）：700，强度（Intensity）：自动，分辨率（Resolution）：169 µm，质量（Quality）：中等，焦距偏移（Focus offset）：1.5 mm。当较厚的玻璃板（3 mm）放置在扫描仪床面上时，使用以下设置：通道（Channel）：700，强度（Intensity）：自动，分辨率（Resolution）：84 µm，质量（Quality）：中等，焦距偏移（Focus offset）：3.5 mm。焦距偏移取决于玻璃板的厚度。
  3. 选择凝胶在扫描仪上所占据的区域，点击“Start”开始扫描。
  4. 根据需要重复电泳并额外进行扫描。

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结果

可在上样前将 Orange G 上样染料（6×：100 mL 含 30% 甘油的溶液中加入 0.12 g Orange G）加入结合反应体系，以观察电泳进程。其他上样染料（如溴酚蓝）会在扫描过程中被检测到，从而干扰图像分析（图 1B）。

在某些 EMSA 实验中，特别是使用核提取物制备时，会在结合反应中加入聚脱氧肌苷酸-脱氧胞苷酸（dI-dC）以减少蛋白质与 DNA 的非特异性结合11。然而，50 µg/mL 的 dI-dC 完全抑制了纯化的 6xHis-SOX-2 与 5'标记的 DNA 探针的结合（图 1B）。

为了验证红外荧光染料标记的DNA探针的结合特异性，我们使用了野生型或突变型的未标记探针作为竞争物（图1C

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讨论

荧光凝胶迁移实验（fEMSA）是一种研究蛋白质-DNA相互作用的有效工具，可作为DNA放射性标记的替代方法。市面上有售的荧光染料（如红外染料）相比放射性DNA标记更为安全且更环保。使用红外荧光染料标记的寡核苷酸进行EMSA时，无需电泳后凝胶处理步骤，因此相较于其他DNA标记技术更节省时间和成本。采用放射性EMSA检测条带所需时间可从30分钟到数天不等，具体取决于所用DNA探针的放射性强度和浓度1。相比之下，fEMSA凝胶扫描平均仅需25分钟，显著缩短了实验周期。fEMSA相较于放射性标记还具有显著优势：分析时无需将凝胶从玻璃板间取出，这使得在初始扫描时间不足、未能充分分辨蛋白质-DNA复合物时，可对凝胶重新扫描。而使用放射性同位素或生物素/链霉亲和素系统则无法延长电泳时间。最重要的是，操作放射性物质对实验室人员存在安全风险，而DNA探针的荧光标记无此类危害，且废弃物易于处理。此外，使用链霉亲和素检测所需等待时间较长（约3小时）12。本文所展示的实验方案与结果表明，fEMSA是生物医学研究中一种高效且便捷的工具。我们已成功应用fEMSA揭示SOX-2G73E突变对特异性DN...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了阿尔弗雷德·P·斯隆研究奖学金（授予 C.-F.C.）和美国国立卫生研究院 R01 资助（5R01GM098026-05，授予 C.-F.C.）的支持。我们感谢 David Crowe 提供使用先进红外成像系统的机会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 丙烯酰胺/Bis 溶液，37.5:1 Bio-Rad1610158丙烯酰胺有害且具毒性。
6x-His 表位标签抗体 (HIS.H8)ThermoFisherMA1-21315
Anti-Flag M2 抗体 Sigma-AldrichF3165-.2MG
牛血清白蛋白 (BSA)，分子生物学级New England BiolabsB9000S
5'IRDye700 标记的 DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies定制 DNA 寡核苷酸在文稿中称为 "5'染料标记或红外荧光染料标记的 DNA 寡核苷酸"。该公司将定制合成 5' IRDye 标记的 DNA 寡核苷酸。要求最小合成规模为 100 μM，并进行 HPLC 纯化。
Klenow 片段 (3'-->5' 外切酶缺陷型)New England BiolabsM0212S
LightShif Poly (dI-dC)ThermoFisher20148E
Mini-PROTEAN 垂直电泳槽 Bio-Rad1658000FC 在文稿中称为“小型蛋白凝胶系统”。只要使用尺寸小于 25 cm × 25 cm 的透明玻璃板，任何电泳系统均可使用。
Odyssey CLx 红外成像系统LI-COR BiotechnologyOdyssey CLx Infrared Imagng System在文稿中称为“高级红外成像系统”。
Odyssey Fc 成像系统 LI-COR BiotechnologyOdyssey Fc Dual-Mode Imaging System在文稿中称为“主要用于 Western 印迹的近红外荧光成像系统”。
Image Studio 软件（版本 4.0）LI-COR BiotechnologyImage Studio 软件 在文稿中称为“特定成像软件”。 
橙 GSigma-AldrichO3756-25G
6x 橙色上样染料0.25% 橙 G；30% 甘油
0.5x TBE45 mM Tris-硼酸盐；1 mM EDTA
1x TE10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA
1x STE100 mM NaCl；10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA
5x 结合缓冲液50 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM NaCl；200 mM KCl；5 mM MgCl2；5 mM EDTA，pH 8.0；5 mM DTT；250 μg/mL BSA

参考文献

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