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方法文章

靶向肺癌纳米颗粒介导的光动力疗法的抗癌功效

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DOI：

10.3791/54865

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2016年12月1日

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

本文内容

摘要

光动力疗法（PDT）是肺癌治疗的一种替代选择。为了增强PDT的治疗效果，研发了联合化疗的肺癌靶向纳米颗粒。两者 体外 和 体内 采用制备的纳米颗粒进行光动力疗法的抗肿瘤功效进行了评估。

摘要

光动力疗法（PDT）是一种非侵入性、非手术的治疗方法，是肺癌治疗的一种有吸引力的替代选择。光敏剂可在肿瘤组织中选择性积聚，并在氧气和适当波长的光照射下导致肿瘤细胞死亡。

为了增强光动力疗法的治疗效果，我们开发了负载光敏剂和抗癌药物的肺癌靶向纳米颗粒。该体系同时采用了基于增强渗透性和滞留效应（EPR）的被动靶向以及基于透明质酸-CD44相互作用的主动靶向。CD44是一种已知的透明质酸受体，常被用作非小细胞肺癌的生物标志物。

此外，本研究采用了光动力疗法与化疗相结合的方案。这种联合治疗策略可能增强抗癌治疗效果并减少不良反应。

本研究选用紫草素B（HB）作为新型光敏剂。已有报道表明，与血卟啉衍生物相比，HB在光动力疗法（PDT）中表现出更强的抗肿瘤效果1。紫杉醇被选为抗肿瘤药物，因其已被证实对肺癌具有潜在治疗作用2。

光动力治疗（PDT）后，比较了光敏剂（HB）溶液、包载光敏剂的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-NPs）以及共包载光敏剂和抗癌药物（紫杉醇）的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-P-NPs）的抗肿瘤效果 体外 和 体内。该 体外 A549（人肺腺癌）细胞中的光毒性及 体内 在A549荷瘤小鼠中评估了抗肿瘤疗效。

HB-P-NP 治疗组在光动力治疗（PDT）后表现出最有效的抗癌效果。综上所述，本研究制备的 HB-P-NPs 代表了一种具有潜力的新型光敏剂递送系统，可用于肺癌的光动力治疗。

引言

光动力疗法（PDT）包含三个主要因素：光敏剂、光和氧气。据报道，PDT 是治疗多种癌症的一种有前景的疗法3。当光敏剂被施用于癌症患者时，会优先在肿瘤组织中积聚。当施加适当波长的光时，会产生高活性的单线态氧及其他自由基，从而导致肿瘤细胞损伤4。

肺癌是20世纪80年代初光动力疗法（PDT）最早应用的领域之一5。PDT在治疗肺癌方面具有多项优势。由于PDT是一种非侵入性且非手术的治疗方法，对于不适合手术切除的患者而言，它是一种极具吸引力的替代选择。

提高光敏剂对癌症的靶向效率面临诸多挑战。增加光敏剂在肿瘤部位的富集并减少其在正常组织中的积累，是癌症靶向研究的共同目标。多种靶向药物递送系统，如聚合物、脂质体和纳米颗粒，已被用作光敏剂的载体6-8。在我们之前的研究中，纳米颗粒显著增强了光敏剂的肿瘤靶向能力9,10。纳米颗粒是理想的癌症靶向载体，因其兼具被动靶向和主动靶向能力。肿瘤血管的高通透性为纳米级载体在肿瘤组织中富集提供了条件，这一现象被称为增强的渗透与滞留（EPR）效应11,12。纳米颗粒与癌细胞表面特异性受体之间的相互作用可实现主动靶向。在本研究中，我们制备了基于透明质酸的纳米颗粒，以靶向CD44——一种在肺癌细胞上高表达的主要透明质酸受体13。

为了最大化抗癌效果，本研究采用了光动力疗法（PDT）与化疗相结合的策略。这种联合治疗理念可能实现更强的治疗效果。此外，降低光敏剂和抗癌药物的使用剂量有助于减少不良反应。本研究选用竹红菌素B（HB）作为新型光敏剂。HB是从中药真菌Hypocrella bambuase中分离得到的。Shang et al. 报道指出，与血卟啉衍生物为基础的光动力疗法相比，基于HB的光动力疗法具有更高的抗癌效能1。本研究选择紫杉醇作为抗癌药物，因其已被证实对多种癌症（包括肺癌）具有良好的治疗潜力2。

本文中，我们比较了光动力治疗（PDT）后光敏剂（竹红菌素B，HB）溶液、包载光敏剂的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-NPs）以及同时包载光敏剂和抗癌药物（紫杉醇）的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-P-NPs）的抗肿瘤效果。 体外 A549（人肺腺癌）细胞中的光毒性及 体内 在A549荷瘤小鼠中评估了抗肿瘤疗效。

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方案

注意：所有动物研究方案均经首尔国立大学盆塘医院机构动物护理和使用委员会批准（BA1308-134/072-01）。

1. 透明质酸-神经酰胺（HACE）的合成

  1. 将12.21 mmol的透明质酸（HA）寡聚物和9.77 mmol的四-n将氢氧化四丁基铵（TBA）溶于60 ml双蒸水（DDW）中，搅拌30分钟。
  2. 合成DS-Y30连接子：将8.59 mmol DS-Y30神经酰胺和9.45 mmol三乙胺溶于25 ml四氢呋喃（THF）中，加入8.59 mmol 4-氯甲基苯甲酰氯的THF溶液，60 °C下搅拌反应6小时。
  3. 将合成的8.10 mmol HA-TBA和0.41 mmol DS-Y30连接剂溶解于THF与乙腈的混合溶液（4:1, v/v）中，在40 °C下搅拌反应5小时。
  4. 使用助滤剂过滤去除杂质，通过减压蒸馏除去有机溶剂。利用透析膜（截留分子量：3.5 kDa）纯化产物，并进行冻干。

2. 纳米颗粒的制备

  1. 将1 mg HB和1 mg紫杉醇溶解于0.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中，并加入0.5 ml去离子水（DDW），涡旋混合5分钟。然后，再通过涡旋混合5分钟，使HACE在该混合液中溶解。
  2. 为除去溶剂，在氮气缓流条件下于70 °C加热4小时。
  3. 用1 ml去离子水（DDW）重新悬浮由HACE、HB和紫杉醇组成的薄膜。使用注射器滤器（孔径0.45 µm）过滤，以去除未包封的药物。

3. 体外 光毒性

  1. 肺癌细胞系对纳米颗粒的摄取
    1. 配制含10% (v/v) 胎牛血清和1% (w/v) 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。
    2. 将A549细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中（每组设三个复孔），在37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养24小时。
    3. 待细胞贴壁后，吸除培养基，并加入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
    4. 将纳米颗粒溶于PBS中，配制成终浓度为2 µM/ml的HB溶液。随后，在每孔中分别加入1 ml PBS、空纳米颗粒（empty NPs）、HB-NPs或HB-P-NPs，在避光条件下孵育4小时。
    5. 吸除全部溶液，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。然后加入新鲜培养基。
  2. 细胞活力检测
    1. 将细胞培养板置于PDT光纤下方（光纤与孔之间的距离为1 cm）。佩戴激光防护眼镜，在避光条件下使用PDT激光器（630 nm，400 mW/cm2）照射细胞不同时间：0、5、10、20、30和40秒（对应的能量密度分别为0、2、4、8、12和16 J/cm2）。照射后，在避光条件下继续培养细胞24小时。
    2. 吸除培养基，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。
    3. 向每孔加入10 µl细胞毒性检测试剂，避光孵育2小时。
    4. 使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。
  3. 显微镜分析
    1. 将细胞培养板置于PDT光纤下方（光纤与孔之间的距离为1 cm）。佩戴激光防护眼镜，在避光条件下使用PDT激光器（630 nm，400 mW/cm2）照射细胞0、20或40秒（对应的能量密度分别为0、8或16 J/cm2）。照射后，在避光条件下继续培养细胞24小时。
    2. 吸除培养基，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。
    3. 向每孔加入50 µl Annexin V-FITC和50 µl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1.5 µg/ml）。轻轻振荡培养板，在室温避光条件下孵育15分钟。
      注：Annexin V-FITC应使用荧光显微镜试剂盒中的试剂。
    4. 加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。将细胞保持在新鲜PBS中，使用100倍放大倍数的光学显微镜观察凋亡细胞。
  4. 荧光激活细胞分选（FACS）分析
    1. 将细胞培养板置于PDT光纤下方（光纤与孔之间的距离为1 cm）。佩戴激光防护眼镜，使用PDT激光器（630 nm，400 mW/cm2）照射细胞0、20或40秒（对应的能量密度分别为0、8或16 J/cm2）。照射后，在避光条件下继续培养细胞24小时。
    2. 吸除培养基，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。
    3. 将细胞重悬于1 ml 1×结合缓冲液中（将1份10×结合缓冲液[含0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl和25 mM CaCl2]用9份蒸馏水稀释），取100 µl样品溶液转移至5 ml流式管中。
    4. 加入5 µl Annexin V-FITC和5 µl碘化丙啶（PI）。轻轻涡旋混匀，在室温（RT）避光条件下孵育15分钟，再加入400 µl 1×结合缓冲液。
      注：Annexin V-FITC和PI应使用荧光显微镜试剂盒中的试剂。
    5. 使用FACS14检测凋亡细胞。PI和Annexin V-FITC的激发激光波长分别为488 nm和635 nm，其荧光发射波长分别在610 ± 20 nm和660 ± 20 nm范围内检测。每样本在流式细胞仪上采集10,000个事件的细胞数据。

4. 在体 荷瘤小鼠中的抗肿瘤疗效

  1. 肺癌诱导小鼠模型
    1. 将 1 × 106 个 A549 细胞悬浮于 0.1 ml RPMI-1640 培养基中；置于冰上保存。
    2. 通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶确认麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
    3. 将细胞悬液皮下注射至 BALB/C 雄性裸鼠（6–7 周龄，20–22 g）左侧 flank 区域。
    4. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。
      注意：在动物未完全恢复意识并能维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。小鼠应饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。
    5. 每天使用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积（mm3）按公式（长 × 宽2）/ 2 计算。当肿瘤体积达到约 200 mm3 时，开始实验。
  2. 抗肿瘤疗效研究
    1. 将小鼠随机分为 4 组（每组 n = 10）。
    2. 通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶确认麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
    3. 将纳米颗粒溶于 PBS 中，使 HB 的终浓度为 2 mg/ml。在第 0 天和第 7 天，分别通过尾静脉注射 PBS、游离 HB、HB-NPs 或 HB-P-NPs（HB 剂量为 2 mg/kg），各注射两次。
    4. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。
      注意：在动物未完全恢复意识并能维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。保持笼具避光，并维持于 SPF 条件下。
    5. 每次注射后 24 小时，通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶确认麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
    6. 将肿瘤部位置于 PDT 光纤下方（光纤与肿瘤距离为 1 cm）。佩戴激光防护眼镜，关闭开关后启动激光，使用 PDT 激光（630 nm，400 mW/cm2）照射肿瘤 500 秒（200 J/cm2），分别在第 1 天和第 8 天各照射一次。
    7. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。在动物未完全恢复意识并能维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
    8. 将笼具维持于 SPF 条件下。激光治疗后 24 小时内保持笼具避光。
    9. 每天肉眼观察肿瘤体积及肿瘤部位的变化。使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按公式（长 × 宽2）/ 2（mm3）计算体积。每天拍摄肿瘤部位照片，以评估 PDT 后肿瘤表面的改变。
    10. 第 16 天，每组取五只小鼠，采用异氟烷深度麻醉法处死。
    11. 使用镊子和剪刀切开体表皮肤，暴露肿瘤15，小心完整剥离。将肿瘤组织置于 10% 福尔马林中固定，石蜡包埋，并进行苏木精-伊红（H&E）染色，用于组织学分析16。
    12. 持续观察 45 天后，采用异氟烷深度麻醉法处死剩余小鼠。

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结果

我们采用上述技术制备了HB-NPs和HB-P-NPs。HB-NPs和HB-P-NPs的平均直径分别为220.9 ± 3.2 nm和211.9 ± 1.6 nm。

A549细胞在与PBS、空白NPs、HB-NPs和HB-P-NPs孵育4小时后，经光照（0至16 J/cm2）处理的细胞活力如图1所示。在无光照条件下，HB-NP处理组未表现出任何细胞毒性，而HB-P-NP处理组的细胞活力为81.28 ± 0.14%。这可能是由于紫杉醇从纳米颗粒中释放，发挥了抗肿瘤作用。在光动力治疗（PDT）条件下，HB-NP和HB-P-NP处理组的细胞活力均随光照时间延长而下降。在相同照射条件下，HB-P-NP处理组表现出比HB-NP组更强的光毒性。当给予16 J/cm2的照射剂量时，HB-P-NP处理组中仅有7.52 ± 0.38%的细胞存活。

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讨论

本研究中最关键的步骤是选择合适的激光参数：波长、功率和照射时间。光动力疗法（PDT）需要使用适合特定光敏剂的合适波长。我们采用了630 nm的激光，该波长适用于 hypocrellin B。输出功率是另一个重要因素，根据多次预实验结果，设定为400 mW/cm2。输出功率超过400 mW/cm2时，会因照射本身而损伤细胞或动物的皮肤表面；而低于400 mW/cm2时，功率过弱，无法产生任何治疗效果。体外和体内实验的合适照射时间分别为40秒（16 J/cm2）和500秒（200 J/cm2）。激光光纤与细胞或动物模型肿瘤组织之间的距离也是本研究中的一个关键因素。为使光照覆盖整个细胞或肿瘤表面，发现1 cm为最佳距离。

如果使用不同的光敏剂，选择适当的光波长可使光动力疗法（PDT）的效果最大化。输出功率和照射时间应通过反复试验确定。在光照过程中，若皮肤表面开始出现灼烧现象，应降低输出功率。若光动力治疗后次日肿瘤表面毫无变化，可能提示需要提高输...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由首尔国立大学盆唐医院研究基金资助，项目编号为14-2014-017。

作者感谢东京医科大学名誉教授、首尔国立大学盆唐医院兼职教授 J. Patrick Barron 对本研究的贡献 公益 本稿件的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
寡聚透明质酸Bioland Co., Ltd._
DS-Y30（神经酰胺3B；主要成分为N-油酰基-植鞘氨醇）Doosan Biotech Co., Ltd._
己二酸二酰肼Sigma AldrichA0638
N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺Sigma Aldrich39391
4-(氯甲基)苯甲酰氯Sigma Aldrich270784
吐温80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
注射器滤器Sartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm，RC，PP，0.45 µm
三乙胺Sigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex 管Gene Bio-Application Ltd.D070-12-100
紫杉醇Taihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
青霉素–链霉素Gibco Life Technologies, Inc.15070
胎牛血清Gibco Life Technologies, Inc.16140071
硅藻土（过滤剂）Sigma Aldrich6858参见步骤1.4

参考文献

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