光动力疗法（PDT）是肺癌治疗的一种替代选择。为了增强PDT的治疗效果，研发了联合化疗的肺癌靶向纳米颗粒。两者 体外 和 体内 采用制备的纳米颗粒进行光动力疗法的抗肿瘤功效进行了评估。
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摘要
摘要
光动力疗法（PDT）是一种非侵入性、非手术的治疗方法，是肺癌治疗的一种有吸引力的替代选择。光敏剂可在肿瘤组织中选择性积聚，并在氧气和适当波长的光照射下导致肿瘤细胞死亡。
为了增强光动力疗法的治疗效果，我们开发了负载光敏剂和抗癌药物的肺癌靶向纳米颗粒。该体系同时采用了基于增强渗透性和滞留效应（EPR）的被动靶向以及基于透明质酸-CD44相互作用的主动靶向。CD44是一种已知的透明质酸受体，常被用作非小细胞肺癌的生物标志物。
此外，本研究采用了光动力疗法与化疗相结合的方案。这种联合治疗策略可能增强抗癌治疗效果并减少不良反应。
本研究选用紫草素B（HB）作为新型光敏剂。已有报道表明，与血卟啉衍生物相比，HB在光动力疗法（PDT）中表现出更强的抗肿瘤效果1。紫杉醇被选为抗肿瘤药物，因其已被证实对肺癌具有潜在治疗作用2。
光动力治疗（PDT）后，比较了光敏剂（HB）溶液、包载光敏剂的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-NPs）以及共包载光敏剂和抗癌药物（紫杉醇）的透明质酸-神经酰胺纳米颗粒（HB-P-NPs）的抗肿瘤效果 体外 和 体内。该 体外 A549（人肺腺癌）细胞中的光毒性及 体内 在A549荷瘤小鼠中评估了抗肿瘤疗效。
HB-P-NP 治疗组在光动力治疗（PDT）后表现出最有效的抗癌效果。综上所述，本研究制备的 HB-P-NPs 代表了一种具有潜力的新型光敏剂递送系统，可用于肺癌的光动力治疗。
引言
光动力疗法（PDT）包含三个主要因素：光敏剂、光和氧气。据报道，PDT 是治疗多种癌症的一种有前景的疗法3。当光敏剂被施用于癌症患者时，会优先在肿瘤组织中积聚。当施加适当波长的光时，会产生高活性的单线态氧及其他自由基，从而导致肿瘤细胞损伤4。
肺癌是20世纪80年代初光动力疗法（PDT）最早应用的领域之一5。PDT在治疗肺癌方面具有多项优势。由于PDT是一种非侵入性且非手术的治疗方法，对于不适合手术切除的患者而言，它是一种极具吸引力的替代选择。
提高光敏剂对癌症的靶向效率面临诸多挑战。增加光敏剂在肿瘤部位的富集并减少其在正常组织中的积累，是癌症靶向研究的共同目标。多种靶向药物递送系统，如聚合物、脂质体和纳米颗粒，已被用作光敏剂的载体6-8。在我们之前的研究中，纳米颗粒显著增强了光敏剂的肿瘤靶向能力9,10。纳米颗粒是理想的癌症靶向载体，因其兼具被动靶向和主动靶向能力。肿瘤血管的高通透性为纳米级载体在肿瘤组织中富集提供了条件，这一现象被称为增强的渗透与滞留（EPR）效应11,12。纳米颗粒与癌细胞表面特异性受体之间的相互作用可实现主动靶向。在本研究中，我们制备了基于透明质酸的纳米颗粒，以靶向CD44——一种在肺癌细胞上高表达的主要透明质酸受体13。
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方案
注意：所有动物研究方案均经首尔国立大学盆塘医院机构动物护理和使用委员会批准（BA1308-134/072-01）。
1. 透明质酸-神经酰胺（HACE）的合成
- 将12.21 mmol的透明质酸（HA）寡聚物和9.77 mmol的四-n将氢氧化四丁基铵（TBA）溶于60 ml双蒸水（DDW）中，搅拌30分钟。
- 合成DS-Y30连接子：将8.59 mmol DS-Y30神经酰胺和9.45 mmol三乙胺溶于25 ml四氢呋喃（THF）中，加入8.59 mmol 4-氯甲基苯甲酰氯的THF溶液，60 °C下搅拌反应6小时。
- 将合成的8.10 mmol HA-TBA和0.41 mmol DS-Y30连接剂溶解于THF与乙腈的混合溶液（4:1, v/v）中，在40 °C下搅拌反应5小时。
- 使用助滤剂过滤去除杂质，通过减压蒸馏除去有机溶剂。利用透析膜（截留分子量：3.5 kDa）纯化产物，并进行冻干。
2. 纳米颗粒的制备
- 将1 mg HB和1 mg紫杉醇溶解于0.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中，并加入0.5 ml去离子水（DDW），涡旋混合5分钟。然后，再通过涡旋混合5分钟，使HACE在该混合液中溶解。
- 为除去溶剂，在氮气缓流条件下于70 °C加热4小时。
- 用1 ml去离子水（DDW）重新悬浮....
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结果
我们采用上述技术制备了HB-NPs和HB-P-NPs。HB-NPs和HB-P-NPs的平均直径分别为220.9 ± 3.2 nm和211.9 ± 1.6 nm。
A549细胞在分别与PBS、空纳米颗粒（empty NPs）、HB-NPs和HB-P-NPs共孵育4小时并接受光照（0至16 J/cm2）后的细胞活力如图1所示。在无光照条件下，HB-NP处理组未表现出任何细胞毒性，而HB-P-NP处理组的细胞活力为81.28 ± 0.14%。这可能是由于紫杉醇从纳米颗粒中释放，发挥了抗癌作用。在光动力治疗（PDT）条件下，HB-NP和HB-P-NP处理组的细胞活力均随光照时间的增加而下降。在相同辐照条件下，HB-P-NP处理组表现出比HB-NP组更强的光毒性。当给予16 J/cm2的辐照时，HB-P-NP处理组中仅有7.52 ± 0.38%的细胞存活。
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讨论
本研究中最关键的步骤是选择合适的激光参数：波长、功率和照射时间。光动力疗法（PDT）需要使用适合特定光敏剂的合适波长。我们采用了630 nm的激光，该波长适用于 hypocrellin B。输出功率是另一个重要因素，根据多次预实验结果，设定为400 mW/cm2。输出功率超过400 mW/cm2时，会因照射本身而损伤细胞或动物的皮肤表面；而低于400 mW/cm2时，功率过弱，无法产生任何治疗效果。体外和体内实验的合适照射时间分别为40秒（16 J/cm2）和500秒（200 J/cm2）。激光光纤与细胞或动物模型肿瘤组织之间的距离也是本研究中的一个关键因素。为使光照覆盖整个细胞或肿瘤表面，发现1 cm为最佳距离。
如果使用不同的光敏剂，选择适当的光波长可使光动力疗法（PDT）的效果最大化。输出功率和照射时间应通过反复试验确定。在光照过程中，若皮肤表面开始出现灼烧现象，应降低输出功率。若光动力治疗后次日肿瘤表面毫无变化，可能提示需要提高输.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由首尔国立大学盆唐医院研究基金资助，项目编号为14-2014-017。
作者感谢东京医科大学名誉教授、首尔国立大学盆唐医院兼职教授 J. Patrick Barron 对本研究的贡献 公益 本稿件的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 寡聚透明质酸 | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30（神经酰胺3B；主要成分为N-油酰基-植鞘氨醇） | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| 己二酸二酰肼 | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺 | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(氯甲基)苯甲酰氯 | Sigma Aldrich | 270784 | |
| 吐温80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| 注射器滤器 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm，RC，PP，0.45 µm |
| 三乙胺 | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex 管 | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| 紫杉醇 | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| 青霉素–链霉素 | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| 硅藻土（过滤剂） | Sigma Aldrich | 6858 | 参见步骤1.4 |
参考文献
- Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
- Huisman, C., et al.
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重印与许可
