本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。
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本文内容
摘要
摘要
透射电子显微镜（TEM）是一种用于研究细胞超微结构的卓越工具，可实现蛋白质定位和大分子复合物的高分辨率可视化。然而，为了尽可能接近细胞的天然状态，必须实现完美的样品保存。例如，传统的电子显微镜（EM）使用醛类固定剂，无法提供良好的超微结构保存效果。固定剂渗透缓慢会导致细胞发生重组并丢失多种细胞组分。因此，传统的EM固定方法无法实现结构和抗原性的瞬时稳定与保存。观察细胞内事件的最佳选择是采用冷冻固定，随后进行冷冻置换固定法，以保持细胞的天然状态。高压冷冻/冷冻置换技术能够保持细胞超微结构的完整性，是目前最常用的方法，但需要昂贵的设备。本文介绍一种适用于悬浮细胞培养物的、简便且低成本的冷冻固定方法，随后进行冷冻置换处理。
引言
样品制备对于任何电子显微镜研究的成功都至关重要。传统的电子显微镜固定方法是用于透射电子显微镜（TEM）组织或细胞固定的首要方法1。首先，在室温下使用醛类和四氧化锇对样品进行化学固定。随后，样品经有机溶剂脱水、渗透并包埋于环氧树脂中。该方法依赖于固定剂向细胞内的渗透速率。因此，通常会观察到细胞内容物的人为假象及提取现象2。
冷冻固定显然是保存细胞结构的更优方法3，可使其保持完整。通过冷冻固定/冷冻置换方法，可在薄树脂切片中获得最高质量的透射电镜（TEM）图像4。该技术的目标是获得无冰晶形成、或所含冰晶足够小而不损伤细胞超微结构的玻璃化生物样品。高压冷冻（HPF）和超快速冷冻固定（也称为浸入式冷冻，PF）是两种冷冻固定的常用方法。HPF 可瞬间固定细胞内的分子，避免传统电镜固定所造成的损伤。目前已开发出多种类型的冷冻设备及自动置换装置5。尽管冷冻设备及相关耗材（液氮、样品载具等）价格昂贵，但其能够生成高质量的电子显微图像6,7。浸入式冷冻（PF）是一种20世纪50年代初期即已使用的技术，文献中描述其操作简单且成本低廉
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方案
1. 甲酸盐网格膜的制备
注意：操作氯仿时须在通风橱内进行，并使用个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。使用400目电子显微镜铜网。若使用其他类型的网格（不同网目大小、金网或镍网），冷冻效果会较差。
- 配制100 mL浓度为0.3%的甲酸膜氯仿溶液。在不搅拌的条件下静置过夜，使其充分溶解。
- 将400目（每平方英寸孔数）的透射电镜铜网（直径3.05 mm）放入盛有丙酮的玻璃小瓶（高3 cm，直径2 cm）中。用手做圆周运动轻轻摇动玻璃瓶。用塑料移液管吸除丙酮，静置让溶剂挥发5分钟。将铜网倾倒至滤纸上，使其干燥5分钟。
- 用无绒布擦拭一块76 × 26 mm2的载玻片，直至表面光亮顺滑，完成抛光。
- 取一个结晶皿（直径15 cm，高7 cm，容量1200 mL），加满蒸馏水。用玻璃棒在水面上来回移动两次，以清除水面灰尘，清洁水面。
- 用手指夹住载玻片，将其浸入甲酸膜溶液中数秒钟。取出后垂直放置，在倒扣的烧杯下干燥5分钟。
- 待薄膜干燥后，用锋利的剃须刀片在载玻片边缘划痕，以界定需从玻片上剥离的薄膜区域。
- 深吸一口气，用力向载玻片呼气，使薄膜表面和下方形成一层水蒸气，令薄膜略显不透明，从而增强其可见性。
- 立即将载玻片以约30°角接触结晶皿中的水面，使薄膜漂浮于水面。让薄膜....
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结果
本文介绍了一种用于超微结构（图1 和 图2）和免疫标记（图3）研究的简便且低成本的浸入式冷冻方法。我们证明，冷冻置换过程无需使用专用设备，且升温过程耗时不到6小时，而使用专用系统则需24小时。
PF/冷冻置换法可改善细胞内结构的保存效果 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） (图1A 和 1D-H), 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） (图1B 和 C), 利什.......
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讨论
透射电子显微镜（TEM）是一种用于细胞器、细胞和组织超微结构观察的强大方法。冷冻固定/冷冻置换是目前保存超微结构和蛋白质抗原性的最佳方法。化学固定剂渗透并作用缓慢，因此在超微结构完全稳定之前可能发生结构重排2。相反，冷冻固定/冷冻置换可瞬间稳定细胞结构4。然而，冷冻固定/冷冻置换技术存在诸多限制和困难，从而限制了其应用范围，包括样品类型、冷冻假象、技术操作难度、成本和设备要求。高压冷冻/冷冻置换技术已实现对细胞细节的高度保存6,7。相比之下，冷冻蚀刻（PF）已用于观察悬浮在非晶态冰薄膜上的微小物体9。本文所述的冷冻蚀刻/冷冻置换方法用于超微结构和免疫标记研究，可提供与高压冷冻图像质量相当的酵母、寄生虫和细菌超微结构的高质量图像。
固定质量取决于冷却速率18。在高冷却速率下，水处.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 M. Bouchecareilh、E. Tétaud、S. Duvezin-Caubet 和 A. Devin 对本文手稿提供的帮助和意见。我们感谢波尔多影像中心电子成像平台提供了图像拍摄支持。本研究工作得到了法国国家科学研究中心的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 载网 | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| 聚乙烯醇缩甲醛（Formvar） | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| 丙烷 N35 | |||
| 液氮 | |||
| 双刃解剖针 | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| 冻存管 | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| 8.5 mL 玻璃小瓶 | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| 醋酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| 丙酮 | Sigma | 32201 | |
| 100% 乙醇 | Sigma | 32221 | |
| 载玻片 | VWR international | 631-9439 | |
| 镊子 | |||
| 丙烯酸树脂 | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| 环氧树脂 M | Sigma | 10951 | |
| 环氧树脂 M 固化剂 | Sigma | 10953 | |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | Sigma | 80102 | |
| 环氧树脂 M 促进剂 | Sigma | 10952 | |
| 结晶皿 | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| 约瑟夫纸（Joseph paper） | VWR international | 111-5009 | |
| 黄铜杯 | 可自行制作或在手工店制作 | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosaccharomyces pombe | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| 密封箱 | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| 空气净化式呼吸器 | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| 呼吸器滤毒盒 | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| 颗粒物过滤器 | Fischer scientific | 3M 5N11 |
参考文献
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixatio....
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重印与许可
