冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

摘要

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。

摘要

透射电子显微镜（TEM）是一种用于研究细胞超微结构的卓越工具，可实现蛋白质定位和大分子复合物的高分辨率可视化。然而，为了尽可能接近细胞的天然状态，必须实现完美的样品保存。例如，传统的电子显微镜（EM）使用醛类固定剂，无法提供良好的超微结构保存效果。固定剂渗透缓慢会导致细胞发生重组并丢失多种细胞组分。因此，传统的EM固定方法无法实现结构和抗原性的瞬时稳定与保存。观察细胞内事件的最佳选择是采用冷冻固定，随后进行冷冻置换固定法，以保持细胞的天然状态。高压冷冻/冷冻置换技术能够保持细胞超微结构的完整性，是目前最常用的方法，但需要昂贵的设备。本文介绍一种适用于悬浮细胞培养物的、简便且低成本的冷冻固定方法，随后进行冷冻置换处理。

引言

样品制备对于任何电子显微镜研究的成功都至关重要。传统的电子显微镜固定方法是用于透射电子显微镜（TEM）组织或细胞固定的首要方法¹。首先，在室温下使用醛类和四氧化锇对样品进行化学固定。随后，样品经有机溶剂脱水、渗透并包埋于环氧树脂中。该方法依赖于固定剂向细胞内的渗透速率。因此，通常会观察到细胞内容物的人为假象及提取现象²。

冷冻固定显然是保存细胞结构的更优方法³，可使其保持完整。通过冷冻固定/冷冻置换方法，可在薄树脂切片中获得最高质量的透射电镜（TEM）图像⁴。该技术的目标是获得无冰晶形成、或所含冰晶足够小而不损伤细胞超微结构的玻璃化生物样品。高压冷冻（HPF）和超快速冷冻固定（也称为浸入式冷冻，PF）是两种冷冻固定的常用方法。HPF 可瞬间固定细胞内的分子，避免传统电镜固定所造成的损伤。目前已开发出多种类型的冷冻设备及自动置换装置⁵。尽管冷冻设备及相关耗材（液氮、样品载具等）价格昂贵，但其能够生成高质量的电子显微图像^6,7。浸入式冷冻（PF）是一种20世纪50年代初期即已使用的技术，文献中描述其操作简单且成本低廉⁸。在 PF 操作过程中，将制备好的样品以极快速度冷冻，以获得小于3至5 nm的冰晶。为此，需将样品浸入液态冷冻剂（如乙烷、丙烷或乙烷-丙烷混合物）中。自20世纪50年代以来，PF 技术不断改进，使其可被更多用户所采用。目前，高压冷冻是唯一可行的方法，可用于冷冻厚度超过50 µm的多种样品（对于盘状样品，厚度可达200 µm）⁵，而 PF 则广泛用于观察小尺寸物体（<100 nm），例如悬浮于非晶态冰薄层中的大分子复合物⁹。较大的样品（如真核细胞）也可通过 PF 进行冷冻固定，但需使用毛细铜管或夹心系统等特殊样品载具^8,10,11。

本文介绍了一种适用于多种悬浮细胞培养物的快速、易用且低成本的浸入式冷冻/冷冻置换技术。

方案

1. 甲酸盐网格膜的制备

注意：操作氯仿时须在通风橱内进行，并使用个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。使用400目电子显微镜铜网。若使用其他类型的网格（不同网目大小、金网或镍网），冷冻效果会较差。

1. 配制100 mL浓度为0.3%的甲酸膜氯仿溶液。在不搅拌的条件下静置过夜，使其充分溶解。
2. 将400目（每平方英寸孔数）的透射电镜铜网（直径3.05 mm）放入盛有丙酮的玻璃小瓶（高3 cm，直径2 cm）中。用手做圆周运动轻轻摇动玻璃瓶。用塑料移液管吸除丙酮，静置让溶剂挥发5分钟。将铜网倾倒至滤纸上，使其干燥5分钟。
3. 用无绒布擦拭一块76 × 26 mm²的载玻片，直至表面光亮顺滑，完成抛光。
4. 取一个结晶皿（直径15 cm，高7 cm，容量1200 mL），加满蒸馏水。用玻璃棒在水面上来回移动两次，以清除水面灰尘，清洁水面。
5. 用手指夹住载玻片，将其浸入甲酸膜溶液中数秒钟。取出后垂直放置，在倒扣的烧杯下干燥5分钟。
6. 待薄膜干燥后，用锋利的剃须刀片在载玻片边缘划痕，以界定需从玻片上剥离的薄膜区域。
7. 深吸一口气，用力向载玻片呼气，使薄膜表面和下方形成一层水蒸气，令薄膜略显不透明，从而增强其可见性。
   1. 立即将载玻片以约30°角接触结晶皿中的水面，使薄膜漂浮于水面。让薄膜从载玻片上自然释放并漂浮至水面，必要时可用镊子轻轻将其剥离。
8. 将铜网正面朝下，轻柔地放置在水面上漂浮的薄膜区域，选择厚度适宜（约10 nm）且无皱褶的区域。
9. 当铜网漂浮在结晶皿水面上时，用Joseph纸覆盖其上，将薄膜捞起。
   1. 用一只手握住Joseph纸，将其一端接触薄膜的一端。等待Joseph纸完全润湿后，连同附着其上的铜网一起取出。
10. 将铜网置于加盖的培养皿中，在室温下存放24小时，完成最终干燥并储存备用。

2. 冷冻置换介质的制备

注意：四氧化锇（OsO₄）和醋酸铀酰为危险化学品。操作时须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。请遵守四氧化锇（OsO₄）和醋酸铀酰的安全操作警示。使用O形圈冷冻管以防止四氧化锇（OsO₄）泄漏。

1. 超微结构研究
   1. 将玻璃安瓿装的四氧化锇（OsO₄）放入玻璃烧瓶中。
   2. 通过摇动烧瓶将安瓿打破。
   3. 加入适量100%丙酮，使终浓度为4%。
   4. 搅拌后，将溶液分装至1.8 mL冻存管中，每管1.5 mL。
2. 蛋白质免疫标记
   1. 将0.05 g醋酸铀置于玻璃烧瓶中。
   2. 加入50 mL 100%丙酮。
   3. 使用磁力搅拌器搅拌溶液；待溶液变澄清后，用0.2 µm滤膜过滤。
   4. 分装至1.8 mL冻存管中，每管1.5 mL。
      注意：在进行 plunge freezing（骤冷）前，应预先准备好含有冷冻置换介质的冻存管，并存放于-84 °C冰箱中。将玻璃烧瓶倒置，将使用过的OsO₄安瓿丢弃至有害废物容器中。

3. 细胞的制备

注意：此步骤对方法的成功至关重要。对于所有细胞类型，培养细胞以获得指定数量的细胞。在指定的离心管中，以规定的时间和速度进行离心。

1. 为获得不同细胞类型的合适沉淀一致性，按如下方法培养细胞：
   1. 对于 Saccharomyces cerevisiae 和 Schizosaccharomyces pombe，将酵母接种于 5 mL 最小或完全液体培养基中。在 28 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物在 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）。将酵母细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.2。继续在 28 °C 下振荡培养，以获得 1 × 10⁹ 个酵母细胞⁷。
   2. 对于 Leishmania flagellum，将寄生虫接种于含 7.5% FCS（胎牛血清）的 5 mL AM 培养基中。在 24 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD₆₀₀。将寄生虫细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.2。继续在 24 °C 下振荡培养，以获得 5 × 10⁸ 个寄生虫细胞¹²。
   3. 对于 Trypanosoma brucei，将寄生虫接种于含 10% FCS 和 30 µg/mL 潮霉素的 5 mL SDM-79 培养基中。在 27 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD₆₀₀。将寄生虫细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.2。继续在 27 °C 下振荡培养，以获得 5 × 10⁸ 个寄生虫细胞¹³。
   4. 对于 Escherichia coli，将细菌接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL DYT 培养基中。在 37 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD₆₀₀。将细菌细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.2。继续在 37 °C 下振荡培养，以获得 5 × 10¹⁰ 个细菌细胞¹⁴。
      注意：过夜培养后，培养物中的细胞可能处于对数生长期或稳定期。生长极为缓慢的细胞株可能需要超过一晚的培养时间，或接种更多数量的细胞，具体应通过实验确定。
2. 对于所有细胞类型，将含有细胞的培养液转移至 50 mL 聚丙烯管中，在 1,500 × g 条件下离心 3 分钟。
3. 弃去上清液，并将所有细胞类型的沉淀重悬于 1 mL 相应的细胞培养基中。
4. 将所有细胞类型在微量离心管中以 3,900 × g 离心 1 分钟，彻底弃去上清液。
5. 将细胞置于冰上保存。

4. 丙烷的液化

注意：操作液氮时需谨慎。使用个人防护装备，包括防冻手套和护目镜。丙烷具有潜在爆炸性，因此应在通风良好的房间或通风橱内进行液化操作。严禁明火。

1. 在聚苯乙烯托盘中倒入约 150 mL 液氮。将一个黄铜杯（高 3.6 cm，直径 2 cm，壁厚 1.5 mm）放入液氮中冷冻。注意不要让液氮进入黄铜杯内部。
2. 等待气泡基本消失，以确保黄铜杯已充分冷冻。
3. 将连接至丙烷气瓶的软管接触黄铜杯的外壁。
4. 缓慢打开丙烷气瓶阀门。
   注意：在此步骤中，丙烷会在黄铜杯内液化。
5. 关闭丙烷气瓶阀门，并迅速移除气体软管，以停止液化过程。
6. 向聚苯乙烯托盘中加入液氮，使液面升至距离黄铜杯顶部约 5 mm 处。注意不要让液氮进入黄铜杯内部。

5. 样品的 plunge 冷冻

1. 在聚苯乙烯托盘中加入约 200 mL 液氮。将小黄铜杯（高 1.5 cm，直径 2.5 cm，厚 1 mm）放入液氮中冷冻。每个悬浮细胞样品使用一个杯子。注意避免样品混淆，为此，将样品 1 放入杯 1，样品 2 放入杯 2，依此类推。
2. 将镊子尖端浸入液氮中，使其冷冻。
3. 将双刃解剖针浸入步骤 3.5 中获得的沉淀物中。
4. 用镊子夹取一个 400 目铜质显微镜载网，该载网已在第 1 节中用火棉胶（formvar）处理过。
5. 使用解剖针，将步骤 3.5 中获得的沉淀物液滴加至载网上。尝试不同体积的液滴（例如 2、5 和 10 µL）。
6. 迅速将由镊子夹持的载网浸入第 4 节中制备的液态丙烷中，并以环形运动搅拌数秒钟。
7. 迅速用镊子将冷冻的载网转移至第 5.1 节中预冷的小黄铜杯中。
   注意：每个样品至少制备 3 个载网。每次取铜网前，务必先将镊子冷冻。

6. 冷冻置换

注意：四氧化锇可能具有挥发性，因此请使用带有蒸气滤芯的空气净化呼吸器。在浸入冷冻前，将固定剂在液氮中冷冻也是一种解决方案。

1. 进行超微结构研究时，打开装有第2.1节制备的冷冻置换介质的1.8 mL冻存管；进行免疫定位研究时，打开装有第2.2节制备的冷冻置换介质的1.8 mL冻存管。将管盖放置在冻存管上。
2. 将镊子尖端浸入液氮中，使其冷冻。
3. 迅速取下管盖，用镊子将冷冻的载网转移至冻存管中。
4. 重新盖上冻存管的管盖。
5. 对每个样品的所有载网重复上述操作。
6. 拧紧所有管盖，并用手做圆周运动轻轻摇动冻存管，确保样品完全浸入冷冻置换介质中。
7. 将冻存管放入密封盒中，在-84 °C冰箱中放置3天，以完成冷冻置换过程。

7. 样品复温

1. 超微结构研究
   1. 将冻存管置于聚苯乙烯托盘中（以避免温度突然升高），转移至 -30 °C 冰箱，于 -30 °C 冰箱中放置 1 小时。
   2. 将冻存管转移至 -15 °C 冰箱中放置 2 小时，随后将样品置于 4 °C 环境中 2 小时，再于室温下放置 30 分钟。
   3. 使用塑料移液管移除冷冻置换介质，加入约 500 µL 的 100% 丙酮。
   4. 用手做圆周运动搅动 1.8 ml 冻存管，迅速将含有载网的丙酮（1.5 mL）倒入玻璃管（高 3 cm，直径 2 cm）中。
   5. 用 1 mL 的 100% 丙酮冲洗同一冻存管，确保所有载网均已转移；用手做圆周运动搅动冻存管，然后将内容物倒入玻璃管中。
   6. 用 3 mL 的 100% 丙酮对每个玻璃管分别冲洗 3 次，每次 10 分钟。
   7. 按照参考文献¹⁵中所述进行包埋和包埋处理：使用丙酮中浓度递增的环氧树脂（25%、50% 和 75%）对样品进行浸透，并用 100% 环氧树脂在明胶胶囊中包埋样品。
2. 免疫标记研究
   1. 将 1.8 mL 冻存管置于聚苯乙烯托盘中（以避免温度突然升高），转移至 -30 °C 冰箱。
   2. 将冻存管在 -30 °C 冰箱中放置 2 小时。
   3. 在 -30 °C 冰箱中，用手做圆周运动搅动冻存管，迅速将冷冻置换介质倒入聚丙烯管（高 5 cm，直径 1.5 cm）中。
   4. 用 2 mL 新鲜的冷冻置换介质替换原有介质。
   5. 将聚丙烯管置于 -30 °C 冰箱中 2 小时。
   6. 用 2 mL 的 100% 丙酮冲洗聚丙烯管 1 小时，再用 2 mL 的 100% 乙醇冲洗 3 次，每次 1 小时。
   7. 按照参考文献¹⁵中所述进行包埋和包埋处理：使用丙酮中浓度递增的丙烯酸树脂（25%、50% 和 75%）对样品进行浸透，并用 100% 丙烯酸树脂在明胶胶囊中包埋样品。

8. 样品的可视化

1. 包埋后，使用超薄切片机将样品切成80 nm的超薄切片。在室温下用2%柠檬酸铅染色1分钟¹⁵。
2. 使用80 kV或120 kV的透射电子显微镜观察切片¹⁵。

结果

本文介绍了一种用于超微结构（图1 和 图2）及免疫标记（图3）研究的简便且低成本的浸入式冷冻方法。我们证明，冷冻置换过程无需使用专用设备，且复温过程耗时不到6小时，而使用专用系统则需24小时。

PF/冷冻置换法可改善细胞内结构的保存效果 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） (图1A 和 1D-H), 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） (图1B 和 C), 利什...

讨论

透射电子显微镜（TEM）是一种用于细胞器、细胞和组织超微结构观察的强大方法。冷冻固定/冷冻置换是目前保存超微结构和蛋白质抗原性的最佳方法。化学固定剂渗透并作用缓慢，因此在超微结构完全稳定之前可能发生结构重排²。相反，冷冻固定/冷冻置换可瞬间稳定细胞结构⁴。然而，冷冻固定/冷冻置换技术存在诸多限制和困难，从而限制了其应用范围，包括样品类型、冷冻假象、技术操作难度、成本和设备要求。高压冷冻/冷冻置换技术已实现对细胞细节的高度保存^6,7。相比之下，冷冻蚀刻（PF）已用于观察悬浮在非晶态冰薄膜上的微小物体⁹。本文所述的冷冻蚀刻/冷冻置换方法用于超微结构和免疫标记研究，可提供与高压冷冻图像质量相当的酵母、寄生虫和细菌超微结构的高质量图像。

固定质量取决于冷却速率¹⁸。在高冷却速率下，水处...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
载网	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）	Electron Microscopy Sciences	15800
丙烷 N35
液氮
双刃解剖针	Electron Microscopy Sciences	72947
冻存管	Electron Microscopy Sciences	61802-02
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19130
8.5 mL 玻璃小瓶	Electron Microscopy Sciences	64252
醋酸铀酰	Electron Microscopy Sciences	48851
丙酮	Sigma	32201
100% 乙醇	Sigma	32221
载玻片	VWR international	631-9439
镊子
丙烯酸树脂	Electron Microscopy Sciences	104371
环氧树脂 M	Sigma	10951
环氧树脂 M 固化剂	Sigma	10953
邻苯二甲酸二丁酯	Sigma	80102
环氧树脂 M 促进剂	Sigma	10952
结晶皿	Fischer scientific	08-762-9
约瑟夫纸（Joseph paper）	VWR international	111-5009
黄铜杯			可自行制作或在手工店制作
Saccharomyces cerevisiae
Shizosaccharomyces pombe
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
密封箱	Fischer scientific	7135-0001
空气净化式呼吸器	Fischer scientific	3M 7502
呼吸器滤毒盒	Fischer scientific	3M 6001
颗粒物过滤器	Fischer scientific	3M 5N11