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使用化学发光法测定生物材料中一氧化氮通路代谢物亚硝酸盐和硝酸盐的含量

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DOI：

10.3791/54879

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2016年12月25日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine Branch, NIDDK, NIH

本文内容

摘要

一氧化氮（NO）是血管稳态中一种重要的信号分子。NO的生成 体内 过低而无法直接测量。化学发光为研究一氧化氮循环提供了有价值的见解 通过 测量其前体物质及氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐。文中阐述了亚硝酸盐/硝酸盐在机体组织和体液中的测定方法。

摘要

一氧化氮（NO）是血管稳态的主要调节分子之一，同时也是一种神经递质。酶促生成的NO通过与多种含氧血红素蛋白及其他尚未完全明确的途径相互作用，被氧化为亚硝酸盐和硝酸盐。过去十年中，哺乳动物体内亚硝酸盐和硝酸盐还原为NO的逆向过程被发现，并逐渐引起关注，被认为是预防或缓解一系列心血管、代谢及肌肉系统疾病（这些疾病被认为与NO水平降低相关）的潜在途径之一。因此，准确评估NO及其代谢产物在不同机体区室（如血液、体液及各种组织）中的含量具有重要意义。由于血液易于获取，成为检测NO代谢产物的首选样本。然而，由于NO在血液中寿命极短（数毫秒）且浓度极低（亚纳摩尔水平），对血液中NO进行直接、可靠的测定极为困难。 体内 存在较大的技术难度。因此，通常通过检测其氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐的含量来间接评估一氧化氮的可用性。这两种代谢物通常需分别测定。目前已有多种成熟方法用于测定生物体液和组织中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。本文提供了一种基于化学发光法（CL）的实验方案，该方法通过三碘化物或氯化钒(III)溶液分别还原亚硝酸盐或硝酸盐，再利用分光光度法检测生成的一氧化氮。该法对亚硝酸盐和硝酸盐的检测灵敏度可达低纳摩尔范围，使其成为目前检测一氧化氮代谢通路变化最灵敏的方法。本文详细阐述了如何处理生物体液和组织样本，以保存采集时样本中原有的亚硝酸盐和硝酸盐含量，并说明了如何准确测定其各自浓度。同时，也对化学发光法的技术局限性进行了说明。

引言

血液中的亚硝酸盐以及（程度较轻的）硝酸盐水平反映了体内一氧化氮代谢的整体状态。血液及大多数器官和组织中的亚硝酸盐浓度仅处于较高的纳摩尔或较低的微摩尔范围，而硝酸盐通常含量要高得多，处于微摩尔范围。由于疾病进展或饮食习惯改变所引起的亚硝酸盐水平变化非常微小，必须采用极为灵敏的方法才能检测。由于亚硝酸盐和硝酸盐的浓度水平差异显著且代谢过程不同，分别测定两者的浓度至关重要。将亚硝酸盐和硝酸盐合并测定的所谓"NOx测定"方法价值甚微。

已开发出多种用于定量各种生物样品中亚硝酸盐的方法，其中最常用的是基于1879年首次描述的格里斯（Griess）反应的最古老方法。即使经过现代改进，格里斯法对亚硝酸盐的检测灵敏度仍仅能达到低微摩尔浓度范围。化学发光法（CL）结合三碘化物还原溶液目前被认为是最灵敏的方法，可实现低纳摩尔浓度范围内亚硝酸盐的定量1-8,10,11。相同的化学发光法若结合三氯化钒还原溶液，则可用于硝酸盐的高灵敏度测定，其精度可达纳摩尔浓度范围9。

化学发光法（CL）可检测游离的NO气体。因此，亚硝酸盐、硝酸盐、R-亚硝基硫醇（R-SNO）、R-亚硝胺（R-NNO）或金属-NO化合物（在本文稿中统称为 "R-(X)-NO"）必须首先转化为游离的NO气体，才能通过CL法定量其原始含量。根据NO代谢物的性质，可采用多种不同的还原溶液实现其向NO的转化。转化后，游离的NO气体由载气（He、N2 或 Ar）从反应容器中吹出，进入CL分析仪的反应室，在其中与臭氧（O3）反应生成处于激发态的二氧化氮（NO2）。当NO2*返回基态时，会在红外区发射光子，该光子由CL仪器的光电倍增管（PMT）检测。所发射光的强度与反应室中NO的浓度成正比，因此可通过适当的校准曲线计算出原始物质的浓度。

在本实验方案中，我们首先介绍基于化学发光法（CL）检测临床最常用样本——血液和血浆中亚硝酸盐和硝酸盐的方法，随后讨论如何在组织样本中测定这些离子。我们还详细说明了如何在亚硝酸盐易发生反应的环境（如血液及其组分、血浆和红细胞）中保持原有的生理亚硝酸盐浓度。

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方案

所有涉及动物使用的实验方案均已获得美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）动物护理与使用委员会的批准，人类血液样本则来自美国国立卫生研究院（NIH）血库的健康供体。

1. 样品制备

  1. 亚硝酸盐保存液的配制
    1. 在蒸馏水中配制含有890 mM 铁氰化钾（K3Fe(CN)6）和118 mM NEM（N-乙基马来酰亚胺）的溶液。充分溶解至溶液呈澄清黄色，无晶体残留。按1:9（v/v，NP-40/溶液）的比例加入NP-40（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）。轻轻混匀以避免起泡，并于4 °C保存约一周。
  2. 血液样本的采集与处理
    1. 使用至少20 G的针头采集血液，以避免溶血，并加入肝素（5 U/ml）防止凝固。对于全血样本，立即按1:4（v/v，溶液/血液）的比例将血液与亚硝酸盐保存液混合。
    2. 对于血浆和红细胞样本，将采集的血液在4 °C下以4,000 × g离心5分钟，以分离红细胞（RBC）和血浆。取上清液（血浆），按上述方法与亚硝酸盐保存液混合，用于测定血浆中的亚硝酸盐水平。
    3. 小心移除样本中残留的血浆和白细胞层，使用剪切过的移液器吸头从管底吸取红细胞样本，以避免其他类型血细胞的污染，并将其转移至含有亚硝酸盐保存液的试管中，比例同上。
    4. 将每份样本（血浆和红细胞）与冷甲醇按1:1或1:2（v/v，样本/甲醇）的比例混合，并在4 °C下以13,000 × g离心15分钟，以沉淀蛋白质。取上清液用于亚硝酸盐测定；如需保存，可将制备好的样本在干冰上速冻后于-80 °C储存。
      注意：亚硝酸盐在血液中会迅速与氧合血红蛋白（oxyHb）反应生成硝酸盐。由于oxyHb在血液中始终远过量于亚硝酸盐，该反应可在约10分钟内几乎完全消耗内源性亚硝酸盐。为了最大程度保留内源性血液亚硝酸盐，应在采血后立即向全血样本中加入亚硝酸盐保存液。该溶液可迅速裂解红细胞，并将oxyHb氧化为高铁血红蛋白（metHb），后者是血红蛋白的非活性形式，不与亚硝酸盐发生化学反应。
  3. 其他类型体液样本的制备
    1. 将样本采集至适当容器后，立即与亚硝酸盐保存液充分混合，去蛋白后立即测定亚硝酸盐含量；如需保存，可将样本在干冰上速冻后于-80 °C储存。
  4. 组织样本的采集与处理
    1. 从经肝素化生理盐水（每毫升含肝素10 U）灌注的动物中采集组织，切取约1 g目标组织，使用手动或自动匀浆器进行匀浆处理。
    2. 根据需要加入适量的亚硝酸盐保存液，以获得均匀的匀浆液。
    3. 组织匀浆完成后，按上述方法加入冷甲醇（1:1或1:2，v/v，样本/甲醇）沉淀蛋白质，然后在4 °C下以13,000 × g离心15分钟。
    4. 收集上清液并测定亚硝酸盐水平。如需保存，可在制备过程中的任何阶段将样本在干冰上速冻后于-80 °C储存。

2. 还原溶液的配制

  1. 三碘化物（I₃⁻）3用于亚硝酸盐和R-(X)-NO物种测定的还原溶液1,3,4
    1. 配制含有301 mM KI和138 mM I的溶液2 水溶液。按2:7的体积比（溶液：冰醋酸）在磁力搅拌器上混合，搅拌约30分钟，直至所有晶体完全溶解。建议保存于避光瓶中，因碘化物对光敏感，并在配制后一周内使用完毕。
      注意： 该溶液可将亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO），并能从R-SNO、R-NNO和Fe-NO功能基团（R-(X)-NO）中释放NO，但对硝酸盐无影响。通过用酸化磺胺（AS）处理一半样品，并比较AS处理与未处理样品的信号，可将上述NO功能基团产生的信号与真正的亚硝酸盐信号区分开。AS与亚硝酸盐不可逆地形成重氮阳离子，该复合物不能被I⁻还原。3 溶液。对于AS处理，配制290 mM的磺胺在1 M HCl中的溶液，并按1:9（v/v，AS/样品）的比例加入样品等分试样中。分别测定经AS处理和未处理样品部分的化学发光信号。通过计算AS处理与未处理样品部分信号的差值，得到真实的亚硝酸盐信号。亚硝酸盐也可使用选择性亚硝酸盐还原的抗坏血酸/乙酸混合溶液进行测定，方法见第2.2部分。然而，由于样品中通常存在的R-(X)-NO物种含量较少，因此在大多数情况下，使用未经AS处理的样品测定结果已能很好地近似总亚硝酸盐含量。
  2. 用于亚硝酸盐选择性测定的抗坏血酸/乙酸（4A）溶液2
    1. 将500 mM抗坏血酸水溶液与冰醋酸按1:7（v/v，抗坏血酸/醋酸）的体积比混合，制备反应混合液。
      注意： 该溶液对亚硝酸盐具有特异性，不会从任何R-(X)-NO类物质或硝酸盐中释放一氧化氮。然而，抗坏血酸与乙酸溶液必须在每次测量前每日新鲜配制，因为抗坏血酸在溶液中容易被氧化。
      亚硝酸盐还原反应的完成程度取决于抗坏血酸的浓度；建议使用至少 50 mM 的抗坏血酸以实现血浆中亚硝酸盐的完全还原。然而，在最终样品测定之前，建议先进行若干次预实验，使用预期亚硝酸盐浓度范围内的不同浓度抗坏血酸和亚硝酸盐标准品进行优化。需注意，抗坏血酸在测定过程中会略有消耗，因此建议频繁更换玻璃反应室中的反应混合液。
  3. 用于硝酸盐测定的三氯化钒还原溶液9
    1. 制备 51 mM 的 VCl 溶液3 在1 M HCl中溶解，经200 μm滤膜过滤后，储存于避光瓶中，两周内使用。
      注意： 该溶液可还原硝酸盐、亚硝酸盐及所有R-(X)-NO类物质，因此若样品中同时存在与硝酸盐相当浓度的亚硝酸盐或其他R-(X)-NO类物质，则最终硝酸盐含量需通过氯化钒（VCl）处理前后化学发光信号的差值进行计算。3 我3 还原溶液

3. 化学发光（CL）分析仪的设置与测量

  1. 标准溶液
    1. 配制 1 μM 的亚硝酸钠（NaNO2）溶液。该溶液可用于亚硝酸盐和硝酸盐的测定。
  2. 使用 NO 分析仪
    注意：目前有两种 commercially available 的 NO 分析仪灵敏度足以用于生物学研究——Sievers NOA 和 Ecophysics CLD 88Y。两者工作原理相同；主要区别在于 CLD 88Y 利用室内空气中的氧气生成臭氧（O3），而 NOA 需要外接氧气瓶来实现此目的。以下步骤描述的是 Sievers NOA 的设置。
    1. 仪器设置
      1. 根据制造商的建议进行 NO 分析仪的初始设置，参见 图 1。
      2. 打开连接至仪器的 O2 气瓶。从前面板主菜单中选择 "analysis" 和 "enter"。在下一屏幕中选择 "start" 并按下 "enter"。将酸阱（内含 1 M NaOH）连接至仪器，参见 图 1。
      3. 等待光电倍增管冷却至温度低于 -12 °C，且反应室被抽真空至 6 Torr。达到稳定平坦基线约需 30 分钟。基线需在 1–2 mV 范围内稳定，其稳定性比名义数值更为重要。
        注意：若测定硝酸盐，需开启冷却水浴（设定为 4 °C，用作酸和水蒸气的冷阱）和加热水浴（主反应室，95 °C）。硝酸盐在 VCl3 溶液中还原为 NO 的速率具有温度依赖性，在室温下反应极慢，因此需要显著提高温度才能观察到反应。
      4. 打开 He 气瓶，并将玻璃反应室连接至酸阱，参见 图 1。向反应室中加入适量的还原溶液，将鼓泡速率降至最低，然后将反应室连接至酸阱。通过试错法调节 He 鼓泡速率，使其与仪器的抽吸速率匹配（通常 Sievers NOA 约为 ~200 ml/min）。
      5. 开启控制仪器的计算机，并启动基于 Labview 的 Liquid 软件。要开启仪器与采集软件之间的通信，请在 "data menu" 中反复按下 "enter"，直到屏幕显示 "output enabled"，然后按下 "clear" 返回数据界面。
      6. 等待屏幕上出现稳定的基线信号，然后通过隔垫将样品和亚硝酸盐标准品注入还原溶液中。每次峰出现后，必须等待基线恢复稳定，此过程可能需要长达 2 分钟。Liquid 软件具有 "mark" 注射时间的功能，并可对注射进行注释，这些注释将导出至一个独立文件（filename.info），作为数据文件（filename.data）的有用补充。
      7. 完成样品和标准品测量后，在 Liquid 软件菜单中选择 "stop" 选项——这会将临时文件中的数据写入名为 "filename.data" 的永久文件中。选择 "abort" 选项将终止测量，但不会将采集的数据写入永久文件。
      8. 结束实验时，关闭反应器顶部的旋塞，断开酸阱与反应器之间的管路（参见 图 1），使仪器与反应容器分离。随后关闭 NOA 分析仪——按下 "clear"，进入 "analysis"，将仪器置于 "standby" 状态，并 "confirm" 待机。若频繁使用，仪器可在待机模式下维持数周。关闭氧气供应。然后将还原溶液从反应室中冲洗干净，断开 He 气瓶与玻璃反应器的连接，并完成反应器的清洗。
    2. 标准品与样品注射
      1. 使用清洗干净的 Hamilton 注射器，向反应混合物中注入 50 µl 的 1 µM 亚硝酸盐溶液。每次注射之间至少等待 1–2 分钟，以确保峰的良好分离。对每个数据点重复注射 50 µl 以获得重复值。每次注射后用去离子水清洗注射器。
      2. 为获得完整的标准曲线数据，继续对 1 µM 亚硝酸盐溶液进行 100、150 µl 的重复注射（若预期亚硝酸盐或硝酸盐浓度较高，可能还需额外进行 200 µl 的注射）。每种情况下，均需确保信号回落至基线，并再采集 1–2 分钟的基线，以实现峰的良好分离。
        注意：亚硝酸盐标准品可在实验过程中的任意时间进行测定。但建议在数据测量前完成标准曲线的测定，因其也可作为仪器功能的独立验证。
        采集数据时，所注入的样品量应产生明显可辨的峰。但需注意，光电倍增管的线性范围仅到约 800 mV，因此任何峰高均不应超过约 700 mV。可通过减少注入样品量或用去离子水稀释样品来实现。每个数据点至少应进行两次重复测定。

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结果

图2展示了从标准品和五个不同样品中获得的代表性结果。如图所示，在含亚硝酸盐的溶液（标准品或样品）被注入还原溶液后，光电倍增管电压立即上升（曲线下方的红色箭头表示进样时间），当注入溶液中的所有亚硝酸盐被完全还原后，电压恢复至基线水平。从该图还可明显看出，精确的体积测量对于获得高度可重复的数据至关重要。我们建议使用精密Hamilton注射器来量取进样体积。I3（或抗坏血酸或VCl3）溶液还原能力的下降是另一个常见的误差来源。通常情况下，当峰的基线宽度开始显著展宽时，需更换反应室中的还原溶液。峰宽取决于进入NOA反应室（图1中标记为RC）的气体流量，且在不同实验装置之间略有差异。我们认为亚硝酸盐测定时正常的峰宽约为1分钟，硝酸盐测定时可达2分钟。

为了将光电倍增管的信号与检测到的NO量关联起来，需构建标准曲线，即以峰下面积对注入的亚硝酸盐量（以pm...

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讨论

方案中的关键步骤

用于制备、稀释或处理原始样品的所有溶液（包括水）均需保留等分试样，并检测其中是否可能含有亚硝酸盐或（更常见）硝酸盐污染。我们发现，大多数污染来源于水，而用于处理样品的许多化学试剂（尤其是铁氰化物）在某些批次中也含有显著量的硝酸盐污染，会干扰内源性硝酸盐的测定。因此，在常规实验中使用前，我们会对所有化学试剂进行亚硝酸盐和硝酸盐污染物的检测。

由于样品在处理过程中可能经历多次显著稀释，所有样品操作均需记录，以便进行最终浓度计算。该步骤是本实验方案中最容易出错的部分。

在处理用于亚硝酸盐测定的样品时，应迅速将样品转移至亚硝酸盐保护液中，这一点至关重要，特别是当样品中含有血红素蛋白（如血红蛋白）时，此类蛋白会与亚硝酸盐反应并将其氧化为硝酸盐。样品经稳定处理后，可在测定前长期冷冻保存。

生物样品中多种一氧化氮（NO）代谢物的含量非常低，尤其是R-X-NO，有时生成的NO水平接近NOA分析仪的背景噪声水平。若需检测此...

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披露

Alan Schechter 博士被列为美国国立卫生研究院（NIH）授予的多项专利的共同发明人，这些专利涉及使用亚硝酸盐治疗心血管疾病。他根据 NIH 将这些专利许可用于临床开发而获得专利使用费，但无其他报酬。

致谢

作者希望感谢 A. Dejam 博士和 M. M. Pelletier 在开发用于血液中亚硝酸盐测定的亚硝酸盐保存液方面所做出的重要贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铁氰化钾；K3Fe(CN)6Sigma702587
NEM；N-乙基马来酰亚胺Sigma4260
NP-40；4-壬基苯基聚乙二醇Sigma74385
磺胺；AS SigmaS9251
HClSigmaH1758
冰醋酸SigmaA9967
抗坏血酸 SigmaA7506
碘化钾；KISigma60399
碘；I2Sigma207772避光，有毒
亚硝酸钠；NaNO2Sigma563218
三氯化钒；VCl3Sigma208272避光，有毒
GentleMacMiltenyi
Sievers NOA 280iGE
CLD 88Y Ecophysics 

参考文献

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  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
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