一氧化氮（NO）是血管稳态中一种重要的信号分子。NO的生成 体内 过低而无法直接测量。化学发光为研究一氧化氮循环提供了有价值的见解 通过 测量其前体物质及氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐。文中阐述了亚硝酸盐/硝酸盐在机体组织和体液中的测定方法。
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摘要
摘要
一氧化氮（NO）是血管稳态的主要调节分子之一，同时也是一种神经递质。酶促生成的NO通过与多种含氧血红素蛋白及其他尚未完全明确的途径相互作用，被氧化为亚硝酸盐和硝酸盐。过去十年中，哺乳动物体内亚硝酸盐和硝酸盐还原为NO的逆向过程被发现，并逐渐引起关注，被认为是预防或缓解一系列心血管、代谢及肌肉系统疾病（这些疾病被认为与NO水平降低相关）的潜在途径之一。因此，准确评估NO及其代谢产物在不同机体区室（如血液、体液及各种组织）中的含量具有重要意义。由于血液易于获取，成为检测NO代谢产物的首选样本。然而，由于NO在血液中寿命极短（数毫秒）且浓度极低（亚纳摩尔水平），对血液中NO进行直接、可靠的测定极为困难。 体内 存在较大的技术难度。因此，通常通过检测其氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐的含量来间接评估一氧化氮的可用性。这两种代谢物通常需分别测定。目前已有多种成熟方法用于测定生物体液和组织中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。本文提供了一种基于化学发光法（CL）的实验方案，该方法通过三碘化物或氯化钒(III)溶液分别还原亚硝酸盐或硝酸盐，再利用分光光度法检测生成的一氧化氮。该法对亚硝酸盐和硝酸盐的检测灵敏度可达低纳摩尔范围，使其成为目前检测一氧化氮代谢通路变化最灵敏的方法。本文详细阐述了如何处理生物体液和组织样本，以保存采集时样本中原有的亚硝酸盐和硝酸盐含量，并说明了如何准确测定其各自浓度。同时，也对化学发光法的技术局限性进行了说明。
引言
血液中的亚硝酸盐以及（程度较轻的）硝酸盐水平反映了体内一氧化氮代谢的整体状态。血液及大多数器官和组织中的亚硝酸盐浓度仅处于较高的纳摩尔或较低的微摩尔范围，而硝酸盐通常含量要高得多，处于微摩尔范围。由于疾病进展或饮食习惯改变所引起的亚硝酸盐水平变化非常微小，必须采用极为灵敏的方法才能检测。由于亚硝酸盐和硝酸盐的浓度水平差异显著且代谢过程不同，分别测定两者的浓度至关重要。将亚硝酸盐和硝酸盐合并测定的所谓"NOx测定"方法价值甚微。
已开发出多种用于定量各种生物样品中亚硝酸盐的方法，其中最常用的是基于1879年首次描述的格里斯（Griess）反应的最古老方法。即使经过现代改进，格里斯法对亚硝酸盐的检测灵敏度仍仅能达到低微摩尔浓度范围。化学发光法（CL）结合三碘化物还原溶液目前被认为是最灵敏的方法，可实现低纳摩尔浓度范围内亚硝酸盐的定量1-8,10,11。相同的化学发光法若结合三氯化钒还原溶液，则可用于硝酸盐的高灵敏度测定，其精度可达纳摩尔浓度范围9。
化学发光法（CL）可检测游离的NO气体。因此，亚硝酸盐、硝酸盐、R-亚硝基硫醇（R-SNO）、R-亚硝胺（R-NNO）或金属-NO化合物（在本文稿中统称为 "R-(X)-NO"）必须首先转化为游离的NO气体，才能通过CL法定量其原始含量。根据NO代谢物的性质，可采用多种不同的还原溶液....
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方案
所有涉及动物使用的实验方案均已获得美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）动物护理与使用委员会的批准，人类血液样本则来自美国国立卫生研究院（NIH）血库的健康供体。
1. 样品制备
- 亚硝酸盐保存液的配制
- 在蒸馏水中配制含有890 mM 铁氰化钾（K3Fe(CN)6）和118 mM NEM（N-乙基马来酰亚胺）的溶液。充分溶解至溶液呈澄清黄色，无晶体残留。按1:9（v/v，NP-40/溶液）的比例加入NP-40（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）。轻轻混匀以避免起泡，并于4 °C保存约一周。
- 血液样本的采集与处理
- 使用至少20 G的针头采集血液，以避免溶血，并加入肝素（5 U/ml）防止凝固。对于全血样本，立即按1:4（v/v，溶液/血液）的比例将血液与亚硝酸盐保存液混合。
- 对于血浆和红细胞样本，将采集的血液在4 °C下以4,000 × g离心5分钟，以分离红细胞（RBC）和血浆。取上清液（血浆），按上述方法与亚硝酸盐保存液混合，用于测定血浆中的亚硝酸盐水平。
- 小心移除样本中残留的血浆和白细胞层，使用剪切过的移液器吸头从管底吸取红细胞样本，以避免其他类型血细胞的污染，并将其转移至含有亚硝酸盐保存液的试管中，....
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结果
图2展示了从标准品和五个不同样品中获得的代表性结果。如图所示，在含亚硝酸盐的溶液（标准品或样品）注入还原溶液后，光电倍增管电压立即上升（曲线下方的红色箭头指示注入时间），当注入溶液中的亚硝酸盐完全被还原后，电压恢复至基线水平。从该图还可明显看出，精确的体积测量对于获得高度可重复的数据至关重要。我们建议使用精密Hamilton注射器来量取注入体积。I3（或抗坏血酸或VCl3）溶液还原能力的下降是另一个常见的误差来源。通常情况下，当峰的基线宽度开始显著变宽时，反应室中的还原溶液就需要更换。峰宽取决于进入NOA反应室（图1中标记为RC）的气体流量，不同实验装置之间会略有差异。我们认为亚硝酸盐测定时的正常峰宽约为1分钟，硝酸盐测定时可达2分钟。
为了将光电倍增管的信号与检测到的NO量相关联，需构建标准曲线，即以峰下面积对注入的亚硝酸盐量（以pmol计.......
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讨论
方案中的关键步骤
用于制备、稀释或处理原始样品的所有溶液（包括水）均需保留等分试样，并检测其中是否可能含有亚硝酸盐或（更常见）硝酸盐污染。我们发现，大多数污染来源于水，而用于处理样品的许多化学试剂（尤其是铁氰化物）在某些批次中也含有显著量的硝酸盐污染，会干扰内源性硝酸盐的测定。因此，在常规实验中使用前，我们会对所有化学试剂进行亚硝酸盐和硝酸盐污染物的检测。
由于样品在处理过程中可能经历多次显著稀释，所有样品操作均需记录，以便进行最终浓度计算。该步骤是本实验方案中最容易出错的部分。
在处理用于亚硝酸盐测定的样品时，应迅速将样品转移至亚硝酸盐保护液中，这一点至关重要，特别是当样品中含有血红素蛋白（如血红蛋白）时，此类蛋白会与亚硝酸盐反应并将其氧化为硝酸盐。样品经稳定处理后，可在测定前长期冷冻保存。
生物样品中多种一氧化氮（NO）代谢物的含量非常低，尤其是R-X-NO，有时生成的NO水平接近NOA分析仪的背景噪声水平。若需检测此.......
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披露
Alan Schechter 博士被列为美国国立卫生研究院（NIH）授予的多项专利的共同发明人，这些专利涉及使用亚硝酸盐治疗心血管疾病。他根据 NIH 将这些专利许可用于临床开发而获得专利使用费，但无其他报酬。
致谢
作者希望感谢 A. Dejam 博士和 M. M. Pelletier 在开发用于血液中亚硝酸盐测定的亚硝酸盐保存液方面所做出的重要贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铁氰化钾；K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM；N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | 4260 | |
| NP-40；4-壬基苯基聚乙二醇 | Sigma | 74385 | |
| 磺胺；AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| 冰醋酸 | Sigma | A9967 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A7506 | |
| 碘化钾；KI | Sigma | 60399 | |
| 碘；I2 | Sigma | 207772 | 避光，有毒 |
| 亚硝酸钠；NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| 三氯化钒；VCl3 | Sigma | 208272 | 避光，有毒 |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
参考文献
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measure....
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重印与许可
