结合干湿实验室技术指导大型卷曲螺旋含有蛋白质的结晶

摘要

我们描述了一个框架，该框架结合了简单的生化和计算分析，以指导大型卷曲螺旋结构域的表征和结晶。该框架可适用于球状蛋白质，也可扩展为包含各种高通量技术。

摘要

对于任何蛋白质来说，获得用于结构测定的晶体都是一个困难且耗时的命题。卷曲螺旋蛋白和结构域遍布自然界，然而，由于它们的物理特性和聚集倾向，它们传统上被认为特别难以结晶。在这里，我们利用各种快速简单的技术来识别给定卷曲螺旋蛋白的一系列可能的结构域边界，然后快速表征这些蛋白质在溶液中的行为。通过添加强荧光标签 （mRuby2），蛋白质表征变得简单明了。在正常光照下可以很容易地看到目标蛋白质，并且可以使用适当的成像仪进行定量。目标是快速识别可以从结晶管道中删除的候选基因，因为它们不太可能成功，从而为最佳候选基因提供更多时间，并减少在不产生晶体的蛋白质上花费的资金。该工艺可以迭代以整合从初始筛选工作中获得的信息，可以适应高通量表达和纯化程序，并通过结晶的机器人筛选得到增强。

引言

通过X射线晶体结构测定作出了现代生物学的各个领域基础性的贡献;提供支持生活以及他们如何与在各种情况下彼此相互作用的大分子的原子视图;让我们来了解导致疾病和提供机会来合理设计药物来治疗疾病的机制。晶体早已确定大分子结构的主要实验技术，目前占结构数据库（www.rcsb.org）的89.3％。这种技术有很多优点，包括非常高的分辨率的潜力，以可视化的大分子具有宽范围的尺寸，相对容易收集数据，并以可视化的大分子如何与溶剂以及配体相互作用的机会的能力。

尽管在重组蛋白表达^1,2，PUR众多技术改进ification ^3，并用于产生这些系统^4，在结晶过程中的最大障碍分子生物学仍然生长衍射质量晶体的能力。这一直是尤其如此，它含有大量的卷曲螺旋结构域的蛋白。据估计，所有氨基酸的多达5％的卷曲线圈^5,6内发现的，使之成为一个非常常见的结构特征^7，但这些蛋白质通常更难以纯化和结晶比球状蛋白^8-10 。这是由以下事实卷曲螺旋结构域通常是一个较大的蛋白质的范围内发现，因此正确预测这些结构域的边界是至关重要的，以避免非结构化的或柔性的序列，其通常是有害的结晶的包含进一步加剧。

在这里，我们提出了一个概念框架，结合基于网络的计算与分析experimenta如何选择结构的研究，以及如何准备和结晶前尝试表征蛋白质样品的蛋白质片段（S）:从替补l数据，通过结晶过程的初始阶段，包括帮助指导用户。我们我们的分析集中在含有大量卷曲螺旋域的两种蛋白质，蘑菇时（SHRM）和Rho激酶（岩）。这些蛋白质被选择，因为它们都包含卷曲螺旋域，并且已知以形成生物相关复杂^11-16。蘑菇时和Rho激酶（岩）被预测分别含有卷曲螺旋的〜200和680个残基，多个部分，其中已被结构^17-20表征。这里所描述的方法提供了一种改进的工作流程，以快速识别含蛋白卷曲螺旋的片段，就可以经得起为结晶，然而，所描述的技术可以很容易地适于大多数蛋白或蛋白复合物或修改，以结合高通量approaCHES为可用。最后，这些方法通常是廉价的，并且可以由用户在几乎所有经验水平来执行。

方案

注:概念框架或工作流的示意图在图1中被描述以供参考。该协议可以被分解成四个阶段:计算或基于序列的预测，蛋白质表达和纯化，生化特性和结晶。示出的实施例分析蘑菇时SD2域和/或蘑菇时摇滚络合物，但可以与任何蛋白质被利用。

1.使用建立基于Web的工具来生成卷曲螺旋域边界的计算预测

1. 收集的进化多样化序列同系物。
   1. 转到www.uniprot.org并在上部搜索栏中输入蘑菇时。
   2. 选择序列通过检查旁边的登录号框下载。用星序列指示由UNIPROT审查序列并且通常更加可靠。请注意，以确保所有的序列完整，准确。
   3. 保存选定S通过单击下载按钮equences。
   4. 对齐蘑菇时序列使用的Clustal欧米茄^{21（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）}集合。点击"浏览"按钮，选择与蘑菇时序列的文件，然后按提交。
   5. 校准完成后，点击"下载对齐文件"按钮。
   6. 打开使用Jalview在1.1.5中产生的多重序列比对（文件|输入对齐|从文件）。在新的窗口对齐，通过颜色标识（颜色|同一性百分比）。
2. 计算二级结构预测，柔性的或无序的序列的预测，和感兴趣的蛋白质（多个）内的预测的卷曲螺旋区域。
   1. 去http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi，计算出卷曲螺旋预测。复制和序列到序列糊盒并点击提交。
      注:此分析可能需要几个小时COMP勒特。因为蘑菇时序列是相当大的，所述序列可能需要被分成少于1000个氨基酸的块以适合Web服务器的尺寸限制内。当分析Shrm2，则建议的C-末端1000氨基酸被用作该部分包含这是已知的包含卷曲螺旋区域SHRM SD2域。当重复该分析与其他蛋白质，建议可能时使用的全长蛋白质序列。如果这不是一个选项，使用最大的片段可能或解剖基于已知生化或功能性数据的顺序。
   2. 去http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi，计算出卷曲螺旋预测。复制和序列到序列糊盒并点击提交。
3. 结合步骤1.1至1.2.2结果到蘑菇时序列的单一综合注释。
   注:强烈鼓励还包括任何及所有有关我载文信息可以从文献或约在此阶段的蛋白质的功能或纯化其他来源收集。
4. 采用这种综合注解序列，预测域边界（或一系列可能的边界）的蛋白质，试图最大化养护和同时最小化紊乱或柔性序列的量的预测的结构特征。如果公知的，所得到的蛋白应保留感兴趣的功能特性。

2.表达和纯化蛋白质在第1节确定的域边界

注意:本节的目标是使用了一系列快速，轻松地量化分析来筛选在第1节产生的假想域边界。

1. 使用标准的分子生物学技术，生成与他的₁₀ -mRuby2-XH2质粒内帧所需的编码序列的表达质粒（参见图3为矢量地图ND更多详细信息）。
2. 测试表达水平使用BL21（DE3） 大肠杆菌或其他合适的表达菌株在自身诱导介质¹在室温下18-24小时，各个表达质粒。
   1. 变换之后，与细胞来或者使用健壮转化方案的说明，如这里所述一个（https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial表达质粒以及一个空质粒控制到BL21（DE3）中-转型/）。
   2. 从新鲜的转化板，挑取单个菌落并在LB培养基过夜37°C（LB）培养基上生长5毫升发酵剂培养物与34微克/毫升卡那霉素。
   3. 第二天，沉淀培养并用新鲜的LB中洗涤沉淀
   4. 起始培养可添加50毫升自身诱导培养基用34微克/毫升卡那霉素。允许培养物以在室温或37℃生长至饱和。通常情况下，生长〜18-24小时。
   5. 颗粒细胞S和冷冻所得的细胞沉淀在-80℃下无限期之前纯化。
   6. 比较来自每个表达菌株和通过SDS-PAGE的空载体对照全细胞提取物，以确定最有效地产生所需的融合蛋白的菌株。为他的₁₀ -mRuby2-蘑菇时SD2融合蛋白，在180 V代表〜50分钟或直至染料前沿到达凝胶²²的底部运行的10％SDS-PAGE凝胶。
   7. 用考马斯蓝染色的凝胶，以每种菌株²³内可视总细胞蛋白质。
3. 对那个成功表达mRuby2融合蛋白每株初始亲和层析一步。通常情况下，执行净化步骤2.3.2-2.3.7在室温下，除非该蛋白质将改变的条件如在4℃纯化受益。
   1. 从步骤2.2.5解冻细胞团。
   2. 重悬每个细胞沉淀在1.5ml裂解缓冲液（10％甘油，500毫摩尔NaCl，40的mM咪唑，20毫摩尔Tris pH8.0的，1毫β-巯基乙醇）。补充有蛋白酶抑制剂适当的裂解缓冲液。
   3. 添加30微升10毫克/毫升溶菌酶，在室温下孵育20分钟。使用超声处理下列仪器的指示。
   4. 转移到1.5ml试管并离心在台式离心机30分钟在14000 xg离心以沉淀不溶的物质或未溶解的细胞。节省上清液和沉淀通过SDS-PAGE随后的分析。
   5. 执行镍亲和纯化，孵育用100μl的Ni-NTA珠的可溶级分。孵育可溶性裂解物珠粒5-10分钟，翻转数次以混合珠。
   6. 离心以800×g离心30秒在台式离心机以沉淀珠。用裂解液洗涤沉淀3-5次清理掉非特异性的污染物按照此。
   7. 从用裂解缓冲液珠洗脱红宝石融合蛋白补充有11M咪唑。
   8. 使用SDS-PAGE来比较他-mRuby2-蘑菇时蛋白质的行为，在"快速和肮脏的"净化以上。

3.表征蛋白质样品识别那些具有有利的性能

1. 使用分光光度计组在280nm处测量的Ruby融合蛋白的浓度，然后通过加载融合蛋白的1-5微克到天然PAGE凝胶²⁴评估样品的均匀性。在4℃下在175五运行10％非变性PAGE凝胶140分钟
   1. 图像使用配备可视化的荧光，观察其中mRuby标记融合在该测定中迁移的成像器的非变性PAGE。
      注意:小心观察到，被卡在以及这种蛋白质很可能聚集的融合蛋白。如果一个荧光成像器不可用，经常可以形象化和Ruby的图像浓缩样本下一个黑光或用UV光盒标签蛋白。
2. 执行有限的蛋白水解识别稳定折叠域。孵育95微升红宝石SHRM SD2融合在〜1毫克/毫升用5微升0.025％枯草杆菌A的
   1. 样在时间点反应0,0.5，2，5，15，60，和120分钟，从每个时间点的反应去除10微升，并使用15％丙烯酰胺凝胶可视化通过SDS-PAGE的反应的进程。
   2. 用考马斯蓝染色在步骤2.2.7和评估蛋白酶抗性的物种是否可以被识别。
3. 从集成净化效率，行为本土PAGE和有限的蛋白水解对部分纯化mRuby2，蘑菇时融合蛋白进入数据在溶液中这些蛋白的整体行为进行了全面评估。
   1. （可选）如果合适的功能性试验，则需要检查的活动在这一点上。

4.生产卷曲螺旋SD2的高品质晶体域中的蘑菇时

注:第4.1节中的所有步骤，在室温下执行，除非蛋白质将从净化在不同的温度中受益，一般为4℃。

1. 使用50ml的生长作为表达和纯化潜在的粗略估计，执行mRuby2-蘑菇时SD2的大规模表达与实现5-20毫克完全纯化的样品的目标。典型地2升培养物提供了足够的原料。后在8000 xg离心10分钟，生长离心沉淀细胞。
   1. 重悬从作为之前在裂解缓冲液的2升生长沉淀，用约2ml每克冷冻的细胞沉淀的裂解如果用溶菌酶进行裂解。或者，如果使用悬浮在〜8毫升/ g的颗粒均质或法国媒体。在30000 XG 30分钟，小球通过离心细胞碎片。
   2. 批次用10ml的Ni-NTA树脂的结合，从4.1.1可溶部分。倒入适当的重力柱状并允许未结合的蛋白流掉。
   3. 洗涤树脂3-5次用40ml裂解缓冲液中，随后用补充至1M NaCl的裂解缓冲液洗涤。
   4. 洗涤树脂用40ml补充有80 mM咪唑的裂解缓冲液。
   5. 用40毫升裂解液的补充，以1M咪唑洗脱红宝石蘑菇时融合蛋白。手动分馏洗脱的蛋白到4-10毫升的级分。
   6. 确认含有用10％的SDS-PAGE红宝石蘑菇时融合蛋白的级分。
   7. 透析适当的级分（通常是馏分2-4）到8％的甘油，250mM的氯化钠，15mM的咪唑，20毫摩尔Tris pH8.0的，1毫β-ME，使用6-8 kDa的MWCO的透析管。加入1毫克TEV蛋白酶为每25-50毫克融合蛋白。在室温下缓慢搅拌下透析过夜。
   8. 重复镍亲和纯化步骤4.1.2。到4.1.6。该蘑菇时SD2域现在应该留在未结合部分，而他的₁₀ -mRuby2将继续必然树脂和将在洗脱级分中找到。确认用考马斯蓝此使用12％SDS-PAGE染色。
   9. 透析含有蘑菇时SD2域馏分成8％甘油，100mM NaCl的20毫摩尔Tris pH值8.0，5mM的β-巯基乙醇缓冲液过夜。
   10. 执行使用FPLC的阴离子交换层析^25，并与来自0.1-1.0 M氯化钠一个NaCl梯度洗脱。分析用12％的SDS-PAGE的级分。
   11. 使用旋转浓缩器（10千道尔顿MWCO或取决于所研究的蛋白质更高），集中的峰值馏分〜0毫克/毫升，然后执行大小排阻层析^26，通过12％的SDS-PAGE分析峰级分。
   12. 池峰级分并透析入的20mM Tris pH值8.0，50 mM氯化钠，2％甘油，1mMβ-ME，和浓缩至10mg结晶/毫升之前。
       选择性:在此步骤中，除去5微升样品在浓度1，2，5和10毫克/毫升浓缩样品的过程中。运行每个样品的天然PAGE上样2-5微升该步骤期间看样品的行为。
2. 筛选的12的条件的小阵列，以确定结晶试验的最佳蛋白浓度。这些条件的组合物在图7中说明。
   1. 使用24孔坐滴结晶盘中，使用蒸汽扩散法，移液进行结晶试验将500μl每种12条件成单独的孔中，随后逐滴最初含有孔溶液的1微升并在盖玻片1μl的蛋白质样品的。请参阅²⁷对这项技术的更多信息。
   2. 赶紧用密封透明胶带托盘和托盘移动到合适的温度控制的环境中，是免费的震动。使用可改变温度，但4℃，16℃，20℃是相当普遍。
   3. 检查托盘滴在接下来的3天使用以高达100X放大率的显微镜AYS。在3天的期间结束，得分每个液滴含有无沉淀（清），光沉淀，重沉淀（棕色），或晶体。合适的蛋白质浓度应含有不超过6重沉淀。
   4. 使用在4.2中确定的蛋白浓度，屏幕广泛市售结晶屏幕。使用液体处理或结晶机器人大大加快这一过程，而在滴也最小化误差。它需要少得多的蛋白，以及，允许用户使用单个样品筛选多个条件。
   5. 通过系统地改变使用与以前的24孔筛盘的结晶下降中每个变量的提高，从广阔的屏幕识别的初始条件。

结果

的图描绘在本系统中使用的工作流程示于图1，并包括三个主要阶段。序列的计算分析用于开发关于感兴趣的卷曲螺旋蛋白的结构域边界的假设。所述Shrm2 SD2域的注释分析的一个例子示于图2。在该图中，目标是确定在细胞骨架调节蘑菇时称为SD2的C末端保守结构域可能域边界。从这个分析是生成三个不同的集合假想域边界的包含跨越整个保守SD2或最小片段的C-末端这结束了作为用于结晶的最佳人选邻近卷曲螺旋片段。从该序列分析鉴定候选然后在小规模使用具有mRuby2蛋白质融合（ 图3）FO快速测试ř有效的分析。表示小尺度（50毫升培养的）从两个纯化他₁₀ -mRuby2标记蛋白示于图4。在该图中，不溶性蛋白质的行为相比，其可溶性对应物作为显而易见的。差的表达或不溶性蛋白质融合物容易且快速地以这种方式确定的。通过有限的蛋白水解蛋白片段的生化分析显示于图5，适用于各种使用枯萎红宝石系统片段的描述或与分离和纯化的...

讨论

这里所描述的协议旨在帮助用户识别大型卷曲螺旋蛋白中域边界，以方便他们的结晶。该协议依赖于多种由计算预测和其他来源的数据的整体并入以产生一系列可能的域的边界。这些后跟一组生化实验这是快速和廉价的，并且被用来进一步缩小这些初始假设。使用这种方法，用户可以很快消除是不可取的潜在的蛋白质片段，并专注于更好的候选人更多的关注，从而提高获得晶体的前景。

有许多重要的步骤此技术中，然而，没有用于生产结晶作为初始设定假想域边界的发展至关重要。此步骤采用了各种计算方法，以及信息的ob从文献或功能性数据时可用tained。应当小心，以避免使用该策略，因为目前的地方到一个量化的置信值附加到任何预测的无法立即磨练下至单个"最佳"的解决方案。相反，它是最好的作为一个方法来快速识别一小部分，需要加以实验验证可能域边界。

可与该协议被分析卷曲螺旋蛋白质的特性是相当广阔的。从计算的角度来看，卷曲螺旋预测的强度是有限的下面20个氨基酸，并如在步骤1.2.1所述，卷曲螺旋区域大于1000氨基酸需要由DISOPRED被分成多个部分以进行分析。我们认为是暂时的，因为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21（DE3） Rosetta	Emd Millipore	70954-3
BL21（DE3） Star	ThermoFisher Scientific	C601003
BL21（DE3） 密码子加	Agilent Technologies	230245
溶菌酶	光谱化学制造公司	L3008-5GM
Ni-NTA 树脂	Life Technologies	25216
枯草杆菌蛋白酶 A	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24孔晶体化学板	Hampton研究	HR3-160
板  96：	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	汉普顿研究	HR2-591
PEG 8000	汉普顿研究	HR2-515
PEG 400	汉普顿研究	HR2-603
PEG 4000	汉普顿研究	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
过夜快速自动诱导系统 1	Emd Millipore	71300
溶原肉汤粉末	ThermoFisher Scientific	12795027