我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。
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本文内容
摘要
摘要
对于任何蛋白质而言，获得用于结构测定的晶体都可能是一项困难且耗时的工作。卷曲螺旋蛋白及其结构域在自然界中广泛存在，但由于其物理特性及易于聚集的倾向，传统上被认为尤其难以结晶。在此，我们采用一系列快速而简便的技术，旨在确定给定卷曲螺旋蛋白的一系列可能的结构域边界，并迅速表征这些蛋白在溶液中的行为。通过添加强荧光标签（mRuby2），蛋白质的表征变得简单直接。目标蛋白在普通光照条件下即可清晰可见，并可利用适当的成像设备进行定量分析。该方法的目标是快速筛选出那些不太可能成功结晶的候选蛋白，从而将其从结晶流程中剔除，为最有希望的候选蛋白节省更多时间，并减少在无法形成晶体的蛋白上所耗费的资金。该流程可反复迭代，整合初始筛选过程中获得的信息，可适应高通量表达与纯化流程，并可通过机器人结晶筛选系统进一步增强效率。
引言
通过X射线晶体学进行结构测定对现代生物学的各个领域都做出了根本性贡献；它提供了生命所依赖的大分子及其在多种环境下的相互作用的原子级视图；使我们能够理解致病机制，并为合理设计治疗疾病的药物提供了可能。长期以来，晶体学一直是测定大分子结构的主要实验技术，目前占结构数据库的89.3%（www.rcsb.org）。该技术具有诸多优势，包括实现极高分辨率的潜力、能够可视化大小范围广泛的大分子、相对容易的数据收集过程，以及能够观察大分子与溶剂及配体相互作用的能力。
尽管重组蛋白表达技术已取得诸多进步1,2，纯化3以及用于构建这些系统的分子生物学技术4，晶体学过程中最大的障碍仍然是获得可用于衍射的高质量晶体. 对于含有大型卷曲螺旋结构域的蛋白质而言，这一点尤为明显。据估计，所有氨基酸中多达5%存在于卷曲螺旋结构中。5,6，这使其成为一种非常常见的结构特征7，然而这些蛋白质通常比球状蛋白质更难纯化和结晶8-10此外，由于卷曲螺旋结构域通常存在于较大蛋白质的序列背景中，因此准确预测这些结构域的边界至关重要，以避免引入无序或柔性序列，而这类序列通常不利于结晶。
本文提出一个概念性框架，将基于网络的计算分析与实验台获得的实验数据相结合，以帮助用户指导晶体学研究初始阶段的工作，包括：如何选择用于结....
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方案
注意：概念框架或工作流程的示意图见图1，供参考。该方案可分为四个阶段：基于计算或序列的预测、蛋白质表达与纯化、生化表征以及结晶。所示示例分析了Shroom SD2结构域和/或Shroom-Rock复合物，但该方案可适用于任何蛋白质。
1. 使用成熟的基于网络的工具生成卷曲螺旋结构域边界的计算预测
- 收集一组具有进化多样性的序列同源物。
- 访问 www.uniprot.org，在顶部搜索栏中输入 Shroom。
- 通过勾选序列编号旁的复选框来选择要下载的序列。带有星号的序列表示已由 Uniprot 审核，通常更为可靠。请确保所有选中的序列完整且准确。
- 点击“下载”按钮保存所选序列。
- 使用 Clustal-Omega21（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对 Shroom 序列集合进行比对。点击“浏览”按钮选择包含 Shroom 序列的文件，然后点击提交。
- 比对完成后，点击 "下载比对文件" 按钮。
- 使用 Jalview 打开步骤 1.1.5 生成的多序列比对文件（文件 | 输入比对 | 从文件）。在新的比对窗口中，按一致性着色（颜色 | 一致性百分比）。
- 计算目标....
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结果
该系统所用工作流程的示意图见图1，包括三个主要阶段。通过序列的计算分析，提出关于目标卷曲螺旋蛋白结构域边界的假设。图图2展示了对Shrm2 SD2结构域进行注释分析的一个示例。在该图中，目标是确定细胞骨架调控因子Shroom在其C末端一个保守结构域（称为SD2）的可能边界。通过该分析，生成了三组不同的假设边界，包含跨越整个保守SD2区域的卷曲螺旋片段，或靠近C末端的最小片段，其中后者最终成为最适合结晶的候选片段。从序列分析中鉴定出的候选片段随后通过与mRuby2的蛋白融合在小规模上快速测试，以实现高效分析（图3）。图图4展示了两个带有His10-mRuby2标签的蛋白在小规模（50 ml培养物）纯化中的代表性结果。在该图中，不溶性蛋白的行为与其可溶性对应物相比显而易见。通过这种方法可快速、简便地识别表达量低或不溶的蛋白融合体。图图5展示了利用上述Ruby系统或分离纯化的Shroom .......
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讨论
本文所述方案旨在帮助用户确定大型卷曲螺旋蛋白中的结构域边界，以促进其结晶。该方案通过综合整合来自计算预测及其他来源的多种数据，提出一系列可能的结构域边界。随后进行一系列快速且低成本的生化实验，以进一步优化这些初步假设。采用此方法，用户可快速排除不理想的蛋白片段，集中精力研究更优候选对象，从而提高获得晶体的可能性。
该技术包含多个重要步骤，但对晶体生成最为关键的是初始假设性结构域边界的确定。此步骤结合了多种计算方法，以及可从文献或功能数据中获得的信息。应注意避免立即采用单一策略直接缩小到唯一方案 "最佳" 目前尚无方法为任何预测结果赋予可量化的置信度值，因此该方法不宜作为确定性解决方案。相反，它最适合用于快速识别出一组可能的结构域边界，这些边界需通过实验进一步验证。
利用本方案可分析的卷曲螺旋蛋白特性范围较广。从计算角度来看，卷曲螺旋预测在少于20个氨基酸的序列上准确性有限；如步骤1.2.1所述，超过1,000个氨基酸的卷曲螺旋区域需拆分为多个片段，方可由DISOPRED进行分析。我们认为后一限制是暂时性的，因其.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01 GM097204（APV 和 JDH）支持。JHM 的经费由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）本科生暑期科研奖学金提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| 溶菌酶 | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA 树脂 | Life Technologies | 25216 | |
| 枯草杆菌蛋白酶A | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24孔Cryschem板 | Hampton Research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton Research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton Research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| LB培养基粉末 | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
参考文献
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expressio....
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重印与许可
