Method Article

设计和自动照明，培养和取样系统实现微生物光遗传学的应用

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们设计用于光遗传学系统一起使用，照亮微生物的培养，并定期图像细胞出水倒置显微镜连续培养装置。培养，取样，成像和图像分析完全自动化，使得光照动态响应可以在几天进行测量。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光遗传学系统利用改变构响应于特定波长的光，以改变细胞过程遗传编码的蛋白质。有需要用于培养和测量对于包含编程光遗传学系统的照明和刺激系统。我们提出了构建和使用连续培养装置照亮的微生物细胞与编程的剂量的光，并自动采集和分析流出物中的细胞的图像的协议。该装置作为一个恒化器的操作允许的生长速率和细胞的环境中进行严格控制。连续细胞培养物的流出物定期采样，将细胞由多通道显微镜成像。培养，取样，成像和图像分析完全自动化，使得在荧光强度和从培养流出物取样细胞的细胞形态的动态响应多天测量无需用户输入。我们通过动态诱导蛋白生产中与激活转录的光遗传学系统设计的酿酒酵母的菌株证明这种培养装置的效用。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光遗传学系统使用光来控制细胞过程，包括基因表达，1，2，3，4，5蛋白质定位，6蛋白活性，6，7，8蛋白结合，8，9，10和蛋白质降解的一个增长的名单。 11，用于在与编程光学刺激受控环境中培养的细胞，并用于测量其响应在生物学相关的时间尺度的方法，有必要利用这些工具的潜力在细胞生物学和生物技术研究。我们的方法利用chemostasis的优势，在充分混合以保持恒定的细胞生长速率，AE额定，并且暴露于编程照度温度控制玻璃培养容器12，13。在倒置显微镜培养流出我们图像单个细胞来测量培养的以编程照明的响应。培养，取样，成像和图像分析完全自动化，使得荧光强度和流出物细胞培养物的细胞形态可以在多天进行测量，而无需用户输入。

这种协议可以在熟悉生长的细胞培养和显微镜检查大多数实验室来实现，并且所使用的装置是廉价且随时提供的组件。透明培养容器被放置的发光二极管（LED）能够发光的1μW/ cm 2的-10毫瓦/厘米2的矩阵的上方。微生物生长在连续培养容器; 1蠕动泵用于在添加媒体稀释率，另一个用于在较小速度到显微镜撤回培养，差值逸出通过溢流出口。一个加热垫维持温度。空气连续地泵入培养容器保持正压以及混合和通气培养。除了空气泵，功率到这些设备是由还接收来自温度计和连接台式计算机输入微控制器调节。流出物细胞培养物被泵送到微流体装置上的倒置显微镜的阶段。非荧光和荧光图像自动获得的。在影像中的细胞是由位于每个小区作为感兴趣区域（ROI）的区域，并测量每个ROI的属性的算法表征。

为了证明该协议的应用，我们测量了蓝光responsi工程酵母细胞的不同光强的响应已经控制荧光蛋白的转录光遗传学系统。 酿酒酵母 ，俗称面包酵母，被选中是因为在这一系统中控制基因表达的多个光遗传学系统已经存在14，15，16。此外，该模型生物体通常在系统生物学17和作为用于生物技术应用18，19，20中的底盘用于研究。我们的代表性的结果表明，该协议可以用于通过改变输入光强度和测量的生产荧光报道的以控制培养多天的转录。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

图1:连续培养装置。这简化框图显示了如何，当它被用来培养，照亮该装置应进行组装，并测量微生物的光学性质。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-protocol-2
图2:该协议的综述。在阴影区域中的步骤必须重复每次使用的协议的时间。闭环控制是可能的34，但并不在此协议来实现。

1.组装温度计到电路板


图3:连接到读取温度计的数值。此图显示了数字温度计应如何连接到PCB，使得微控制器可以得到反馈来控制培养物的温度。 请点击此处查看该图的放大版本。
  1. 焊接接地，数据和数字温度计的正电压线到其各自的通孔标记"GD + V"。
  2. 从女性3针接头剪掉一个引脚和修剪剩下的2个引脚与断线钳，使得它可以放入标有"R2"两个通孔，而不是阻碍微控制器。到位焊锡这一点。通过插入针头一个4.7kΩ电阻连接两个焊接引脚。

2.连接电源刀豆控制组件电路板

figure-protocol-3
图4:连接到控制电源加热垫。该图显示了印刷电路板和附属部件应以控制电源到加热垫进行组装。的部件，以控制蠕动泵被连接在一个类似的方式。注意，对于温度计的组件已经为了清楚而移除。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 从五女3针接头插针剪掉1厘米。焊接这些在印刷电路板（PCB）标记为"＃1"，"＃2"，"＃3"，"＃4的位置"和"CB E"
  2. 从女性的6针和8针接头的针剪掉1厘米。并排焊接这些副作用贯通孔的列通过K14标记K1。
  3. 加热垫连接到电路板上。
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记的K1和K2。插入一个金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）到位置PCB上标记＃1，朝向K1朝向MOSFET的标签通过K14贯通孔，以使源销最接近"＃ "的标签，以及漏针最远的是从"＃"的标签。
    2. 切5 V直流（DC）电源线的接地线，并将其连接到J2。连接加热垫到J1的接地线。连接K3与1kΩ电阻引脚3。电流现在应该只从J1流到J2当销3被设定为+ 5V.z
      注:电阻/ MOSFET集用作开关，允许电流时，微控制器的引脚3被设定为+5 V从销J1流到J2
  4. 接缓慢蠕动泵。
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记K4和K5。插入的MOSFET到位置PCB上标记＃2，朝向K1朝向MOSFET的标签通过K14贯通孔，以使源销最接近"＃"的标签，和所述漏极销是从最远"＃" 标签。
    2. 切缓慢蠕动泵的12 V直流电源线的接地线。面向连接结束J3和面临结束J4墙疣蠕动泵。 K6连接引脚4与1kΩ电阻。电流现在应该只从J3流到J4时销4被设定为+ 5V。
  5. 连接快速蠕动泵
    1. 插入一个100kΩ的电阻器的端部在PCB上的通孔标记K7和K9。插入的MOSFET到位置通过K14贯通孔S中的PCB上标记＃3，朝向K1朝向MOSFET的标签 Ø源引脚是最接近"＃"标签，并在漏针最远的是从"＃"的标签。
    2. 切快速蠕动泵的12 V直流电源线的接地线。面向连接端J5和面临结束J6墙疣蠕动泵。 K9连接引脚5与1kΩ电阻。电流现在应该只从J5流动到J6当销5被设定为+ 5V。

3. LED矩阵连接到电路板

figure-protocol-4
图5:连接到控制LED矩阵。此图显示了LED矩阵应如何连接到PCB。它还表明，在PCB可以在微控制器进行堆叠。注意，对温度计和用于控制DC电力到其他设备的部件已经为了清楚而移除。ES / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

  1. 焊接6针，10针，并且两个8针母针头插入印刷电路板的两侧，使得它可以在微控制器的顶部堆叠通孔。
  2. 焊接为100 nF和10μF电容到PCB上的标记位置，并指出的10μF的电容（更短的交货），负极应连接到标有一个负号通孔。
  3. 远离焊接LED驱动器2由12组的通孔，与对驾驶员的凹痕的通孔用于LED矩阵保留。
  4. 焊接插针头2列标记为LED矩阵的通孔，并修剪这些末端的线路板，使它们不会阻碍微控制器的下方。连接这些女/女跳线的两个8线带。连接另一组男销头以跨接线的另一端。
  5. 将在线路板的中位数LED矩阵，然后插入第二组排针到列的矩阵的两侧。确保电连接是相同的，如果LED矩阵被直接连接到PCB与基质的相对应的通孔标记的列中的标记的边。
  6. 从女性3针接头剪掉一个引脚和修剪剩下的2个引脚与断线钳，使得它可以放入标有"R1"的两个通孔，而不是阻碍微控制器。焊锡这一点。通过插入针头1kΩ电阻连接两个焊接引脚。
    注意:培养容器将被堆叠在LED矩阵。如果导线色带阻塞该容器中，抵消它们从基质。然后，使用实芯焊丝弥合矩阵销和电线色带销，使得电连接不ch个之间的间隙安格。

4.安装软件和连接硬件

  1. 堆栈的微控制器的PCB。
  2. 按照在物料清单中的链接下载集成开发环境（IDE）和自定义代码的微控制器。
  3. 通过AB通用串行总线（USB）电缆连接微控制器显微镜电脑。编译并上传自定义代码，以微控制器。
  4. 下载微型经理21,22和斐济23。配置微Manager作为通过复制所有的".DLL"文件，"mmplugins"目录斐济插件，并从那里微观管理器中下载到"Fiji.app"目录的目录中的"mmautofocus"目录。此外，复制"插件/微管理"目录进入"Fiji.app/plugins"目录。
  5. 下载"BioreactorController.jar"文件INT澳"Fiji.app/mmplugins"目录。
  6. 打开微经理从斐济>插件>微型经理>微经理工作室。使用的硬件配置向导来配置软件来控制显微镜。包括向导一起其中AB USB电缆连接的端口的标签"FreeSerialPort"设备。

5.与表征光型外壳的培养用容器

  1. 在LED矩阵，使得培养容器可以在他们休息的矩阵上面的每个角落堆栈中的线路板三个8脚IC插座作为构建块。
  2. 插座的顶层下紧固扩散纸的一部分上，使得来自LED矩阵撞击培养容器中的光漫射。
  3. "6"黑色泡沫的部分切出3个8。切出来自第一总重量的内部的部分，其大小与电子线路板相同（2.3"×3.5"）o及作为由IC插座制成（0.9"×1.8"）从第三内侧的矩形的尺寸的部分。堆叠这些层在LED矩阵，使得含有0.9"×1.8"孔的最终层位于甚至与IC插座的顶部，并围绕LED矩阵。
  4. 切割黑色泡沫的附页中一半做出6"24"矩形。卷成黑色泡沫的中空柱，该培养容器可适应与室管和电线，使得其将热和光学隔离培养容器这一点。
  5. 居中黑色泡沫的中空柱在LED矩阵，和标记的列的边界在它之下黑色泡沫层上。该边界将标志着它应该在将来被居中。
  6. 切出黑色泡沫体的3"×3"的部分。使用此以后为可贴在塔的顶部，以阻止外部光的盖子。
  7. 连接光电二极管功率传感器为th Ë培养船舶用胶带盖，装上盖子，并插入机箱中的培养容器。
  8. 在微管理器，进入插件>生物反应器控制器。设置矩阵在可能的强度的范围的子集，在30秒的间隔发光。
  9. 连接到功率传感器的功率计控制台上显示记录的光强度。这些测量将使时被设定的被点亮的LED的那些LED的数量和脉冲宽度调制（PWM）电流被称为光的实际强度。

6.准备培养容器

figure-protocol-5
图6:船只连接。该图显示了装置的容器和管道应当被高压灭菌之前被连接。空白">点击此处查看该图的放大版本。

  1. 标记对应于在10毫升的范围内的液体，每2毫升增量到30毫升的培养容器中的高度。刀片10毫升无菌去离子水，标记水位，加入2毫升，标记水位，并重复直到30毫升的水平标记。覆盖透明胶带，使它们不容易去除的标记，和液体的处理。
  2. 将铝口的长端通过硅胶垫片，到培养容器。拧上瓶盖。
  3. 涵盖具有1/16"ID硅管一短铝端口插座。通过插入一个阴路厄锁，然后连接的阳鲁尔锁定插头插入的远端。此出口是补充，并且将不被使用（管6在图6中）。
  4. 连接男性和女性鲁尔锁1/16"ID硅胶管的两个短段。一端连接到一个短铝口插座和插头的DISTA升结束与男性鲁尔和女性鲁尔锁插头。该船将通过该管（管图6 7 / 7.1）接种。
  5. 2 1/16"ID管的1/16的两端"连接ID蠕动泵和连接器。一端连接到一个短铝端口（ 如图6管4）将另一。后，这将被连接到媒体烧瓶中。

7.准备媒体瓶

  1. 连接一个1/16"内径（ID）硅氧烷管与最长铝端口，管应足够长以达到媒体烧瓶。一1/8连接"标识阳路厄锁的1/16短段" ID管，这种连接前述管,,然后插入这个短段插入媒体烧瓶（管3在图6中）的橡胶塞。
  2. 夹住管子。此连接允许空气从媒体烧瓶流动到培养容器中。当媒体烧瓶后与空气抽D该管是松开，将培养将被混合，加气，并保持在由输入的气泡的正压力。
  3. 插入1/16"ID管足够长以到达烧瓶入塞，通过该媒体将被转移的底部。另一个1/16连接"ID管这一个，然后一个3/16"ID管即，用一个3/16"ID阴路厄锁和阳路厄锁塞（管在图6中的1 / 1.1）插此。
  4. 在止动件的第三孔应充满1/16"ID管的短段，连接到介质直径的管子的其他两个片段并插入在远端（管2 如图6 / 2.1），这将连接到真空泵后来到水族馆泵。
    注:如果管道不容易适合通过在橡胶塞中的孔，切管的端部处的斜面。然后，它是通过该孔推倾斜端可用于通过拉的其余部分。

  1. 插入的阳鲁尔锁定到1/16的区段"ID硅胶管，然后用力插入0.022"ID聚四氟乙烯（PTFE）管。另外，将连接的阴鲁尔锁定到1/16"ID管，然后，线程间沿PTFE管端连接的锁和（ 图6中管5）另一个短铝端口。
  2. 暴露的1/50"ID硅胶管的1/50"连接ID蠕动管和连接器。对此，连1/50的三段"ID管和0.022的两段"ID PTFE管，交替他们。通过1/16"ID管（管5 图6）将其连接至污水瓶。
  3. 连接一个1/16"ID硅树脂管与铝端口的第二长管，另一端与流出物烧瓶的一端。此铝管设置培养物体积，和过量培养溢出到流出容器（管8中
  4. 高压灭菌培养组件在121℃和15磅（一般灭菌）处理30分钟。
    注意:通过该媒体烧瓶填充的管，通过该媒体烧瓶抽真空，并通过该培养容器中接种有管道的多个区段，这样，如果远侧段被污染，它可以被除去以揭示无菌分割。

9.准备微流体通道

  1. 混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化剂在9:1的比例。德加倒到硅母模。
  2. 固化2小时的PDMS在65℃，然后从用刀片掩模剪。周围的PDMS切，直到它从模具释放。避免推下来，打破了脆弱的晶圆。
  3. 使用1.2毫米内径的活检打孔器在通道的两端打孔。
  4. 等离子债券PDMS的玻璃盖24。
  5. 大盘长玻璃盖到支撑铝框，使得所述的PDMS通道的铝框上居中的端部，然后在65℃下再次烘烤PDMS 2小时。

10.填补了媒体瓶

figure-protocol-6
图7:添加媒体。此图显示的媒体应该如何进行真空过滤到媒体烧瓶中。它确保媒体仍然不育。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 做适当的介质。如果连续培养系统将作为恒化器进行操作，使用限定为特定的营养培养基。
    注:用酿酒酵母的研究标准介质组成的例子已经在此前公布的25，="外部参照"> 26，27，28，29。
  2. 附加真空过滤到100ml瓶，取出乳头盖，然后用无菌镊子将真空过滤器的乳头移除白色插头。
  3. 的3/16"ID硅胶管连接到乳头，媒体烧瓶的其它自由管到真空泵（管1和2在图7中，分别地），并确保连接媒体烧瓶培养容器中的管被夹紧关（ 图7中管3）。
  4. 填充介质过滤器，打开真空泵，然后过滤介质的其余部分。钳连接到真空（管2在图7中）的1/16"ID硅胶管并关闭真空泵。
  5. 从1/16"连接到真空泵，使得所述管的未被污染端是可访问的ID管的中间段取出leurs，插入第Ë蓝色无菌注射器空气过滤器进入该管的末端。
  6. 夹紧3/16"ID硅树脂管（ 图7中管1），并从它断开阳路厄。从阴路厄氏培养容器的媒体入口管的断开插头。连接这些雌雄luers使媒体成为泵入培养容器中。
  7. 移除真空过滤器和盖的100mL的瓶子，将其连接于真空过滤介质。
  8. 一天的培养容器将被接种前，接种的光遗传学微生物的单菌落在用4mL在前面步骤中收集的介质的试管中，并让它在30℃或培养的最佳温度的生长温度下生长过夜搅拌。

11.组装设备围绕显微镜

  1. 设置连续培养组件显微镜附近与介质烧瓶中比培养容器和efflu更高耳鼻喉科烧瓶比培养容器下部，使得0.022"ID PTFE管（管5在图 6中）的链段构成的管可达到显微镜阶段。牢牢胶带向下媒体烧瓶和流出容器的橡胶塞。
  2. 拔出ID硅树脂管的0.022"从1/50 ID PTFE管"的（ 图 6中管5）它们连接的端部，并插入这些端部到微流体装置的入口和出口。
  3. 连接注射器空气过滤器水族馆泵的白色结束。的空气压力将推动介质放入培养容器中。
  4. 当媒体到达出水端口的水平，环绕快1/16"周围的慢蠕动泵（管4在图 6）的ID的媒体入口管和连接器和1/50"ID样本出口管道和连接器蠕动泵（管5在图 6中）。
  5. 通过松开空气涂通气媒体是介质烧瓶中并培养容器之间。
  6. 胶带将加热垫和温度计的培养容器中，使得它的温度可以被控制。线圈周围的培养容器中的介质管，以便进入的媒体将在相同的温度的容器中。
    注意:PWM电流到加热垫通过其使用输入来自温度计保持培养容器在其设定点温度的微控制器调节。
  7. 将培养容器成黑色泡沫外壳在LED矩阵，并确保该管不夹住。
  8. 在微管理器，进入插件>生物反应器控制器。现场设置比蒸发的速度了"关于媒体泵比"为0.1和字段设置为0的"关于采样泵比"的流量会非常低，但更大。
  9. 夹住介质烧瓶中并培养容器之间的进入空气管中。从接种管（管7 图拔下插头
  10. 盖外壳使得没有光线进入，并让文化成长过夜。

12.校准的抽水速度

  1. 在微管理器，进入插件>生物反应器控制器。现场设置了"媒体泵比"0.5和字段设置为0的"关于采样泵比"。
  2. 断开从流出物烧瓶（管8在图 6中），并从流出烧瓶（ 图 6中管8）的采样管的溢流管，并在分开的容器收集流出物。收集污水1小时，开始泵一直在15分钟后。
  3. 计算的介质的流动速率成从容器中收集到的体积的培养容器中:
    figure-protocol-7
  4. 现场调整这个线性估计的"传媒泵率"的值:
    figure-protocol-8
    哪里
    figure-protocol-9
  5. 通过该校准过程迭代，直到所需的流速和测量的流量之间的差<0.2毫升/小时，其中的流率被平均在1小时内。
  6. 增加"样品比"字段中的值和校准它以类似的方式，直到大致4/5 个容积而使培养容器是由取样泵泵出并大致1/5体积的离开通过溢流口。
  7. 让这些条件下在连续培养装置的培养密度平衡过夜。
    注意:如果目标流量不能达到，变化蠕动泵管。液体以较高的速率泵送当使用更大直径的管道。按照步骤14，然后返回到步骤8.4。

培养微生物的13收集显微镜图像

  1. 与一组非重叠的位置在该泵送到微流体通道细胞的图像将在焦平面的填微管理舞台位置列表。
  2. 打开"生物反应器控制器"插件。选择所需的LED矩阵的时间过程中，成像通道，并从提示其他实验设置。收集和分析图像。
  3. 虽然实验运行，确保在媒体烧瓶媒体依然清晰。如果是阴天，则它已被污染。

14后的实验

  1. 处置的媒体，多余的细胞培养和污水。
  2. 重新填充用200ml 20％的乙醇与去离子水混合的介质烧瓶中。运行恒化，因为它以前有在实验过程中被运行，以洗出细胞碎片和介质。
  3. 当酒精溶液已经从媒体瓶倒掉，完全拆卸恒化。
  4. 洗玻璃器皿和试管用温水和温和的清洁剂，并用去离子水彻底冲洗。离开干。
  5. 打开"microcontrollerRecords.csv"文件以查看在实验过程中的温度和LED矩阵状态中，"Summary.csv"文件审查从每组图像的摘要数据和"结果的.csv"文件审查数据总结从每个时间段，其中n是个数据组n每个ROI。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此装置用于通过基于所述CRY2 / CIB1蛋白对30可诱导光遗传学转录系统刺激酿酒酵母的表达响应于蓝光黄色荧光蛋白（YFP）的培养。细胞在磷酸盐限制培养基chemostatically生长为0.2±0.008的平均稀释率。磷酸盐限制在酿酒酵母恒化实验通常用于控制生长速率和磷酸盐限制的效果很好的特点。 31，32，从连续稀释的培养容器33的流出物进行采样，以在微流体装置上的倒置显微镜。 如图8中的图像进行自动分析。单个细胞中扣除背景的相衬图像和它们的YFP concentra被确定从扣除背景的荧光图像测量和灰是从他们的荧光估计。

169677细胞的荧...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们设计时考虑的灵活性本设备。所有使用的代码是自由和开放源码。默认的图像分析过程分割单元简单，运行速度很快。定制分析可以通过记录用户输入，同时与斐济图形用户界面进行分析的代表性图像，所述输入转换为BeanShell的脚本，然后设置插件调用脚本来实现。当它被调用时，该脚本将被送到称为"图像"包含文件路径到最近一套扣除背景的图像的字符串数组。图像和数据，因为它们被收集，这样，如果一个实验突然结束，他们不会丢失保存。蓝色发光二极管阵列被选择用于诱导我们的光遗传学系统，但它可以用不同颜色的LED来代替。有额外MOSFET开关和继电器开关PCB上的微控制器，以及通孔提供额外的输入和输出管脚，可以很容易此系统也可以适于更复杂的用途。例如，为了使该装置作为一恒浊操作，使用额外的引脚上的微控制器来驱动LED和从绑在培养容器中的光传感器读出的值，然后修改来测量浊度的软件，并相应地稀释容器。

必须小心，以确保培养物不被污染，以保护敏感显微镜设备，并确保了流体流速是一致的。现有当培养容器故意接种到污染物可以通过接种容器，并验证里面有没有生长之前等待几天来检测。为了避免在显微镜物镜溢出细胞培养，检查微流体...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢莫莉拉扎尔和Veronica德尔加多协助在测试协议，基兰·斯威尼有益的讨论和编辑，和泰勒·斯科特，我的安adirekkun，和斯蒂芬妮盖勒的手稿的批判性阅读。梅根妮可麦克林博士拥有事业奖从宝来惠康基金科学接口。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
广泛的实验室手册GitHubNA广泛、定期更新的实验室手册位于 "光遗传学化学止化器文件"GitHub 存储库 （https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）。这还包括对用于生成代表性结果的微流体模具的描述。
Fritzing Design ViewerFritzingNA查看和编辑 .fzz 型电路板设计的免费开源软件可在 "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 （Atmega328 - 组装）Adafruit50微控制器获得。需要 1 个。
Arduino 可堆叠接头套件SparkFun Electronics10007用于将 PCB 连接到微控制器的母头引脚接头。需要 1 个。
可调 30W 110V 烙铁 - XY-258 110VAdafruit180用于与 PCB 进行电气连接。
烙铁架Adafruit150用于与 PCB 进行电气连接。需要 1 个。
迷你焊料卷 - 60/40 铅松香芯焊料 0.031 英寸直径 - 100 克Adafruit145用于与 PCB 进行电气连接。
0.1 μF 电容器SparkFun ElectronicsCOM-08375稳定 PCB 中的电压。需要 1 个。
10 μF 电容器SparkFun ElectronicsCOM-00523稳定 PCB 中的电压。需要 1 个。
MAX7219CNG LED矩阵/数字显示驱动器 - MAX7219Maxim MAX7219CNGLED驱动器。需要1个。
8 针 IC 插座Mouser Electronics575-14430816。这些将彼此堆叠在一起，以支撑 LED 矩阵上方的培养容器。
24 针 IC 插座Mouser Electronics535-24-3518-10可选。使用此选项将 MAXIM 7219CNG 驱动器反向连接到 PCB。
数字万用表Adafruit2034用于对电子设备进行故障排除。需要 1 个。
分离式接头 - 40 针公头（长中心，PTH，0.1"）SparkFun ElectronicsPRT-12693公头针座，用于将 LED 矩阵连接到印刷电路板。末端可以用剪线钳修剪。需要 1 套。 
齐平对角线剪Adafruit152用于修剪长排针和切割电源线。需要 1 个。
高级母/母跳线 - 40 x 12" （300mm）Adafruit793线带，用于将面包板连接到 LED 矩阵。可以与公排针端端连接，以延长长度。需要 1 个。
半尺寸面包板Adafruit64LED 矩阵将连接到它，培养容器将位于其上方。
微型 8x8 蓝色 LED 矩阵Adafruit956光源。主波长为 470nm（蓝色）。需要 1 个。来自同一供应商的替代微型 LED 矩阵具有主波长：624 nm（红色）、588 nm（黄色）、525 nm（绿色）、572 nm（黄绿色）和白色。
需要可堆叠接头 - 3 针SparkFun Electronics138758。
电阻器套件 - 1/4W（总共 500 个）SparkFun Electronics10969用于电子产品。需要 1 个。
 IRL520N MOSFET国际整流器IRL520N用于控制直流电流的电压调节开关。需要 4 个。
电子线 - 组合（实心，22 AWG）SparkFun ElectronicsPRT 11367电子线。需要 1 个。
5V 2A （2000mA） 开关电源 - UL 认证Adafruit276垫和 Arduino 的电源。需要 2 个。
12 VDC 1000mA 稳压开关电源适配器 - UL 认证Adafruit798用于蠕动泵。需要 2 个。
电加热垫 - 10cm x 5cmAdafruit1481用于加热生物反应器。需要 1 个。
低流量可变流量蠕动泵Fisher Scientific13-876-1用于泵送介质。需要 1
中等流量可变流量蠕动泵Fisher Scientific13-876-2用于泵送培养。需要 1 个。
9 VDC 1000mA 稳压开关电源适配器 - UL 认证的Adafruit63用于微控制器电源。订单 1.
高温防水DS18B20 数字温度传感器 + 用于Adafruit642温度计。需要 1 个。
MicromanagerMicromanagerNA免费的开源显微镜控制软件可在 "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNA免费的开源图像分析软件可在 "http://fiji.sc/"
Arduino 集成开发环境ArduinoNA获得免费的开源 IDE 可在 "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
自定义代码GitHubNA微控制器代码和"生物反应器控制器"插件可在"光遗传学化学止化器文件"GitHub 存储库 （https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）。
USB 电缆 A 到 B - 6 英尺SparkFun ElectronicsCAB-00512用于将数据下载到微控制器。需要 1 个。
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNA从 CSV 文件加载 LED 矩阵值的优势在于，插件可以调用程序来根据图像分析结果更新这些值，并且这些值可以重新加载到微控制器，从而实现反馈控制。可从 "光遗传学化学止化器文件"GitHub 存储库 （https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）。
Tota-frost 凝胶（扩散纸）B&HB&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		用于 LED 矩阵。需要 1 个。
交联 1/4x12x24in Grainger， inc20JL37用于培养容器围栏的黑色泡沫。需要 4 个。
标准光电二极管功率传感器，硅，200 - 1100 nm，50 mW ThorlabsS120VC用于测量光强度。需要 1 个。
贴标胶带Fisher Scientific159015N用于贴标和固定松动的组件。需要 1 个。
紧凑型功率和能量计控制台，数字 4 英寸 LCDThorlabsPM100D用于测量光强度。需要 1 个。
100mL GL45 杂交玻璃瓶Bellco Glass， Inc.（7910-40150）生物反应器容器。1 需要。
六端口组件Bellco Glass， Inc.定制 用于生物反应器容器。端口A：帽头上方和管底1.0"长。端口 B、C、E、F：盖段上方 1.0 英寸长，下方 33 毫米长。端口 D：帽上 1.0 英寸长，65 毫米 长在下面。需要 1 个。包括 45 mm 直径的聚丙烯开口螺口盖和白色硅胶垫圈，以确保瓶盖和容器之间的紧密密封。
Scotch Magic Tape 3105,3/4 x 300 英寸，3 包亚马逊B0009F3P3U透明透明胶带。这可以从许多其他供应商处获得。它用于覆盖培养容器上的标记，并通过 PDMS 通道将盖玻片固定到铝制支撑架上。
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" 壁厚 Tygon 卫生硅胶管美国塑料公司57288管路。需要 ~25 英尺。
Cole-Parmer Twistit 白色橡胶塞，尺寸 10Cole-ParmerEW-62992-32培养基培养瓶塞和流出瓶塞。需要 2 个。
2 L 实验室培养瓶Pyrex4980培养基培养瓶和流出物培养瓶。需要 2 个。
日间捏管Fisher Scientific5867用于捏管关闭。需要 3 个。
替换管道组件 1/16" ID可追溯产品3372蠕动泵配有一套管子，但使用数周后它们会磨损。
替换管道组件 1/50" ID可追溯产品3371蠕动泵配有一套管子，但使用数周后它们会磨损。
带锁环的公鲁尔接头 x 1/16" 软管倒钩，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-00连接器。需要 ~10 个鲁尔接头。
带锁环的公鲁尔接头 x 1/8" 软管倒钩，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-04连接器。需要 5 个，每个橡胶塞孔一个，以填充管道。
母鲁尔接头 x 1/16" 软管倒钩适配器，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45502-00连接器。需要 ~10 个鲁尔接头。
母鲁尔接头 x 3/16" 软管倒钩适配器Cole-ParmerEW-45502-08连接器。需要 ~10 个鲁尔接头。
Cole-Parmer 鲁尔接头附件，内螺纹鲁尔帽，尼龙，25 英尺/包Cole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer 鲁尔接头，外螺纹鲁尔锁塞，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-56
微孔 PTFE 管，0.022 英寸内径 x 0.042 英寸外径，100 英尺/卷Cole-ParmerEW-06417-21管材。需要 1 卷。
Masterflex 铂金固化硅胶管，L/S 13,25 英尺Cole-ParmerEW-96410-13管。需要 ~25 英尺。
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" 壁厚 Tygon 卫生硅胶管美国塑料公司57293管路。需要 ~1 英尺。
真空过滤器Fisher Scientific974107用于无菌过滤介质的 Nalgene 真空过滤器。
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200双隔膜可调流量空气泵，用于曝气和混合介质。需要1个。
0.2 μm 孔针式过滤器Corning International431229这样可以确保来自水族泵的空气不会污染设备。需要 1 个。
Slygard 184 有机硅弹性体套件道康宁Slygard 184用于微流体设备。需要 1 个。
美国安全剃须刀GEM Scientific单刃剃须刀刀片Fisher Scientific17989000用于切割管子和PDMS。 需要1个刀片。
Harris Uni-Core 打孔器 1.2 毫米内径Sigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICH用于冲孔微流体装置中的入口/出口。需要 1 个。
显微镜盖玻片 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-G用于微流体设备。需要 1 个。
带有方形窗口的矩形铝制框架CustomCustomTo support microfluidic channel.外部尺寸：3 英寸 x 1.25 英寸
内部尺寸（切口部分）：7/8 英寸 x 7/8 英寸
厚度：~1/32 英寸
一份 用于需要 加热 个生物反应器的 获得 中获得自定义

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

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