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方法文章

用于微生物光遗传学应用的自动化光照、培养与取样系统的设计与实现

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DOI：

10.3791/54894

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2017年2月19日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

我们设计了一种用于光遗传学系统的连续培养装置，可对微生物培养物进行光照，并利用倒置显微镜定期对流出液中的细胞进行成像。该装置实现了培养、取样、成像及图像分析的全程自动化，从而可在数天内连续测量细胞对光照的动态响应。

摘要

光遗传学系统利用可遗传编码的蛋白质，这些蛋白质在特定波长的光照下发生构象变化，从而调控细胞过程。目前亟需能够整合程序化光照并刺激光遗传学系统的培养与检测装置。本文介绍一种连续培养装置的构建与使用方案，该装置可对微生物细胞施加程序化光照，并自动采集和分析流出液中细胞的图像。该装置以恒化器模式运行，可精确控制细胞生长速率和细胞所处环境。连续培养的流出液被定期取样，细胞通过多通道显微镜成像。整个培养、取样、成像及图像分析过程完全自动化，可在无需人工干预的情况下，连续多天监测流出液细胞的荧光强度与细胞形态的动态变化。我们通过在一个经基因工程改造、携带可激活转录的光遗传学系统的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株中动态诱导蛋白表达，验证了该培养装置的应用价值。

引言

光遗传学系统利用光控制越来越多的细胞过程，包括基因表达1,2,3,4,5、蛋白质定位6、蛋白质活性6,7,8、蛋白质结合8,9,10以及蛋白质降解11。为了充分发挥这些工具在细胞生物学和生物技术研究中的潜力，需要一种能够在受控环境中培养细胞、施加程序化光学刺激，并在生物学相关的时间尺度上测量其响应的方法。本方法利用恒化培养技术，在一个充分混合、通气且温度可控的玻璃培养容器中维持恒定的细胞生长速率12,13，同时对细胞施加程序化光照。我们使用倒置显微镜对流出液中的单个细胞进行成像，以测量培养物对程序化光照的响应。整个培养、取样、成像及图像分析过程完全自动化，可在多天内连续监测流出液中细胞培养物的荧光强度和细胞形态，无需人工干预。

本方案可在大多数熟悉细胞培养和显微镜技术的实验室中实施，所用装置成本低廉，且由易于获取的组件构成。一个透明的培养容器被放置在一组可发射 1 µW/cm2–10 mW/cm2 光强的发光二极管（LED）阵列上方。微生物在培养容器中持续生长；通过一台蠕动泵以稀释速率添加培养基，另一台蠕动泵以较低速率将培养物引出至显微镜，多余液体则通过溢流口排出。加热垫用于维持温度。空气被持续泵入培养容器，以维持正压并实现培养物的混合与通气。除空气泵外，这些设备的供电均由微控制器调节，该控制器还接收来自温度计和连接的台式计算机的输入信号。流出的细胞培养物被泵送至倒置显微镜载物台上的微流控装置。非荧光和荧光图像被自动采集。图像中的细胞由算法进行表征，该算法将每个细胞识别为一个感兴趣区域（ROI），并测量每个 ROI 的各项属性。

为展示本实验方案的应用，我们测量了经基因工程改造、携带蓝光响应光遗传系统的Saccharomyces cerevisiae细胞在不同光强下的反应，该系统可调控荧光蛋白的转录。S. cerevisiae（通常称为酿酒酵母）被选为研究对象，是因为目前已存在多种可在该系统中调控基因表达的光遗传工具14,15,16。此外，该模式生物广泛应用于系统生物学研究17，并常作为生物技术应用的底盘细胞18,19,20。我们的代表性结果表明，通过调节输入光强并检测荧光报告蛋白的表达水平，本方案可用于在数天内持续调控培养物中的基因转录。

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方案

微流控系统示意图：包含泵、LED、微控制器的培养、诱导和测量装置。

图1：连续培养装置。 该简化示意图展示了用于微生物培养、光照以及测量微生物光学特性的装置组装方式。请点击此处查看该图的放大版本。

生物反应器流程图；流程：硬件设置、培养基填充、稀释率、图像采集、分析。
图2：实验方案概览。 阴影区域内的步骤每次使用该方案时都必须重复执行。闭环控制是可行的34，但本方案中未予实现。

1. 将温度计组装到电路板上

用于温度测量装置的 Arduino 与温度计电子电路图。
图3：读取温度计数值的连接方式。 该示意图展示了数字温度计应如何连接至印刷电路板（PCB），以便微控制器能够获取反馈，从而控制培养物的温度。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将数字温度计的接地线、数据线和正电压线焊接到标有“G D +V”的相应通孔中。
  2. 从一个3针母头排针上剪掉一个引脚，并用剪线钳将剩余的两个引脚剪短，使其能够插入标有“R2”的两个通孔中，且不遮挡微控制器。将该排针焊接到位，并在排针的两个焊点之间插入一个4.7 kΩ电阻，使两个焊点连接导通。

2. 将电源控制组件连接到电路板

基于 Arduino 的加热垫电路图，包含继电器和电源。
图 4：加热垫电源控制连接示意图。 该图展示了如何组装印刷电路板（PCB）及附属部件，以实现对加热垫电源的控制。用于控制蠕动泵的部件以类似方式连接。请注意，为清晰起见，图中已省略温度计相关组件。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将五个母头3针排针的引脚各剪短1 cm，并焊接到印制电路板（PCB）上标有“#1”、“#2”、“#3”、“#4”和“C B E”的位置。
  2. 将一个母头6针排针和一个母头8针排针的引脚各剪短1 cm，然后并排焊接到标记为K1至K14的一列通孔中。
  3. 将加热垫连接到电路板。
    1. 将一个100 kΩ电阻的两端插入PCB上标有K1和K2的通孔中。将一个金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）插入PCB上标为#1的位置，MOSFET的标签面朝向K1至K14的通孔，使源极引脚最靠近“#”标记，漏极引脚离“#”标记最远。
    2. 切断5 V直流（DC）电源线的接地线，并将其连接至J2。将加热垫的接地线连接至J1。使用一个1 kΩ电阻将K3连接至引脚3。此时，仅当引脚3设置为+5 V时，电流才会从J1流向J2。
      注：该电阻/MOSFET组合起到开关作用，当微控制器的引脚3设置为+5 V时，允许电流从J1流向J2。
  4. 连接低速蠕动泵。
    1. 将一个100 kΩ电阻的两端插入PCB上标有K4和K5的通孔中。将一个MOSFET插入PCB上标为#2的位置，MOSFET的标签面朝向K1至K14的通孔，使源极引脚最靠近“#”标记，漏极引脚离“#”标记最远。
    2. 切断低速蠕动泵12 V直流（DC）电源线的接地线。将朝向蠕动泵的一端连接至J3，朝向电源适配器的一端连接至J4。使用一个1 kΩ电阻将K6连接至引脚4。此时，仅当引脚4设置为+5 V时，电流才会从J3流向J4。
  5. 连接高速蠕动泵。
    1. 将一个100 kΩ电阻的两端插入PCB上标有K7和K9的通孔中。将一个MOSFET插入PCB上标为#3的位置，MOSFET的标签面朝向K1至K14的通孔，使源极引脚最靠近“#”标记，漏极引脚离“#”标记最远。
    2. 切断高速蠕动泵12 V直流（DC）电源线的接地线。将朝向蠕动泵的一端连接至J5，朝向电源适配器的一端连接至J6。使用一个1 kΩ电阻将K9连接至引脚5。此时，仅当引脚5设置为+5 V时，电流才会从J5流向J6。

3. 将 LED 矩阵连接到电路板

微控制器和电路板设置示意图；电子原型制作的接线连接。
图 5：控制 LED 矩阵的连接方式。 本示意图展示了 LED 矩阵应如何连接到 PCB。同时显示了 PCB 可以堆叠在微控制器上。请注意，为便于说明，图中已省略温度计组件以及用于控制其他设备直流电源的组件。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将6针、10针以及两个8针的母针排针焊接到PCB侧面的通孔中，使其能够堆叠在微控制器上方。
  2. 将100 nF和10 µF电容器焊接到PCB上标示的位置，注意10 µF电容器的负极（较短引脚）应连接到标有负号的通孔。
  3. 将LED驱动器焊接到2×12组通孔上，驱动器上的凹槽应远离为LED矩阵预留的通孔区域。
  4. 在标示用于LED矩阵的通孔上焊接两列公针排针，并修剪面包板下方的引脚末端，以避免妨碍微控制器。将这些引脚连接到两组8芯的母对母跳线排线上，并在跳线排线的另一端连接另一组公针排针。
  5. 将LED矩阵插入面包板中线位置，然后将第二组排针插入矩阵两侧的插孔列中。确保电气连接与LED矩阵直接连接到PCB时相同，且矩阵的标示侧对应PCB上标示的通孔列。
  6. 从一个3针母头排针上剪掉一个引脚，并用剪线钳修剪剩余的两个引脚，使其能够插入标为“R1”的两个通孔中且不阻碍微控制器。焊接该排针，并通过在排针中插入一个1 kΩ电阻来连接这两个焊点。
    注意：培养容器将堆叠在LED矩阵上方。如果排线阻碍了容器的放置，可将排线从矩阵位置偏移，然后使用实心导线连接矩阵引脚与排线引脚，以确保电气连接保持不变。

4. 安装软件并连接硬件

  1. 将PCB板堆叠在微控制器上。
  2. 根据材料清单中的链接，下载适用于该微控制器的集成开发环境（IDE）和自定义代码。
  3. 通过A-B型通用串行总线（USB）电缆将微控制器连接至显微镜计算机。编译并将自定义代码上传至微控制器。
  4. 下载Micro-Manager21,22和FIJI23。通过将Micro-Manager下载目录中的所有“.dll”文件、“mmplugins”文件夹以及“mmautofocus”文件夹复制到“Fiji.app”目录中，将Micro-Manager配置为FIJI插件。同时，将“plugins/Micro-Manager”文件夹复制到“Fiji.app/plugins”目录中。
  5. 将“BioreactorController.jar”文件下载至“Fiji.app/mmplugins”目录中。
  6. 通过FIJI> 插件> Micro-Manager> Micro-Manager Studio打开Micro-Manager。使用硬件配置向导配置软件以控制显微镜。在向导中添加“FreeSerialPort”设备，并标注A-B USB电缆所连接的端口名称。

5. 制作并表征培养容器的避光外壳

  1. 在面包板上 LED 矩阵的每个角落堆叠三个 8 针 IC 插座作为结构单元，使培养容器能够架在它们上方，位于 LED 矩阵之上。
  2. 将部分漫射纸固定在插座顶层下方，使来自 LED 矩阵的光线在照射到培养容器时呈漫射状态。
  3. 裁剪三块尺寸为 8 英寸 × 6 英寸的黑色泡沫板。从前两块的内部切出与电子面包板相同大小（2.3 英寸 × 3.5 英寸）的区域，从第三块内部切出与 IC 插座围成的矩形相同大小（0.9 英寸 × 1.8 英寸）的区域。将这些层叠放在 LED 矩阵上方，使最上层带有 0.9 英寸 × 1.8 英寸开孔的部分与 IC 插座顶部齐平，并包围 LED 矩阵。
  4. 将另一张黑色泡沫板切成两半，得到一块 6 英寸 × 24 英寸的矩形板。将其卷成一个中空的黑色泡沫圆柱体，使培养容器可放入其中，并留有空间容纳管路和导线，从而实现对培养容器的热和光学隔离。
  5. 将中空的黑色泡沫圆柱体居中放置在 LED 矩阵上方，并在其下方的黑色泡沫层上标记出圆柱体的边界。该边界将用于未来确定其中心位置。
  6. 裁剪一块 3 英寸 × 3 英寸的黑色泡沫板，稍后用作盖子，可将其用胶带固定在圆柱体顶部以阻挡外部光线。
  7. 用胶带将光电二极管功率传感器固定在培养容器的盖子上，盖上盖子，并将培养容器插入封闭装置中。
  8. 在 Micro-Manager 中，进入 Plugins > Bioreactor Controller。设置矩阵以在可能强度范围内的一部分强度下，每隔 30 秒进行一次照明。
  9. 记录连接至功率传感器的功率计控制台所显示的光强数值。这些测量值将用于确定当点亮的 LED 数量及对这些 LED 施加的脉宽调制（PWM）电流设定后，实际的光照强度。

6. 准备培养容器

生物反应器装置示意图、硅胶管路连接、培养基转移及培养容器中的流路。
图6：容器连接方式。 本示意图展示了设备中的容器与管路在高压灭菌前应如何连接。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在培养容器中，标记出液体体积从10 mL到30 mL范围内每增加2 mL对应的液面高度。加入10 mL无菌去离子水，标记水位；再加入2 mL，再次标记水位，重复此操作直至标记至30 mL。用透明胶带覆盖标记线，防止磨损，并弃去容器中的液体。
  2. 将铝制接口的长端穿过硅胶垫圈，插入培养容器中，然后拧紧盖子。
  3. 用一段内径为1/16"的硅胶管覆盖一个短铝制接口的出口。将远端封闭：先插入一个雌性鲁尔锁接头，再连接一个雄性鲁尔锁堵头。此出口为备用接口，不会被使用（见图6中的管路6）。
  4. 使用带有雄性和雌性鲁尔锁接头的两段内径为1/16"的硅胶管进行连接。将一端连接至一个短铝制接口出口，另一端用雄性鲁尔接头和雌性鲁尔锁堵头封闭。后续将通过此管路接种培养物（见图6中的管路7/7.1）。
  5. 将两段内径为1/16"的管路连接至内径为1/16"的蠕动泵管及其接头的两端。将其中一端连接至一个短铝制接口，另一端封闭（见图6中的管路4）。之后，此管路将连接至培养基瓶。

7. 准备培养基瓶

  1. 将内径为1/16英寸的硅胶管连接至最长的铝制接口，管子长度应足以到达培养基瓶。将内径为1/8英寸的公鲁尔锁接头连接到一段较短的内径1/16英寸的管子上，再将此段管子与前述管子相连，然后将该短管插入培养基瓶的橡胶塞中（见图6中的管路3）。
  2. 夹紧该管路。此连接允许空气从培养基瓶流向培养容器。当后续向培养基瓶通入空气且此管路松开夹子时，培养物将被混合、通气，并因进入的气泡而维持正压状态。
  3. 将一段足够长的内径1/16英寸的管子插入橡胶塞中，使其可延伸至瓶底，用于转移培养基。将另一段内径1/16英寸的管子与此管连接，再连接一段内径3/16英寸的管子。末端用内径3/16英寸的母鲁尔锁接头和公鲁尔锁堵头封闭（见图6中的管路1/1.1）。
  4. 橡胶塞上的第三个孔应插入一段较短的内径1/16英寸的管子，并连接另外两段中等直径的管子，远端用堵头封闭（见图6中的管路2/2.1）。该管路将连接至真空泵，后续再连接至水族泵。
    注意：若管子难以穿过橡胶塞的孔，可将管子末端斜切。利用斜切端插入孔中后，可顺势将剩余部分拉过。

8. 准备流出液烧瓶

  1. 将一个雄性鲁尔锁接头插入一段内径为1/16"的硅胶管中，然后牢固插入内径为0.022"的聚四氟乙烯（PTFE）管。另取一个雌性鲁尔锁接头连接至一段内径为1/16"的管路。随后，将一端沿PTFE管穿入以连接两个锁接头，另一端连接至一个短铝端口（即图6中的管路5）。
  2. 将暴露的内径为1/50"的硅胶管连接至内径为1/50"的蠕动泵管及接头。在此管路上依次交替连接三段内径为1/50"的管路和两段内径为0.022"的PTFE管。最后通过内径为1/16"的管路（即图6中的管路5）将该组件连接至流出液烧瓶。
  3. 将一段内径为1/16"的硅胶管一端连接至铝端口的第二长管，另一端连接至流出液烧瓶。该铝管用于设定培养液体积，过量的培养液将由此溢流至流出液容器（即图6中的管路8）。
  4. 将整个培养装置在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟（常规灭菌）。
    注意：用于填充培养基烧瓶、对培养基烧瓶抽真空以及接种培养容器的管路均包含多个管段，以便在远端管段被污染时可将其切除，暴露出无菌的下一段管路。

9. 准备微流控通道

  1. 按9:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）与固化剂。脱气后，将其倒入硅胶母模中。
  2. 在65 °C下固化PDMS 2小时，然后用刀片从掩模上切割下来。沿PDMS边缘切割，直至其从模具中释放。避免下压导致脆弱的薄片破裂。
  3. 使用内径为1.2 mm的活检打孔器在通道两端打孔。
  4. 通过等离子体键合将PDMS与盖玻片结合24。
  5. 用胶带将盖玻片的两端固定在支撑用的铝框上，使PDMS通道位于铝框中央，然后再次在65 °C下烘烤2小时。

10. 填充培养基瓶

通过培养容器将培养基从100ml转移至2L烧瓶的真空过滤过程示意图。
图7：添加培养基。 本示意图展示了如何通过真空过滤将培养基转移至培养基烧瓶中，以确保培养基保持无菌状态。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 配制适当的培养基。如果连续培养系统将以恒化器模式运行，则使用特定营养成分受限的培养基。
    注意：有关 S. cerevisiae 研究的标准培养基组成的示例此前已有发表25,26,27,28,29。
  2. 将真空过滤器连接至一个100 ml的瓶子，取下乳头盖，然后用无菌镊子移除真空过滤器乳头上的白色塞子。
  3. 将内径为3/16"的硅胶管连接到乳头，将培养基瓶的另一根游离管连接至真空泵（分别为图7中的管路1和管路2），并确保连接培养基瓶与培养装置的管路已夹紧关闭（图7中的管路3）。
  4. 用培养基填充过滤器，开启真空泵，然后过滤剩余的培养基。夹紧连接真空泵的内径为1/16"的硅胶管（图7中的管路2），并关闭真空泵。
  5. 从连接真空泵的内径为1/16"管路的中间段移除鲁尔接头，以便获得一段未被污染的管路末端。将无菌注射器空气过滤器的蓝色端插入该管路中。
  6. 夹紧内径为3/16"的硅胶管（图7中的管路1），并从中断开雄性鲁尔接头。断开培养装置进液管雌性鲁尔接头上的塞子。连接这两个雄性和雌性鲁尔接头，以使培养基能够被泵入培养装置中。
  7. 移除真空过滤器，并将之前连接在真空过滤器上的100 mL培养基瓶盖上瓶盖。
  8. 在接种培养装置的前一天，将光遗传微生物的单菌落接种至试管中，加入4 mL上一步收集的培养基，在30 °C或该菌株最适生长温度下振荡培养过夜。

11. 在显微镜周围组装装置

  1. 将连续培养装置置于显微镜附近，使培养基储液瓶的位置高于培养容器，流出液收集瓶的位置低于培养容器，从而使由内径为0.022英寸的PTFE管段组成的管路（图中管路5） 图 6) 能够到达显微镜载物台。用胶带将培养基瓶和流出液容器上的橡胶塞牢固固定。
  2. 将内径为 0.022 英寸的 PTFE 管两端从连接它们的内径为 1/50 英寸的硅胶管上拔下（即第 5 号管） 图 6），并将这些端口插入微流控装置的入口和出口。
  3. 将注射器空气过滤器的白色端连接至水族泵。气压会将培养基推入培养容器中。
  4. 当培养基达到流出端口水平时，将内径为1/16英寸的培养基入口管及连接头绕在低速蠕动泵上（管路4） 图 6）以及1/50"内径的样品出口管路和连接件，绕过快速蠕动泵（管路5） 图 6).
  5. 通过松开培养液瓶与培养容器之间的通气管来对培养基进行通气。
  6. 将加热垫和温度计固定在培养容器上，以便控制其温度。将培养基管路盘绕在培养容器周围，使流入的培养基与容器温度保持一致。
    注意：加热垫的脉宽调制（PWM）电流由微控制器调节，微控制器利用温度计的输入信号来维持培养容器在设定温度。
  7. 将培养容器插入LED矩阵上方的黑色泡沫外壳中，并确保管路未被夹住。
  8. 在 Micro-Manager 中，进入插件> 生物反应器控制器。将“培养基泵比率开启”字段设置为 0.1，将“取样泵比率开启”字段设置为 0。流速将非常低，但高于蒸发速率。
  9. 将进气管在培养基瓶与培养容器之间用夹子夹住。取下接种管的塞子（接种管7） 图 6），并通过移液管接种1 mL起始培养物至培养容器中。夹紧并封住该管的远端，以防止污染物进入培养容器，然后松开进气管的夹子。
  10. 用遮光物覆盖培养容器，确保无光线进入，并让培养物过夜生长。

12. 校准泵送速率

  1. 在 Micro-Manager 中，进入插件> 生物反应器控制器。将“培养基泵开启比例”设置为 0.5，将“取样泵开启比例”设置为 0。
  2. 将溢流管从流出液瓶上断开（图中的管路8） 图 6）以及来自流出液烧瓶的采样管（流出液烧瓶中的第8号管） 图 6）并将流出液收集到不同的容器中。在泵启动15分钟后开始收集流出液，持续收集1小时。
  3. 根据培养容器中收集的液体体积，计算培养基流入培养容器的流速，公式如下：
    介质流速公式，随时间变化的流出液，色谱过程方程，教学示意图
  4. 通过以下线性估算调整“媒体泵开启比率”字段的值：
    介质泵流速比方程；流速之比；简洁的化学公式
    其中
    所需培养基流速的计算公式；培养容器体积下的目标稀释率；公式。
  5. 重复此校准程序，直至期望流速与测量流速之间的差异达到要求范围 < 0.2 mL/h，该流速为1小时时间内的平均值。
  6. 增加“采样比率开启”字段的数值，并以类似方式校准，直至大约4/5th 培养容器中流出液体体积的约五分之一由取样泵抽出th 体积的液体正从溢流口流出。
  7. 让连续培养装置中的培养密度在这些条件下平衡过夜。
    注意：如果无法达到目标流速，请更换蠕动泵管。使用直径较大的泵管时，液体流速更高。请执行步骤14，然后返回步骤8.4。

13. 收集培养微生物的显微镜图像

  1. 在 Micro-Manager 中的“载物台位置列表”内设置一组不重叠的位置，使流入微流控通道的细胞图像处于焦平面。
  2. 打开“生物反应器控制器”插件。从提示中选择所需的 LED 矩阵时间序列、成像通道及其他实验参数。采集并分析图像。
  3. 实验运行期间，确保培养基瓶中的培养基保持澄清。若培养基变浑浊，则表明已被污染。

14. 实验后处理

  1. 处理培养基、多余的细胞培养物和废液。
  2. 用 200 mL 20% 乙醇与去离子水的混合液重新填充培养基瓶，按照实验期间的运行方式运行恒化器，以冲洗细胞碎片和残留培养基。
  3. 当酒精溶液从培养基瓶中排尽后，完全拆卸恒化器。
  4. 用温水和温和的洗涤剂清洗玻璃器皿和管路，并用去离子水彻底冲洗，然后晾干。
  5. 打开“microcontrollerRecords.csv”文件，查看实验过程中温度和LED矩阵状态；打开“Summary.csv”文件，查看每组图像的汇总数据；打开“Results.csv”文件，查看每个时间段内各感兴趣区域（ROI）的汇总数据，其中 n 为第 nth 组数据集。

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结果

该装置用于通过基于CRY2/CIB1蛋白对的可诱导光遗传转录系统，对表达黄色荧光蛋白（YFP）的酿酒酵母（S. cerevisiae）进行蓝光刺激30。细胞在磷酸盐限制性培养基中以恒化方式培养，平均稀释速率为0.2 ± 0.008。在酿酒酵母（S. cerevisiae）恒化培养实验中，磷酸盐限制常用于控制生长速率，其影响已有充分表征31,32,33。连续稀释培养容器的流出液被引入倒置显微镜上的微流控装置进行取样。图像自动分析过程如图8所示。通过减去背景的相差图像识别单个细胞，并根据减去背景的荧光图像中测得的荧光强度估算其YFP浓度。

实验持续70小时...

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讨论

我们在设计该装置时充分考虑了灵活性。所使用的所有代码均为免费且开源。默认的细胞分割图像分析流程简单且运行迅速。用户可通过在FIJI图形用户界面中分析一幅代表性图像的同时记录操作输入，将输入转换为BeanShell脚本，然后设置插件调用该脚本，从而实现自定义分析。当插件被调用时，该脚本将接收到一个名为"images"的字符串数组，其中包含最近一组经背景扣除后的图像文件路径。图像和数据在采集过程中会实时保存，以防止实验意外终止时数据丢失。我们选用蓝色LED阵列用于激活光遗传系统，但也可替换为其他颜色的LED。微控制器上还预留了额外的输入输出引脚，印刷电路板（PCB）上也设有额外MOSFET开关和继电器开关的通孔，便于将本系统扩展应用于更复杂的用途。例如，若要将该装置改造为浊度恒定培养系统（turbidostat），可利用微控制器上的额外引脚为LED供电，并读取绑在培养容器上的光传感器数值，然后修改软件以测量浊度并相应地稀释培养液。

必须注意避免污染培养物，保护敏感的显微镜设备，并确保流体流速稳定。在培养容器被有意接种之前若发生污染，可通过在接种前等待数天并确认容器内无任...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Molly Lazar 和 Verónica Delgado 在测试本实验方案过程中提供的帮助，感谢 Kieran Sweeney 提出的有益讨论和编辑建议，感谢 Taylor Scott、My An-adirekkun 和 Stephanie Geller 对手稿的审阅。Megan Nicole McClean 博士获得了 Burroughs Wellcome 基金会“科学交叉领域职业奖”。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
详尽的实验手册GitHubNA在 “Optogenetic Chemostat Files” GitHub 仓库中可获取一份详尽且定期更新的实验手册（https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）。其中还包括用于生成代表性结果所用的微流控模具的说明。
Fritzing 设计查看器FritzingNA用于查看和编辑 .fzz 类型电路板设计的免费开源软件可在 "http://fritzing.org/download/" 获取
Arduino Uno R3（Atmega328，已组装）Adafruit50微控制器，需 1 个。
Arduino 可堆叠引脚套件SparkFun Electronics10007用于连接 PCB 与微控制器的排针母头，需 1 个。
可调 30W 110V 电烙铁 - XY-258 110VAdafruit180用于在 PCB 上建立电气连接，需 1 个。
电烙铁支架Adafruit150用于在 PCB 上建立电气连接，需 1 个。
迷你焊锡卷 - 60/40 含铅松芯焊锡，直径 0.031"，100gAdafruit145用于在 PCB 上建立电气连接，需 1 个。
0.1 μF 电容SparkFun ElectronicsCOM-08375用于稳定 PCB 中的电压，需 1 个。
10 μF 电容SparkFun ElectronicsCOM-00523用于稳定 PCB 中的电压，需 1 个。
MAX7219CNG LED 矩阵/数字显示驱动器 - MAX7219MaximMAX7219CNGLED 驱动器，需 1 个。
8 针 IC 插座Mouser Electronics575-144308需 16 个，将相互堆叠，以支撑培养容器位于 LED 矩阵上方。
24 针 IC 插座Mouser Electronics535-24-3518-10可选，用于可逆地将 MAXIM 7219CNG 驱动器连接至 PCB。
数字万用表Adafruit2034用于电子设备故障排查，需 1 个。
可拆分排针 - 40 针公头（长居中，PTH，0.1"）SparkFun ElectronicsPRT-12693用于连接 LED 矩阵与印刷电路板的公头排针，可用剪线钳裁剪末端，需 1 套。 
平口斜口剪线钳Adafruit152用于裁剪长排针和切断电源线，需 1 个。
优质母对母跳线 - 40 x 12"（300mm）Adafruit793用于连接面包板与 LED 矩阵的排线，可通过公头排针首尾连接以延长，需 1 根。
半尺寸面包板Adafruit64LED 矩阵将连接至此，培养容器将置于其上方。
微型 8x8 蓝色 LED 矩阵Adafruit956光源，主波长为 470nm（蓝色），需 1 个。同一供应商还提供主波长分别为 624 nm（红色）、588 nm（黄色）、525 nm（绿色）、572 nm（黄绿色）和白色的替代微型 LED 矩阵。
可堆叠 3 针排针SparkFun Electronics13875需 8 个。
电阻套件 - 1/4W（共 500 个）SparkFun Electronics10969用于电子电路，需 1 套。
 IRL520N MOSFETInternational RectifierIRL520N用于控制直流电流的电压调节开关，需 4 个。
连接导线 - 混合套装（实心芯，22 AWG）SparkFun ElectronicsPRT 11367用于电子电路的导线，需 1 套。
5V 2A（2000mA）开关电源 - UL 认证Adafruit276为加热垫和 Arduino 供电，需 2 个。
12 VDC 1000mA 稳压开关电源适配器 - UL 认证Adafruit798用于蠕动泵，需 2 个。
电加热垫 - 10cm x 5cmAdafruit1481用于加热生物反应器，需 1 个。
低流量可调蠕动泵Fisher Scientific13-876-1用于泵送培养基，需 1 个。
中流量可调蠕动泵Fisher Scientific13-876-2用于泵送培养液，需 1 个。
9 VDC 1000mA 稳压开关电源适配器 - UL 认证Adafruit63为微控制器供电，订购 1 个。
高温防水 DS18B20 数字温度传感器 + 配件Adafruit642生物反应器用温度计，需 1 个。
MicromanagerMicromanagerNA免费开源的显微镜控制软件可在 "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" 获取
FIJIImageJNA免费开源的图像分析软件可在 "http://fiji.sc/" 获取
Arduino 集成开发环境ArduinoNA免费开源的 IDE 可在 "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" 获取
自定义代码GitHubNA自定义微控制器代码和 "Bioreactor Controller" 插件可在 “Optogenetic Chemostat Files” GitHub 仓库（https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）中获取。
USB 线 A 型转 B 型 - 6 英尺SparkFun ElectronicsCAB-00512用于向微控制器下载数据，需 1 根。
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNA从 CSV 文件加载 LED 矩阵值的优势在于，插件可调用程序根据图像分析结果更新这些值，并将更新后的值重新加载至微控制器，从而实现反馈控制。该文件可从 “Optogenetic Chemostat Files” GitHub 仓库（https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files）获取。
Tota-frost 凝胶（扩散纸）B&HB&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		用于 LED 矩阵，需 1 个。
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24 英寸Grainger, inc20JL37用于培养容器外壳的黑色泡沫，需 4 块。
标准光电二极管功率传感器，Si，200 - 1100 nm，50 mW ThorlabsS120VC用于测量光强，需 1 个。
标签胶带Fisher Scientific159015N用于标记和固定松散部件，需 1 卷。
紧凑型数字功率与能量计控制台，4" LCD 显示屏ThorlabsPM100D用于测量光强，需 1 个。
100mL GL45 杂交玻璃瓶Bellco Glass, Inc.(7910-40150)生物反应器容器，需 1 个。
六通组件Bellco Glass, Inc.Custom 用于生物反应器容器。管路规格：外径 0.125"，内径 0.055"。端口 A：帽塞上方 1.0"，至管底。端口 B、C、E、F：帽塞上方 1.0"，下方 33 mm。端口 D：帽塞上方 1.0"，下方 65 mm 。需 1 个。包括一个直径 45 mm 的聚丙烯开放式螺口盖和一个白色硅胶垫圈，以确保盖与容器之间密封紧密。 
Scotch Magic 胶带 3105，3/4 x 300 英寸，3 卷装AmazonB0009F3P3U透明 Scotch 胶带，可从多个供应商处获取。用于覆盖培养容器上的标记，并固定带有 PDMS 通道的盖玻片与铝制支撑框架。
1/16" 内径 x 3/16" 外径 x 1/16" 壁厚 Tygon 卫生级硅胶管United States Plastic Corp.57288管路，约需 25 英尺。
Cole-Parmer Twistit 白色橡胶塞，10 号Cole-ParmerEW-62992-32培养基瓶和流出液瓶用橡胶塞，需 2 个。
2L 实验室烧瓶Pyrex4980培养基瓶和流出液瓶，需 2 个。
Day 型夹管阀Fisher Scientific5867用于夹闭管路，需 3 个。
替换管路组件 1/16" 内径Traceable Products3372蠕动泵自带一组管路，但使用数周后会磨损。
替换管路组件 1/50" 内径Traceable Products3371蠕动泵自带一组管路，但使用数周后会磨损。
带锁环公鲁尔接头 x 1/16" 软管接头，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-00连接件，约需 10 个鲁尔接头。
带锁环公鲁尔接头 x 1/8" 软管接头，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-04连接件，需 5 个，每个橡胶塞孔需一个用于连接管路。
母鲁尔接头 x 1/16" 软管接头转换器，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45502-00连接件，约需 10 个鲁尔接头。
母鲁尔接头 x 3/16" 软管接头转换器Cole-ParmerEW-45502-08连接件，约需 10 个鲁尔接头。
Cole-Parmer 鲁尔配件，母鲁尔帽，尼龙，25 个/包Cole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer 鲁尔配件，公鲁尔锁塞，尼龙，25 个/包Cole-ParmerEW-45505-56
微孔 PTFE 管，0.022" 内径 x 0.042" 外径，100 英尺/卷Cole-ParmerEW-06417-21管路，需 1 卷。
Masterflex 铂金固化硅胶管，L/S 13，25 英尺Cole-ParmerEW-96410-13管路，约需 25 英尺。
3/16" 内径 x 1/4" 外径 x 1/32" 壁厚 Tygon 卫生级硅胶管United States Plastic Corp.57293管路，约需 1 英尺。
真空过滤器Fisher Scientific974107用于培养基的无菌过滤的 Nalgene 真空过滤器。
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200双膜可调流量气泵，用于通气和混合培养基，需 1 个。 
0.2 μm 孔径注射器滤器Corning International431229确保水族泵输出的空气不会污染装置，需 1 个。
Slygard 184 硅橡胶弹性体套件Dow CorningSlygard 184用于微流控装置，需 1 套。
American Safety Razor GEM 科学级单刃剃须刀片Fisher Scientific17989000用于切割管路和 PDMS，需 1 片。
Harris Uni-Core 打孔器，1.2mm 内径Sigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICH用于在微流控装置上打孔进/出口，需 1 个。
显微镜盖玻片 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-G用于微流控装置，需 1 片。
带方形窗口的矩形铝框架CustomCustom用于支撑微流控通道。外尺寸：3 英寸 x 1.25 英寸。
内尺寸（切口部分）：7/8 英寸 x 7/8 英寸
厚度：约 1/32 英寸

参考文献

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