通过针灸调控大鼠和小鼠的癫痫样皮层脑电图（ECoG）及睡眠

摘要

本文展示了针灸操作、癫痫模型的建立以及啮齿类动物睡眠分析的方法。文中描述了针灸操作过程及穴位的定位。采用匹罗卡品或戊四氮（PTZ）诱导癫痫发作。通过皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）、脑温及运动活动记录来进行睡眠分析。

摘要

中国古代文献记载，针灸对癫痫和失眠具有显著的治疗效果。然而，目前关于这些疗效潜在机制的研究仍十分有限。为了探讨针灸对癫痫和睡眠的影响，需要解决若干关键问题。首先是确定在人类、大鼠和小鼠之间相对应的穴位。此外，还需明确针灸针的进针深度、手动针刺时的捻针幅度，以及电针（EA）刺激的参数设置。为评估针灸对癫痫和睡眠的作用，需要建立一种可行的啮齿类动物癫痫模型。我们通过向大鼠左侧杏仁核中央核（CeA）注射匹罗卡品，以模拟局灶性颞叶癫痫（TLE）。腹腔（IP）注射匹罗卡品可诱导大鼠产生全面性癫痫发作及癫痫持续状态（SE）。在小鼠中，每隔一天进行一次戊四氮（PTZ）腹腔注射，共注射五次，可成功诱导自发性全面性癫痫发作。在大鼠中，采用皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）、脑温及运动活动记录进行睡眠分析；而在小鼠中，则采用ECoG、EMG和运动活动记录进行睡眠分析。通过立体定位手术，将ECoG电极植入额叶、顶叶及对侧枕叶皮层，热敏电阻器植入大脑皮层上方；EMG电极植入颈部肌肉，运动活动由红外探测器测定。觉醒状态的分类标准，包括清醒、快速眼动（REM）睡眠和非快速眼动（NREM）睡眠，依据ECoG、EMG、脑温及运动活动的信息确定。详细的分类标准在文中予以说明。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病，患者在一生中会反复出现癫痫发作。大多数癫痫发作可通过抗癫痫药物（AEDs）得到有效控制。然而，约30%的癫痫患者会发展为难治性癫痫¹癫痫可导致睡眠障碍，而睡眠障碍可能进一步加剧癫痫的复发。有证据表明，癫痫可能在夜间干扰睡眠，也可能导致白天过度嗜睡。^2,3我们之前的研究进一步表明，在昼夜节律时间（ZT）0 发生的癫痫，即光照：黑暗周期中光照期的开始（ZT6）会减少睡眠，这一效应由促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）介导，CRH 是一种稳态因子。在 ZT13（黑暗期的开始）发生癫痫会增强另一种稳态因子白细胞介素-1（IL-1）的表达，从而增加睡眠。当癫痫发生在光照期中期（ZT6）时，睡眠的昼夜节律会发生改变。^4,5另一方面，睡眠问题会进一步加剧癫痫的进展和复发⁶基于上述证据，我们试图揭示一种最佳治疗方案，以同时控制癫痫发作并预防癫痫患者出现睡眠障碍。我们先前发现，采用10 Hz刺激频率的电针（EA）——即将一定强度的电流通过不锈钢针导入穴位——可有效抑制皮层脑电图（ECoG）中的癫痫样放电活动以及癫痫引发的睡眠紊乱⁷. 以100 Hz刺激频率进行的EA会进一步加剧大鼠的癫痫样活动和睡眠障碍^8,9该实验的成功取决于三个因素：首先，一个可行的癫痫动物模型；其次，一种用于啮齿类动物睡眠记录与分析的方法；第三，针灸操作的准确性以及穴位定位的精确性。

癫痫被分为两大主要类型：局灶性癫痫和全面性癫痫。我们关注局灶性颞叶癫痫（TLE）、全面性癫痫、癫痫持续状态（SE）以及自发性全面性癫痫的复发。因此，我们采用不同的操作方法来建立适合实验的癫痫模型。为建立局灶性TLE模型，将低剂量的匹罗卡品注入左侧杏仁核中央核（CeA）。为验证该模型，需在左右半球的额叶（F1 & F2）、顶叶（P1 & P2）和枕叶（O1 & O2）各植入六根ECoG电极，并在两侧小脑区域放置另外两根参考电极（R1 & R2）。此外，通过手术将一根微注射导向套管植入左侧CeA（前囟后2.8 mm；内侧4.2 mm；腹侧7.8 mm，相对于前囟）。上述坐标参考Paxinos和Watson大鼠脑图谱¹⁰。若局灶性TLE成功诱导，则仅来自左侧顶叶皮层（P1）电极的记录（因其靠近左侧CeA）应获得主导的癫痫样ECoG信号，而其他ECoG电极不应记录到显著的癫痫样ECoG活动。通过腹腔（IP）注射匹罗卡品可诱导大鼠产生全面性癫痫和癫痫持续状态（SE），但可能致死。采用五次戊四氮（PTZ）腹腔注射，每次间隔一天，可成功诱导小鼠产生自发性全面性癫痫，同时确保小鼠存活。在小鼠的额叶和顶叶皮层植入两根导线式ECoG电极，用于采集ECoG信号并验证自发性反复发作的癫痫。

多导睡眠图（PSG）是一种用于记录睡眠期间发生的生理变化的综合方法，可客观地将睡眠分为非快速眼动（NREM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠的不同阶段。PSG记录身体功能的多种参数，包括脑电波（脑电图，EEG）、眼动（眼电图，EOG）、骨骼肌张力（肌电图，EMG）、心律（心电图，ECG）以及血氧水平和呼吸参数。在大鼠中，我们记录ECoG、EMG、皮层温度和运动活动，以将觉醒状态分为清醒、NREM睡眠和REM睡眠。小鼠的睡眠分析则基于ECoG、EMG和运动活动的结果进行。通过立体定位手术，将三个ECoG螺钉电极植入大鼠的额叶、顶叶和对侧小脑皮层。根据ECoG、EMG、脑温及运动活动所获取的参数，对采集后的觉醒状态（清醒、NREM睡眠和REM睡眠）进行判定。本方案中详细描述了对大鼠和小鼠行为分类的具体标准。

在进行手动针灸或电针刺激（EA）之前，大鼠和小鼠均需使用低剂量的齐拉西酮（zoletil，25 mg/kg）进行麻醉，该剂量仅为立体定位手术中常规麻醉剂量的一半。此剂量可使动物在注射后30至35分钟内苏醒。手动针灸或电针刺激均在黑暗期开始时进行，每次持续时间为30分钟，每只动物连续接受两到三天的治疗。电针刺激电流通过插入穴位的不锈钢针传递至特定穴位。刺激电流为双相方波脉冲序列，脉冲持续时间为150 ms，刺激强度为1 mA。若采用干针进行手动针灸，则每5分钟捻针10次。手动针灸或电针刺激的关键难点在于准确定位啮齿类动物的穴位。大鼠和小鼠的穴位位置与其在人体中的解剖位置相似。例如，双侧风池穴位于颈部两耳之间，距后正中线3 mm处，与人体风池穴的解剖位置相似¹¹。此外，还可通过检测皮肤上阻抗较低的点进一步确认穴位位置。针灸或电针实验中必须设置假针灸或假电针对照操作。假针灸或假电针应实施于靠近真实穴位的非穴位点，例如腋窝附近¹²。

为了成功研究针灸或电针刺激（EA）对癫痫及癫痫引起的睡眠障碍的影响，必须具备以下条件：可行的癫痫动物模型、对癫痫样皮层脑电图（ECoG）及癫痫复发的精确分析、一种用于分类警觉状态的方法，以及在啮齿类动物中准确实施针灸或电针刺激的技术。

方案

所有实验方案均经中国台湾大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 用于植入皮层脑电图电极、肌电图电极、脑部热敏电阻及注射导向套管的立体定位手术

1. 大鼠（250 - 350 g，6至8周龄Sprague-Dawley大鼠）
   1. 通过腹腔注射50 mg/kg zoletil麻醉大鼠。通过捏压后肢足掌无反应来确认麻醉深度合适。涂抹眼膏，剃除毛发，并用聚维酮碘溶液和75%乙醇对皮肤进行消毒。注射抗生素（青霉素G）以预防感染。
   2. 准备手术刀、剪刀、止血钳、纱布和电凝器用于手术。通过高压灭菌器对手术器械和纱布进行灭菌，电凝器则用75%乙醇消毒。
   3. 将耳杆插入耳道，并将大鼠固定于立体定位仪上。
   4. 使用手术刀沿两耳之间向尾侧延伸的中线在颅骨上做一个约2 cm的正中切口。用止血钳夹住皮瓣以暴露颅骨，并用手术刀去除颅骨表面的组织。
   5. 使用旋转工具在颅骨上钻八个孔（F1、F2、P1、P2、O1、O2、R1和R2），每个孔直径约0.7 mm。将八个皮层脑电图（ECoG）电极分别拧入左右半球的额叶、顶叶、枕叶及小脑。这些电极用于局灶性癫痫的检测。
      1. 记录电极的定位坐标如下：额叶（F1和F2）：前囟前2.0 mm，中线旁2.5 mm；顶叶（P1和P2）：前囟前-2.0 mm，中线旁3.0 mm；枕叶（O1和O2）：前囟前-5.5 mm，中线旁3.0 mm。
      2. 将两个参考电极（R1和R2）置于小脑区域（前囟前-11.0 mm，中线旁4.0 mm）。
   6. 在另一组大鼠中，钻三个孔，并在右侧额叶（F2）和顶叶（P2）皮层上放置两个螺钉式脑电图（EEG）电极，坐标同步骤1.1.5.1所述。在左侧小脑（R1）放置第三个EEG电极，作为接地电极以减少信号伪迹。这些电极用于确认全面性癫痫发作并分析觉醒状态分期。
   7. 分离颈部皮肤和肌肉，并将两个肌电图（EMG）电极插入颈部肌肉中。
   8. 在颅骨上再钻一个孔，将微注射导管插入左侧杏仁核中央核（CeA）（前后位AP：前囟前2.8 mm；内外侧位ML：4.2 mm；背腹位DV：相对于前囟7.8 mm）。坐标参考Paxinos和Watson大鼠脑图谱¹⁰。
   9. 在颅骨上钻一个较大孔（直径1.6 mm），将校准过的30 kV热敏电阻置于顶叶皮层表面，之后用牙科水泥固定，用于监测大鼠皮层温度。
   10. 出现出血时，使用纱布和电凝器止血。
   11. 将来自ECoG电极和EMG电极的绝缘导线引至基座，并将热敏电阻连接至悬吊装置。使用牙科丙烯酸树脂将基座和导管固定于颅骨上。
   12. 切口局部涂抹Polysporin（硫酸多粘菌素B/锌杆菌肽）以预防感染。术后一周内，在饮水中给予动物布洛芬和青霉素G。
2. 小鼠（20 - 30 g，6至8周龄C57BL/6小鼠）
   1. 通过腹腔注射50 mg/kg zoletil麻醉小鼠，并通过捏压后肢足掌无反应确认麻醉深度合适。涂抹眼膏。剃除毛发后，用聚维酮碘溶液和75%乙醇对皮肤进行消毒。注射抗生素（青霉素G）以预防感染。
   2. 将耳杆插入耳道，并将小鼠固定于立体定位仪上。
   3. 使用手术刀沿两耳之间向尾侧延伸的中线在颅骨上做一个约1.5 cm的正中切口。用止血钳夹住皮瓣以暴露颅骨，并用手术刀去除颅骨表面的组织。
   4. 使用手术剪在颅骨上刺两个小孔，并将两个导线式皮层脑电图（ECoG）电极分别置于右侧额叶（F2：前囟前+2.0 mm，中线旁+1.5 mm）和左侧顶叶（P1：前囟前-3.0 mm，中线旁-2.5 mm）。
   5. 分离颈部皮肤和肌肉，并将两个肌电图（EMG）电极插入颈部肌肉中。
   6. 将来自导线式ECoG电极和EMG电极的绝缘导线连接至母端接头和2.54 mm连接器，然后使用牙科丙烯酸树脂将其固定于颅骨上。
   7. 切口局部涂抹Polysporin（硫酸多粘菌素B/锌杆菌肽）以预防感染。术后一周内，在饮水中给予动物布洛芬和青霉素G。
3. 所有动物在开始实验前需恢复7天。
4. 将大鼠或小鼠单独饲养于隔离房间内的独立记录笼中，室温维持在23 ± 1 °C，光照-黑暗（L:D）节律控制为12:12小时循环（40 W × 4管照明）。自由提供食物和饮水ad libitum。
5. 术后一周，通过悬吊装置将ECoG、EMG和热敏电阻连接至放大器，开始记录。

2. 局灶性颞叶癫痫、癫痫持续状态及自发性复发性癫痫的建立

1. 对于大鼠
   1. 使用微量注射泵，通过注射导向套管向左侧杏仁中央核（CeA）注入0.5 µL的匹罗卡品（2.4 mg/µL），注射速率设定为0.2 µL/min，以诱导局灶性颞叶癫痫（TLE）。
   2. 腹腔注射匹罗卡品300 mg/kg，以诱导伴有反复癫痫持续状态的全面性癫痫。
2. 对于小鼠
   1. 在特定的ZT时间点每隔一天腹腔给予戊四氮（PTZ）（0.035 mg/g小鼠体重），连续注射五次可导致自发性且反复发作的全面性癫痫的发生。
3. 对于大鼠和小鼠
   1. 将ECoG信号放大5,000倍，并对0.1至40 Hz之间的模拟信号进行带通滤波。
   2. 使用A/D转换板以128 Hz的采样率将模拟ECoG信号转换为数字信号。
   3. 使用软件进行视觉评分，分析癫痫发作的起始时间和持续时间，并测量时间尺度以表示发作持续时间。
   4. 根据出现振幅大于2 mV且持续时间超过30 s的癫痫样尖峰波来定义ECoG癫痫¹³。

3. 觉醒状态的分类

1. 对于大鼠
   1. 根据12秒记录时段内获取的ECoG、EMG、脑温及运动参数，确定清醒状态。术后一周通过套管将ECoG、EMG和热敏电阻连接至放大器，开始记录。根据步骤3.1.5 - 3.1.7，使用自行开发的软件对状态进行评分。
   2. 使用红外运动探测器测量运动活动，每1秒对信号进行一次积分，并存储信号。
   3. 测量皮层温度并存储信号。
   4. 根据我们先前定义的标准¹⁴对清醒状态进行分类。
   5. 通过以下特征对清醒状态进行评分：低幅ECoG伴高频谱，较高的delta功率（0.5 - 4.0 Hz），较低的theta功率（6.0 - 9.0 Hz）；显著的运动活动；高EMG活动；以及逐渐升高的皮层温度。
   6. 通过以下特征对NREM睡眠进行评分：以大振幅delta波为主的ECoG，EMG活动降低，皮层温度下降，无运动活动。
   7. 通过以下特征对REM睡眠进行评分：ECoG振幅降低，以theta频段为主导，皮层温度突然升高，EMG活动极低，运动活动微弱并伴有身体抽动。
2. 对于小鼠
   1. 在小鼠中重复进行与大鼠相同的清醒状态分类，但不记录热敏电阻的皮层温度。

4. 大鼠手动针刺和电针的操作

1. 为大鼠实施电针（EA）方案进行麻醉。 
2. 通过解剖定位穴位，并确认穴位处皮肤阻抗较低。当检测到低皮肤阻抗时，指示灯会闪烁。 注：风池穴位于两耳之间后正中线旁开3 mm处的颈部位置。
3. 将不锈钢针插入穴位，深度为2 mm。
4. 每5分钟捻动针体10次。
5. 使用功能性电刺激仪，通过针体向穴位输送一连串双相脉冲（每个脉冲持续150 µs），刺激强度为1 mA。
6. 实施假针刺或假电针作为对照。

结果

存在多种大鼠和小鼠模型，可满足不同类型癫痫的研究需求。为诱导局灶性颞叶癫痫（TLE），将0.5 µL的匹鲁卡品（2.4 mg/µL）注射至左侧杏仁核中央核（CeA）。当给予匹鲁卡品后，主要的癫痫样颅外皮层脑电图（ECoG）信号由左侧大脑半球顶叶上的ECoG电极记录获得（图1A: b），其余ECoG电极（图1A: a、c、d、e 和 f）仅检测到极少的癫痫样活动。癫痫样ECoG信号主要在注射匹鲁卡品后立即记录到。这些结果引自文献⁸。上述结果表明，在大鼠中通过向CeA直接注射低剂量匹鲁卡品，可成功诱导局灶性颞叶癫痫。

在注射300 mg/kg 毛果芸香碱（pilocarpine）后5分钟内，即可诱导出...

讨论

为每项实验目的选择可行的癫痫动物模型至关重要。我们的目标之一是阐明电针（EA）对癫痫抑制的作用。电针是一种替代医学疗法，可能对癫痫具有治疗作用，并在古代中医文献中有相关记载。然而，目前仍缺乏科学证据来证实其疗效。为了确定电针对癫痫的影响，我们主要关注电针对轻度局灶性癫痫的作用，而非重度全面性发作或癫痫持续状态（SE）。在之前的研究中，我们采用大鼠局灶性颞叶癫痫（TLE）模型，研究了双侧风池穴低频（10 Hz）和高频（100 Hz）电针刺激对匹罗卡品诱导的局灶性TLE及其引发的睡眠障碍的影响^7-9。结果表明，10 Hz电针刺激双侧风池穴可抑制局灶性TLE及睡眠障碍，而100 Hz电针则会加重局灶性TLE及TLE相关的睡眠紊乱。另一个例子是研究深部脑刺激对难治性癫痫，尤其是全面性发作和癫痫持续状态的作用。我们发现，以高频低强度电流对丘脑前核（ANT）进行单侧深部脑刺激，可有效抑制全面性癫痫的复发及癫痫持续状态的持续时间¹³。此外，我们还利用戊四氮（PTZ）点燃法在小鼠中建立了自发性反复发作的全面性癫痫模型。该PTZ点燃模型可广泛应用于癫痫研究。建立这些癫痫模型的关键步骤在于使用适当的剂量。向杏仁体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物
Zoletil	Virbac		50 mg/kg 腹腔注射
pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503	300 mg/kg 腹腔注射；1.2 mg 微量注射
PTZ	Sigma-Aldrich	P6500	0.035 mg/小鼠
polysporin	Pfizer
手术
ECoG 电极	Plastics One	E363/20	大鼠用螺钉电极
基座	Plastics One	MS363
套管	Plastics One	C315G/spc
热敏电阻	Omega Engineering	44008
牙科丙烯酸树脂	Tempron
立体定位仪	Stoelting		硬脑膜臂
记录设备
ECoG 放大器	Colbourn Instruments	V75-01
A/D 板卡	National Instruments	NI PCI-6033E
基于红外的运动检测器	Biobserve GmbH	定制
ICELUS	G-System
AxoScope 10 软件	Molecular Devices
针灸针具
不锈钢针	上海阳龙医用器材有限公司	32 号 × 1”
电刺激仪	I.T.O., Japan	Trio 300
AcuPen	Lhasa OMS	Pointer Excel II