通过针灸调控大鼠和小鼠的癫痫样皮层脑电图（ECoG）及睡眠

摘要

本文展示了针灸操作、癫痫模型的建立以及啮齿类动物睡眠分析的方法。文中描述了针灸操作过程及穴位的定位。采用匹罗卡品或戊四氮（PTZ）诱导癫痫发作。通过皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）、脑温及运动活动记录来进行睡眠分析。

摘要

中国古代文献记载，针灸对癫痫和失眠具有显著的治疗效果。然而，目前关于这些疗效潜在机制的研究仍十分有限。为了探讨针灸对癫痫和睡眠的影响，需要解决若干关键问题。首先是确定在人类、大鼠和小鼠之间相对应的穴位。此外，还需明确针灸针的进针深度、手动针刺时的捻针幅度，以及电针（EA）刺激的参数设置。为评估针灸对癫痫和睡眠的作用，需要建立一种可行的啮齿类动物癫痫模型。我们通过向大鼠左侧杏仁核中央核（CeA）注射匹罗卡品，以模拟局灶性颞叶癫痫（TLE）。腹腔（IP）注射匹罗卡品可诱导大鼠产生全面性癫痫发作及癫痫持续状态（SE）。在小鼠中，每隔一天进行一次戊四氮（PTZ）腹腔注射，共注射五次，可成功诱导自发性全面性癫痫发作。在大鼠中，采用皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）、脑温及运动活动记录进行睡眠分析；而在小鼠中，则采用ECoG、EMG和运动活动记录进行睡眠分析。通过立体定位手术，将ECoG电极植入额叶、顶叶及对侧枕叶皮层，热敏电阻器植入大脑皮层上方；EMG电极植入颈部肌肉，运动活动由红外探测器测定。觉醒状态的分类标准，包括清醒、快速眼动（REM）睡眠和非快速眼动（NREM）睡眠，依据ECoG、EMG、脑温及运动活动的信息确定。详细的分类标准在文中予以说明。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病，患者在一生中会反复出现癫痫发作。大多数癫痫发作可通过抗癫痫药物（AEDs）得到有效控制。然而，约30%的癫痫患者会发展为难治性癫痫¹癫痫可导致睡眠障碍，而睡眠障碍可能进一步加剧癫痫的复发。有证据表明，癫痫可能在夜间干扰睡眠，也可能导致白天过度嗜睡。^2,3我们之前的研究进一步表明，在昼夜节律时间（ZT）0 发生的癫痫，即光照：黑暗周期中光照期的开始（ZT6）会减少睡眠，这一效应由促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）介导，CRH 是一种稳态因子。在 ZT13（黑暗期的开始）发生癫痫会增强另一种稳态因子白细胞介素-1（IL-1）的表达，从而增加睡眠。当癫痫发生在光照期中期（ZT6）时，睡眠的昼夜节律会发生改变。^4,5另一方面，睡眠问题会进一步加剧癫痫的进展和复发⁶基于上述证据，我们试图揭示一种最佳治疗方案，以同时控制癫痫发作并预防癫痫患者出现睡眠障碍。我们先前发现，采用10 Hz刺激频率的电针（EA）——即将一定强度的电流通过不锈钢针导入穴位——可有效抑制皮层脑电图（ECoG）中的癫痫样放电活动以及癫痫引发的睡眠紊乱⁷. 以100 Hz刺激频率进行的EA会进一步加剧大鼠的癫痫样活动和睡眠障碍^8,9该实验的成功取决于三个因素：首先，一个可行的癫痫动物模型；其次，一种用于啮齿类动物睡眠记录与分析的方法；第三，针灸操作的准确性以及穴位定位的精确性。

方案

所有实验方案均经中国台湾大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 用于植入皮层脑电图电极、肌电图电极、脑部热敏电阻及注射导向套管的立体定位手术

1. 大鼠（250 - 350 g，6至8周龄Sprague-Dawley大鼠）
   1. 通过腹腔注射50 mg/kg zoletil麻醉大鼠。通过捏压后肢足掌无反应来确认麻醉深度合适。涂抹眼膏，剃除毛发，并用聚维酮碘溶液和75%乙醇对皮肤进行消毒。注射抗生素（青霉素G）以预防感染。
   2. 准备手术刀、剪刀、止血钳、纱布和电凝器用于手术。通过高压灭菌器对手术器械和纱布进行灭菌，电凝器则用75%乙醇消毒。
   3. 将耳杆插入耳道，并将大鼠固定于立体定位仪上。
   4. 使用手术刀沿两耳之间向尾侧延伸的中线在颅骨上做一个约2 cm的正中切口。用止血钳夹住皮瓣以暴露颅骨，并用手术刀去除颅骨表面的组织。
   5. 使用旋转工具在颅骨上钻八个孔（F1、F2、P1、P2、O1、O2、R1和R2），每个孔直径约0.7 mm。将八个皮层脑电图（ECoG）电极分别拧入左右半球的额叶、顶叶、枕叶及小脑。这些电极用于局灶性癫痫的检测。
      1. 记录电极的定位坐标如下：额叶（F1和F2）：前囟前2.0 mm，中线旁2.5 mm；顶叶（P1和P2）：前囟前-2.0 mm，中线旁3.0 mm；枕叶（O1和O2....

结果

存在多种大鼠和小鼠模型，可满足不同类型癫痫的研究需求。为诱导局灶性颞叶癫痫（TLE），将0.5 µL的匹鲁卡品（2.4 mg/µL）注射至左侧杏仁核中央核（CeA）。当给予匹鲁卡品后，主要的癫痫样颅外皮层脑电图（ECoG）信号由左侧大脑半球顶叶上的ECoG电极记录获得（图1A: b），其余ECoG电极所记录到的癫痫样活动极少（图1A: a、c、d、e 和 f）。癫痫样ECoG信号主要在注射匹鲁卡品后立即被记录到。这些结果引自文献⁸。上述结果表明，在大鼠中通过向CeA直接注射低剂量匹鲁卡品可成功诱导局灶性颞叶癫痫。

5分钟内，腹腔注射300 mg/kg的匹鲁卡品可诱导产生严重的胆碱能行为效应，例如竖.......

讨论

为每项实验目的选择可行的癫痫动物模型至关重要。我们的目标之一是阐明电针（EA）对癫痫抑制的作用。电针是一种替代医学疗法，可能对癫痫具有治疗作用，并在古代中医文献中有相关记载。然而，目前仍缺乏科学证据来证实其疗效。为了确定电针对癫痫的影响，我们主要关注电针对轻度局灶性癫痫的作用，而非重度全面性发作或癫痫持续状态（SE）。在之前的研究中，我们采用大鼠局灶性颞叶癫痫（TLE）模型，研究了双侧风池穴低频（10 Hz）和高频（100 Hz）电针刺激对匹罗卡品诱导的局灶性TLE及其引发的睡眠障碍的影响^7-9。结果表明，10 Hz电针刺激双侧风池穴可抑制局灶性TLE及睡眠障碍，而100 Hz电针则会加重局灶性TLE及TLE相关的睡眠紊乱。另一个例子是研究深部脑刺激对难治性癫痫，尤其是全面性发作和癫痫持续状态的作用。我们发现，以高频低强度电流对丘脑前核（ANT）进行单侧深部脑刺激，可有效抑制全面性癫痫的复发及癫痫持续状态的持续时间¹³。此外，我们还利用戊四氮（PTZ）点燃法在小鼠中建立了自发性反复发作的全面性癫痫模型。该PTZ点燃模型可广泛应用于癫痫研究。建立这些癫痫模型的关键步骤在于使用适当的剂量。向杏仁体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物
Zoletil	Virbac		50 mg/kg 腹腔注射
pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503	300 mg/kg 腹腔注射；1.2 mg 微量注射
PTZ	Sigma-Aldrich	P6500	0.035 mg/小鼠
polysporin	Pfizer
手术
ECoG 电极	Plastics One	E363/20	大鼠用螺钉电极
基座	Plastics One	MS363
套管	Plastics One	C315G/spc
热敏电阻	Omega Engineering	44008
牙科丙烯酸树脂	Tempron
立体定位仪	Stoelting		硬脑膜臂
记录设备
ECoG 放大器	Colbourn Instruments	V75-01
A/D 板卡	National Instruments	NI PCI-6033E
基于红外的运动检测器	Biobserve GmbH	定制
ICELUS	G-System
AxoScope 10 软件	Molecular Devices
针灸针具
不锈钢针	上海阳龙医用器材有限公司	32 号 × 1”
电刺激仪	I.T.O., Japan	Trio 300
AcuPen	Lhasa OMS	Pointer Excel II