我们介绍了获取人类中枢嗅觉系统可靠功能磁共振成像（fMRI）数据所面临的技术挑战及相应解决方案。内容包括嗅觉fMRI实验范式设计的特殊考虑、使用磁共振兼容嗅觉刺激仪进行fMRI数据采集的描述、气味剂的选择，以及用于数据后处理的专用软件工具。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类嗅觉研究是一个高度复杂且极具价值的领域，其应用范围涵盖从生物医学研究到临床评估的多个方面。目前，由于存在多种技术难题，利用功能性磁共振成像（fMRI）评估人类中枢嗅觉系统功能仍面临挑战。在考虑采用fMRI技术对中枢嗅觉系统功能进行 Mapping 时，需重点关注若干关键变量，包括合适的嗅质选择、嗅质呈现与呼吸之间的相互作用，以及受试者对嗅质可能产生的预期或适应效应。一种基于事件相关、呼吸触发的嗅觉fMRI技术能够精确递送嗅质以刺激嗅觉系统，同时最大限度地减少潜在干扰。结合我们的数据后处理方法，该技术可有效捕捉初级嗅觉皮层中fMRI信号的精确起始时间。本文介绍的技术为获得可靠的嗅觉fMRI结果提供了一种高效且实用的手段。随着我们对人类嗅觉系统复杂性的进一步理解，该技术最终可应用于临床领域，作为阿尔茨海默病和帕金森病等与嗅觉退化相关疾病的诊断工具。
引言
人类嗅觉系统被认为远不止是一个感觉系统，因为嗅觉在体内稳态调节和情绪中也发挥着重要作用。临床上，人类嗅觉系统已知容易受到多种常见神经系统疾病和精神障碍的侵害，例如阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后应激障碍和抑郁症1,2,3,4,5。目前，基于血氧水平依赖（BOLD）对比的功能性磁共振成像（fMRI）是绘制人脑功能最有价值的技术。利用该技术，研究人员已获得了大量关于中枢嗅觉结构（例如，梨状皮层、眶额皮层、杏仁核和岛叶皮层）特定功能的知识6,7,8,9,10。
然而，将功能性磁共振成像（fMRI）应用于人类中枢嗅觉系统及其相关疾病的研究受到两个主要障碍的限制：血氧水平依赖信号（BOLD）的快速适应以及呼吸带来的可变性调节。在日常生活中，当人们持续接触某种气味一段时间后，会迅速对该气味产生适应。事实上，在采用嗅觉fMRI研究时，气味诱发的fMRI信号会因快速适应而迅速减弱，这对刺激范式的设 计构成了挑战8,10,11,12,13,14。初级嗅皮层中最初的 显著BOLD信号仅在气味出现后持续数秒钟。因此，嗅觉fMRI实验范式应避免在短时间内进行长时间或频繁的气味刺激。为了减轻适应效应，一些研究尝试在fMRI范式中交替呈现不同气味。然而，这种方法可能使数据分析更加复杂，因为每种气味都可被视为一个独立的刺激事件。
另一个技术问题源于受试者呼吸模式的变异性；在固定时间范式中，吸气并不总是与气味刺激的给予同步。嗅觉刺激的起始时间和持续时间受到个体呼吸模式的调节，这会干扰fMRI数据的质量和分析。一些研究尝试通过视觉或听觉提示来协调呼吸与气味刺激的起始，以缓解这一问题，但受试者的依从性存在差异，尤其是在临床人群中。此外，与这些提示相关的脑部激活也可能在某些应用中使数据分析更加复杂。因此，在嗅觉fMRI研究中，将吸气与气味递送同步化可能至关重要15。
在嗅觉fMRI研究中，尤其是在数据分析过程中，另一个至关重要的考虑因素是气味剂的选择。确定与感知强度相匹配的合适气味剂浓度，对于在不同实验条件或疾病状态下脑区激活水平的量化与比较具有重要意义。气味剂的选择还必须考虑气味的效价（即令人愉悦的程度），因为已知气味效价会引发嗅觉学习过程中不同的时间动态特征16,17。本次演示选择薰衣草气味在一定程度上正是基于这一原因。根据具体研究目的的不同，其他气味剂可能更为合适。此外，必须尽量减少三叉神经刺激，以降低与嗅觉无直接关联的脑区激活18。
在本报告中，我们演示了一种功能性磁共振成像（fMRI）技术，用于在磁共振环境中使用嗅觉刺激仪建立并运行呼吸触发的实验范式。我们还介绍了一种数据后处理工具，该工具可减少数据采集过程中可能产生的部分时间误差，以期进一步提高数据分析的准确性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
以下实验方案遵循宾夕法尼亚州立大学医学院机构审查委员会的指南，人体受试者在参与研究前已签署书面知情同意书。
注意：为演示目的，本文介绍了一种使用市售磁共振成像兼容嗅觉刺激仪的简单气味刺激范式。该范式已证明可有效减少习惯化效应，并获得可靠的嗅觉功能磁共振成像数据15本方案中所述的某些步骤可能与所使用的嗅觉仪类型有关。然而，任何类型的设备——自制或市售且具备类似功能的设备——均可以类似方式使用。嗅觉仪必须能够监测呼吸，并能以精确的时间顺序递送一系列气味剂。确保整个气味递送系统（包括嗅觉仪）均采用对气味化学物质惰性的材料制成例如，玻璃和聚四氟乙烯），且气味传递路径通畅、密闭，死腔体积最小。
1. 范式设计
- 通过在可编程嗅觉仪上设定气流阀序列来创建新的实验范式。
注意：阀序列是指承载不同浓度或类型气味物质的特定气道开启与关闭的顺序和时序。在本演示中，六个通道的每个阀门均开启两次，共进行十二次气味递送。每当一个阀门开启时，其余所有阀门均处于关闭状态，且每个阀门只有在其他所有阀门均已开启一次后才会再次开启。- 设定刺激（即特定通道开启）的持续时间，以及通道关闭的持续时间。
注意：在本演示中，气味呈现的持续时间为 6 s，而通道关闭的持续时间则在 22 s 至 38 s 之间变化。 - 设定阀门开闭序列的重复次数。此处，重复次数为 1。
- 在每次气味物质呈现之间，插入一次无气味空气的呈现，且保持相同的流速。例如，在相对湿度 50%、室温 22 °C 的条件下，以 6 L/min 的流速向受试者递送含或不含气味的气流。
注意：这一点至关重要，因为气流的变化可能引起触觉感知。
- 设定刺激（即特定通道开启）的持续时间，以及通道关闭的持续时间。
2. 气味物质的制备
- 根据气味的效价、愉悦度、强度、熟悉度以及三叉神经刺激成分，选择适合气味刺激范式的合适气味剂（见表1）。
注意：表1列出了一些常用的气味剂。本演示中选用薰衣草气味，因其在低至中等浓度下三叉神经刺激极小，且通常被认为令人愉悦且熟悉。 - 选择合适的溶剂（例如，水、矿物油、1,2-丙二醇、乙醇）来配制气味剂溶液。
注意：本实验中使用1,2-丙二醇作为配制气味剂溶液的溶剂。 - 为气味刺激范式选择合适的气味剂浓度。例如，将薰衣草油用1,2-丙二醇稀释至0.10%（体积/体积）浓度用于嗅觉刺激19。
注意：可通过一组正常受试者对一系列不同浓度进行心理物理学评估来确定最佳浓度。 - 将配制好的气味剂溶液装入气味容器中。确保所有容器具有相同的空余空间、相同体积的溶液以及溶液相同的暴露表面积。例如，使用六个300 mL的玻璃瓶作为气味容器，每个瓶子装入50 mL的0.10%薰衣草油溶液。
- 将所有气味容器连接至相应的气味递送通道。
3. 气味仪设置
- 检查连接，确保所有气味容器均已正确连接至气味载体。切勿过度拧紧，以免损坏密封。后续步骤中将通过检测每个气味容器的气流来确认是否达到适当的紧固程度。
- 将气味递送装置置于磁体室内，并将每根管路连接至室外部的嗅觉仪，因为主控单元不兼容磁共振环境。目视检查管路是否存在任何弯折，以免影响气流。各通道的气流将在后续步骤中进行检测。
- 将嗅觉仪的所有管路按照编号与对应端口连接，确保连接牢固。为确保准确性，对管路进行颜色编码：1号通道为粉色，2号通道为蓝色。 等等.
- 通过在管路的输出端连接流量计，确保所有通道的气流保持一致。手动打开嗅觉仪控制面板上的每个通道，调节总气流以及各通道和冲洗管线的流速，直至各通道的流速均保持一致。
- 将面罩或鼻罩通过聚四氟乙烯（PTFE）管连接至气味载体。确保气流（例如受试者接收的气体流量（6 L/min）在通道切换时保持一致。
- 将MRI系统的射频触发信号连接至嗅觉仪的“触发输入”端口，以同步气味刺激范式与fMRI图像采集。可能需要使用光电转换器。
- 调节总气流以及每个通道和冲洗管路的流速至设计值。例如，总气流为 6 L/min，每个通道和冲洗管路的流速为 3 L/min。
- 通过气动-电信号转换盒，将气动呼吸传感器带连接到嗅觉仪的响应端口。
- 如果需要主观反应，通过气动-电信号转换盒将气动反应垫连接到嗅觉仪的反应端口。
4. 实验步骤
- 进行预筛查，以确保受试者接受 MRI 检查是安全的。
- 询问受试者的病史，包括是否存在潜在的植入物、幽闭恐惧症或其他可能影响其安全参与 fMRI 研究的既往疾病。此外，还需对受试者进行嗅觉阈值测试，以确保其在实验过程中能够闻到所使用的气味物质。
- 让受试者仰卧于 MRI 检查床上。正确佩戴面罩或鼻罩，确保气流可吹入鼻腔。将呼吸传感器放置于胸部或腹部，并要求受试者正常呼吸。根据嗅觉仪显示屏上显示的呼吸模式，手动调节固定呼吸传感器的绑带松紧度和位置。
- 在嗅觉仪中创建一个数据文件夹，用于记录呼吸数据。点击"文件管理器"，输入分配给当前受试者的受试者编号，然后"确认"输入。
- 使用"范式检查"选项，在不实际递送刺激物的情况下测试气味递送与吸气的同步性；如有必要，手动调整"阀门延迟"时间，以确保气味递送的起始与受试者的吸气阶段同步。
- 通过在嗅觉仪控制单元上选择“trigg-in”模式，设置气味刺激与 fMRI 图像采集之间的同步。
注意：此设置允许通过 MRI 系统发出的外部触发信号经由“trigger in”端口启动气味刺激范式。因此，范式将在接收到扫描仪的外部触发信号后才开始运行。请注意 MRI 扫描仪输出的触发脉冲类型（电信号或光信号），可能需要使用信号转换器来连接两个系统。 - 在嗅觉仪控制单元上选择“resp trigger start”，激活呼吸触发功能。
注意：激活后，每个范式序列元素的启动将与受试者的吸气相同步。可通过经验方法实现，即从呼气相开始后约半个呼吸周期延迟递送气味。 - 在 MRI 控制台上启动 fMRI 图像采集，气味刺激范式将在图像采集开始的同时启动。监测呼吸模式，观察是否存在异常呼吸活动。
注意：异常呼吸活动可能表现为平台期、更宽更长的呼吸周期或不规则波形。本研究采用对 BOLD 信号敏感的 T2* 加权平面回波成像序列进行 fMRI 图像采集，参数如下：重复时间 2,000 ms，回波时间 30 ms，翻转角 90°，视野 220 mm × 220 mm，采集矩阵 80 × 80，轴向切片 30 层，层厚 4 mm，集成并行成像技术的加速因子为 2。 - 成像协议完成后，将受试者移出磁体，并取下面罩/鼻罩。
5. 气味仪清洁
- 关闭气泵。将气味容器从气味载体上拆下，并更换为干净的空容器。
- 启动气泵。用无味空气冲洗每个通道5分钟，以清除气路中残留的气味物质。
- 关闭嗅觉仪。
- 使用酒精湿巾对鼻罩或面罩进行消毒。用温水冲洗面罩或鼻罩，然后自然晾干。
6. 数据分析
- 为处理数据，将呼吸数据文件加载至开源软件嗅觉网络刺激编辑工具（Olfactory Network Stimulation Editing Tool, ONSET）（www.pennstatehershey.org/web/nmrlab/resources/software/onset）15
注意：ONSET 软件由 Xiaoyu Sun 开发。系统将根据实验范式的时间序列和呼吸轨迹自动检测气味刺激的起始点。实际刺激向量定义为气味递送期间每次有效吸气的起始时间。- 测量并比较有气味与无气味时段的呼吸频率和呼吸容积（每次吸气与呼气相配对阶段曲线下面积）15。
注意：有气味与无气味时段的呼吸参数之间应无显著差异。 - 利用 ONSET 提供的实际起始时间与持续时间向量处理功能性磁共振成像（fMRI）数据，以激活中枢嗅觉系统15。
- 测量并比较有气味与无气味时段的呼吸频率和呼吸容积（每次吸气与呼气相配对阶段曲线下面积）15。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1展示了磁共振兼容条件下，嗅觉fMRI在磁体室内和室外的设置。图2a展示了一种标准的固定时序范式，而图2b展示了一种采用“呼吸触发”的范式，可实现气味递送与吸气的同步化。
规律的呼吸模式并具有清晰的吸气峰，对于实现精确的呼吸触发范式至关重要。因此，调整呼吸传感器是实验设置中的重要步骤。图3展示了呼吸传感器安装不正确（图3a）和正确（图3b）时的典型呼吸信号轨迹。如果呼吸模式不规则或呼吸信号出现平台期，嗅觉刺激仪将无法准确判断呼吸模式，气味呈现也就无法与受试者的吸气过程同步。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了获得可靠的嗅觉激活数据，应仔细考虑并正确执行实验步骤。本方案中的关键步骤包括：采用呼吸触发范式，以使气味递送与图像采集同步；配制适当浓度的气味剂，以控制心理物理学反应；搭建嗅觉仪系统，确保获得稳定可靠的呼吸信号和恒定的气流；以及使用ONSET软件对呼吸和气味递送的时间数据进行后处理，以回顾性地校正气味起始时间向量。在实验范式设计和数据分析过程中，需考虑诸如适应、心理物理学反应和呼吸模式等混杂因素。当受试者长时间暴露于气味刺激时，初级嗅觉皮层的激活会在数秒内减弱，因此有必要采用事件相关范式，通过一系列短暂的气味刺激递送来避免此问题。此外，还应密切监测 sniffing（ sniffing ）行为，因为即使在无气味条件下，sniffing 本身也可能引起梨状皮层的激活8。最重要的是，若呼吸与气味递送不同步，则呼吸将成为主要的混杂变量。我们已证明，采用呼吸触发范式实现吸气与气味起始的同步，可产生更为可靠的脑激活信号15。
自由呼吸fMRI方法最常见的问题是气味递送事件与吸气之间的同步性较差...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3T 磁共振扫描仪 | Siemens | 任何型号的磁共振扫描仪均可接受。 | |
| 嗅觉仪 | Emerging Tech Trans, LLC | 任何具备类似功能的嗅觉仪均可接受。 | |
| 6通道气味输送装置 | Emerging Tech Trans, LLC | ||
| 鼻部接口/施加器 | Emerging Tech Trans, LLC | ||
| 聚四氟乙烯管 | Emerging Tech Trans, LLC | ||
| TTL 转换盒 | Emerging Tech Trans, LLC | ||
| 呼吸传感器带 | Emerging Tech Trans, LLC | ||
| 薰衣草油 | 奇华顿香精香料公司 | ||
| 1,2-丙二醇 | Sigma | P6209 | |
| ONSET | www.pennstatehershey.org/web/nmrlab/resources/software/onset | ||
| SPM8 | 英国伦敦大学学院惠康神经影像中心，伦敦，英国 |
参考文献
- Doty, R. L., Reyes, P. F., Gregor, T. Presence of both odor identification and detection deficits in Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 18 (5), 597-600 (1987).
- Hummel, T., et al. Olfactory FMRI in patients with Parkinson's disease. Front Integr Neurosci. 4, 125(2010).
- Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Arch Neurol. 55 (1), 84-90 (1998).
- Pause, B. M., Miranda, A., Göder, R., Aldenhoff, J. B., Ferstl, R. Reduced olfactory performance in patients with major depression. J Psychiatr Res. 35 (5), 271-277 (2001).
- Vasterling, J. J., Brailey, K., Sutker, P. B. Olfactory identification in combat-related posttraumatic stress disorder. J Trauma Stress. 13 (2), 241-253 (2000).
- Anderson, A. K., et al. Dissociated neural representations of intensity and valence in human olfaction. Nat Neurosci. 6 (2), 196-202 (2003).
- Gottfried, J. A., Deichmann, R., Winston, J. S., Dolan, R. J. Functional heterogeneity in human olfactory cortex: an event-related functional magnetic resonance imaging study. J Neurosci. 22 (24), 10819-10828 (2002).
- Sobel, N., et al. Sniffing and smelling: separate subsystems in the human olfactory cortex. Nature. 392 (6673), 282-286 (1998).
- Sun, X., Wang, J., Weitekamp, C. W., Yang, Q. X. A Novel Data Processing Method for Olfactory fMRI Examinations. Proc Intl Soc Mag Res Med. 18 (2010), 1161(2010).
- Zatorre, R. J., Jones-Gotman, M., Evans, A. C., Meyer, E. Functional localization and lateralization of human olfactory cortex. Nature. 360 (6402), 339-340 (1992).
- Boley, J. C., Pontier, J. P., Smith, S., Fulbright, M. Facial changes in extraction and nonextraction patients. Angle Orthod. 68 (6), 539-546 (1998).
- Furman, J. M., Koizuka, I. Reorientation of poststimulus nystagmus in tilted humans. J Vestib Res. 4 (6), 421-428 (1994).
- Loevner, L. A., Yousem, D. M. Overlooked metastatic lesions of the occipital condyle: a missed case treasure trove. Radiographics. 17 (5), 1111-1121 (1997).
- Tabert, M. H., et al. Validation and optimization of statistical approaches for modeling odorant-induced fMRI signal changes in olfactory-related brain areas. Neuroimage. 34 (4), 1375-1390 (2007).
- Wang, J., Sun, X., Yang, Q. X. Methods for olfactory fMRI studies: Implication of respiration. Hum Brain Mapp. 35 (8), 3616-3624 (2014).
- Gottfried, J. A., O'Doherty, J., Dolan, R. J. Appetitive and aversive olfactory learning in humans studied using event-related functional magnetic resonance imaging. J Neurosci. 22 (24), 10829-10837 (2002).
- Popp, R., Sommer, M., Müller, J., Hajak, G. Olfactometry in fMRI studies: odor presentation using nasal continuous positive airway pressure. Acta Neurobiol Exp (Wars). 64 (2), 171-176 (2004).
- Wang, J., et al. Olfactory Habituation in the Human Brain. Proc Intl Soc Mag Res Med. 20, 2150(2012).
- Grunfeld, R., et al. The responsiveness of fMRI signal to odor concentration). Proc. 27th Annual Meeting ACHEMS, , A237-A238 (2005).
- Jia, H., et al. Functional MRI of the olfactory system in conscious dogs. PLoS One. 9 (1), e86362(2014).
- Karunanayaka, P., et al. Networks involved in olfaction and their dynamics using independent component analysis and unified structural equation modeling. Hum Brain Mapp. 35 (5), 2055-2072 (2014).
- Royet, J. P., et al. Functional neuroanatomy of different olfactory judgments. Neuroimage. 13 (3), 506-519 (2001).
- Doty, R. L. Influence of age and age-related diseases on olfactory function. Ann N Y Acad Sci. 561, 76-86 (1989).
- Wang, J., et al. Olfactory deficit detected by fMRI in early Alzheimer's disease. Brain Res. 1357, 184-194 (2010).
- Moessnang, C., et al. Altered activation patterns within the olfactory network in Parkinson's disease. Cereb Cortex. 21 (6), 1246-1253 (2011).
- Vasavada, M. M., et al. Olfactory cortex degeneration in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. J Alzheimers Dis. 45 (3), 947-958 (2015).
- Jacobs, H. I., Radua, J., Lückmann, H. C., Sack, A. T. Meta-analysis of functional network alterations in Alzheimer's disease: toward a network biomarker. Neurosci Biobehav Rev. 37 (5), 753-765 (2013).
- Murphy, C., Cerf-Ducastel, B., Calhoun-Haney, R., Gilbert, P. E., Ferdon, S. ERP, fMRI and functional connectivity studies of brain response to odor in normal aging and Alzheimer's disease. Chem Senses. 30 Suppl 1, i170-i171 (2005).
- Hummel, T., Kobal, G. Differences in human evoked potentials related to olfactory or trigeminal chemosensory activation. Electroen Clin Neuro. 84 (1), 84-89 (1992).
- Cerf-Ducastel, B., Murphy, C. FMRI brain activation in response to odors is reduced in primary olfactory areas of elderly subjects. Brain Res. 986 (1-2), 39-53 (2003).
- Cain, W. S. Contribution of the trigeminal nerve to perceived odor magnitude. Ann NY Acad Sci. 237, 28-34 (1974).
- Murphy, C., Gilmore, M. M., Seery, C. S., Salmon, D. P., Lasker, B. R. Olfactory thresholds are associated with degree of dementia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 11 (4), 465-469 (1990).
- Doty, R. L., Brugger, W. E., Jurs, P. C., Orndoff, M. A., Snyder, P. J., Lowry, L. D. Intranasal trigeminal stimulation from odorous volatiles: Psychometric responses from anosmic and normal humans. Physiol Behav. 20 (2), 175-185 (1978).
- Kobal, G., Hummel, T. Olfactory and intranasal trigeminal event-related potentials in anosmic patients. Laryngoscope. 108 (7), 1033-1035 (1998).
- Frasnelli, J., Lundström, J. N., Schöpf, V., Negoias, S., Hummel, T., Lepore, F. Dual processing streams in chemosensory perception. Front Hum Neurosci. 6, Article 288 (2012).
- Yousem, D. M., et al. Gender effects on odor-stimulated functional magnetic resonance imaging. Brain Res. 818 (2), 480-487 (1999).
- Koulivand, P. H., Ghadiri, M. K., Gorji, A. Lavender and the nervous system. Evid Based Compl Alt Med. 2013, Article ID 681304 (2013).
- Yousem, D. M., et al. Functional MR imaging during odor stimulation: Preliminary data. Neuroradiology. 204 (3), 833-838 (1997).
- Hummel, T., Doty, R. L., Yousem, D. M. Functional MRI of intranasal chemosensory trigeminal activation. Chem Senses. 30 (suppl. 1), i205-i206 (2005).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
