利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

摘要

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法¹²。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。

摘要

由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的神经元为研究神经系统疾病提供了一种极具前景的新工具。在过去十年中，已开发出多种将hiPSCs分化为神经元的实验方案。然而，这些方案通常耗时较长，且存在变异性高、可重复性低和效率不高的问题。此外，通过这些方案获得的神经元通常不够成熟，在单细胞和神经网络水平上的功能活性均不充分，除非进行数月的培养。部分由于这些局限性，目前对hiPSC来源神经元网络的功能特性仍缺乏充分表征。本文中，我们采用了一种近期发表的方案，该方案通过强制表达转录因子neurogenin-2¹²，实现由hiPSCs高效生成人类神经元。该方案快速（3周内即可获得成熟神经元）且高效，转导细胞的转化效率接近100%（DAPI阳性细胞中>95%为MAP2阳性）。此外，该方案可获得同质性的兴奋性神经元群体，有助于研究特定细胞类型在神经系统疾病中的作用。我们对原始方案进行了改进，构建了稳定转导的hiPSC细胞系，从而能够精确控制神经元的总数。随后，利用这些细胞在微电极阵列上构建hiPSC来源的神经元网络。通过该方法，可在保持实验间细胞密度一致的前提下，对hiPSC来源神经元网络的自发性电生理活动进行测量与表征。本方案具有广泛的适用性，尤其适用于针对人类神经元网络的机制性与药理学研究。

引言

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）向人类神经元分化的培养方案开发 体外 为研究神经系统疾病提供了一种强大的新工具。在最近之前，由于缺乏使用人类神经元的模型系统，这些疾病的研究受到严重阻碍。尽管可以利用啮齿类动物研究神经系统疾病，但此类研究的结果难以直接转化为人类应用¹鉴于这些局限性，由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元是一种颇具前景的替代模型，可用于阐明神经系统疾病的分子机制，并用于 体外 药物筛选

在过去十年中，已开发出多种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）转化为神经元的实验方案^2-8。然而，这些方案在许多方面仍存在局限性。首先，这些方案通常耗时较长：获得充分成熟（即 形成突触）并具备功能性活性的神经元需要数月的培养过程，这使得大规模研究难以开展⁹。此外，hiPSC向神经元转化的效率较低。这些方案常常产生异质性的神经元群体，因而无法用于特定神经元亚群的研究。而且，这些方案的可重复性差，对不同的iPSC细胞系往往得到不同的结果^10,11。最后，所获得神经元的成熟阶段和功能特性也存在较大变异性¹⁰。

为了解决这些问题，Zhang et al. (2013)¹² 开发了一种通过过表达转录因子 neurogenin-2 快速且可重复地从 hiPSCs 生成人类神经元的实验方案。作者报道，该方法的分化过程相对较快（在诱导 neurogenin-2 表达后仅需 2 至 3 周），具有良好的可重复性（神经元特性不依赖于起始的 hiPSC 细胞系），且 hiPSC 向神经元的转化效率极高（接近 100%）。采用该方案生成的神经元群体具有高度均一性（类似于上层皮层神经元），可用于研究特定细胞类型在神经疾病中的作用。此外，这些由 hiPSCs 分化而来的神经元在培养仅 20 天后即表现出成熟特征（例如，形成突触的能力以及显著的功能性电活动）。

在利用人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术研究人类疾病之前，表征hiPSC来源神经元在神经网络水平上的电生理特性是一项重要的前提条件。因此，近年来许多研究团队已开始使用微电极阵列（MEA）装置（Multichannel Systems，德国雷特林根）在神经网络水平上研究干细胞来源的神经元^13-16MEA 的电极嵌入在一种基底材料中，该基底可用于培养神经元细胞。MEA 可用于研究神经网络的电生理特性以及 体外 其活性的发育。目前，微电极阵列（MEAs）仅与需要数月时间才能形成成熟神经网络的分化方案联合使用。因此，将MEAs与快速分化方案相结合，将有助于推动该技术在神经系统疾病大规模研究中的应用。

本文中，我们对 Zhang et al. (2013)¹² 的实验方案进行了改进，并将其适配用于多电极阵列（MEA）。具体而言，我们并未采用急性慢病毒转导，而是在诱导分化前，构建了稳定表达 rtTA/Ngn2 的人诱导性多能干细胞（hiPSC）细胞系。我们这样做的主要目的是为了可重复地控制神经元细胞密度，因为神经元细胞密度对神经网络的形成以及神经元与MEA电极之间的良好接触至关重要^17,18。尽管 Zhang et al. 的方案在转导的 hiPSC 转化效率方面非常高，但其最终获得的神经元产量相对于初始接种的 hiPSC 数量具有固有的变异性（参见 Zhang et al. 中的图2E）¹²。使用稳定细胞系可消除许多导致变异性的因素，例如慢病毒毒性及感染效率的差异。随后，我们优化了在 MEA 上可靠生成 hiPSC 来源神经元网络的各项参数，并在第三周即观察到网络成熟（例如，涉及大多数通道的同步化放电事件）。这一快速且可靠的实验方案将有助于对来自不同（即 患者特异性）hiPSC 系的神经元进行直接比较，并为药理学研究提供高度一致的实验平台。

方案

所有动物实验均按照荷兰拉德堡德大学医学中心动物护理委员会（Radboud University Medical Centre, Animal Care Committee, Netherlands）批准的动物护理和使用指南进行（批准编号：RU-DEC-2011-021，方案编号：77073）。

1. 胶质细胞的分离与培养

注意：本方案基于 McCarthy 和 de Vellis¹⁹ 的研究工作，另有针对小鼠星形胶质细胞的非常相似的详细方案可供参考²⁰。为从胚胎期（E18）大鼠脑中建立皮质星形胶质细胞的原代培养，需处死一只怀孕大鼠，从子宫中取出胚胎，并从胚胎中分离脑组织。为填满一个 T75 培养瓶，需合并来自 2 个胚胎脑的皮质组织。作为替代方案，也可购买 commercially available purified and frozen astrocytes（ commercially available purified and frozen astrocytes）。

1. 准备T75培养瓶
   1. 将聚-D-赖氨酸（PDL）用无菌超纯水稀释至终浓度为10 µg/mL。向T75培养瓶中加入5 mL稀释后的PDL溶液，轻轻晃动使整个生长表面充分润湿。将培养瓶置于37 °C、湿度饱和的培养箱中孵育3小时。
   2. 吸除培养瓶中的PDL溶液。用5 mL无菌水重复冲洗3次，以去除未结合的PDL。彻底吸除水分后，将培养瓶置于超净台中晾干，或立即使用。
2. 大脑皮层的解剖分离
   1. 配制50 mL解剖液：Lebovitz's L-15培养基中加入2%（v/v）B-27补充剂。置于冰上保存。
   2. 将大鼠放入异氟烷诱导室（小型有机玻璃盒）中进行深度麻醉，直至呼吸停止（约5–8分钟）。取出大鼠后立即通过颈椎脱位法实施安乐死。
   3. 用70%乙醇喷洒大鼠腹部，并擦去多余液体。使用剪刀经剖腹产方式暴露并取出母鼠子宫²¹。
   4. 用剪刀将各个胚胎从羊膜囊中剪下，转移至盛有冷解剖液的无菌培养皿中，并保持在冰上。
   5. 将胚胎再次转移至另一个新的、盛有冷解剖液的无菌6 cm培养皿中。在体视显微镜下取出胚胎的大脑。为暴露大脑，用镊子轻轻剥离皮肤和颅骨。小心地将整个大脑挖出，并转移至盛有新鲜冷解剖液的35 mm培养皿中。
      注意：从胚胎中分离出的完整大脑可在冰上的解剖液中保存数小时，而不会丧失细胞活性。
   6. 使用尖头弹簧剪刀或手术刀沿中线切开，分离左右两个大脑半球。用直头尖镊仔细剥离软脑膜。
      注意：彻底去除软脑膜至关重要，这可以防止成纤维细胞污染星形胶质细胞培养物。成纤维细胞增殖迅速，最终会取代其他细胞。
   7. 使用弹簧剪刀或手术刀切除中脑/纹状体和嗅球。同时确保用弹簧剪刀或手术刀将海马体（位于皮层后方及中线旁的C形结构）一并切除。将皮层半球收集至含有5 mL解剖液的15 mL离心管中，保持在冰上。
3. 皮层组织的解离
   1. 配制2 mL不含Ca²⁺/Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS），加入0.25%胰蛋白酶（解离液）。另配制50 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），加入15%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素/链霉素（培养液），经滤器除菌。
   2. 让组织自然沉降至离心管底部。小心吸除组织上方尽可能多的解剖液。用5 mL不含胰蛋白酶的Ca²⁺/Mg²⁺-free HBSS洗涤组织，并让组织再次沉降至管底。
   3. 小心吸除HBSS。加入2 mL解离液，轻轻弹击管壁使酶液充分接触组织。将管子置于37 °C水浴中孵育5–10分钟。孵育过程中多次轻弹管壁以搅动组织。
   4. 立即使用1000 µL移液枪头反复吹打组织。将移液器体积设为约800 µL，吸取组织碎片后用力吹向液面以上的管壁。注意尽量减少气泡或泡沫产生。重复吹打约15–20次，直至组织充分解离。加入8 mL培养液以终止胰蛋白酶活性。通过反复倒置管子轻轻混匀。
   5. 将细胞悬液通过置于50 mL离心管口的70 µm细胞筛网过滤。用培养液冲洗原15 mL离心管，并将冲洗液也通过同一筛网滤入50 mL离心管中。再用培养液多次冲洗细胞筛网。冲洗完成后，最终体积应约为20–25 mL。
   6. 在200 × g条件下离心10分钟以收集细胞。小心吸除尽可能多的上清液，避免触碰细胞沉淀。用1000 µL移液器将细胞重悬于1 mL培养液中。加入11 mL预热的培养液，使用10 mL移液器轻轻混匀（避免产生气泡）。
   7. 用5 mL培养液冲洗一次PDL包被的T75培养瓶，吸除冲洗液后将细胞悬液转移至该培养瓶中。所有细胞均直接接种，由于在悬液中无法区分星形胶质细胞与其他细胞，通常无需进行细胞计数。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂、湿度饱和的培养箱中培养两天。
4. 星形胶质细胞的扩增与维持
   1. 首次换液在初次接种后第2天 进行，之后每3天更换全部培养液。每次添加新鲜培养液前均需预热至37 °C。
      注意：星形胶质细胞需要7–10天 才能达到约90%融合度（此时星形胶质细胞呈现为紧密排列的镶嵌状单层，小胶质细胞和少突胶质细胞则附着在其表面并混杂其中）。
   2. 当星形胶质细胞达到约90%融合度时，通过震荡去除污染的胶质细胞：
      1. 从培养箱中取出培养瓶，拧紧瓶盖（酚盖）或封闭通气口（滤膜口）。为去除小胶质细胞，将培养瓶置于轨道摇床上，以180 rpm速度震荡1小时。吸除培养液，用5 mL预热的培养液冲洗一次，吸除后加入12 mL新鲜培养液。
      2. 为去除少突胶质细胞，将培养瓶重新放回轨道摇床，在37 °C下以250 rpm速度至少震荡7小时，最好过夜。
      3. 吸除培养液，用5 mL预热的培养液冲洗一次，吸除后加入12 mL新鲜培养液。将培养瓶放回培养箱继续培养。
      4. 当细胞达到100%融合时，按照1:3至1:2的比例，使用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）进行传代。一个100%融合的T75培养瓶通常可获得约4.0 × 10⁶个细胞。按此方案，通常每周可传代一次。
         注意：当星形胶质细胞达到融合状态后，即可收获并用于后续hiPSC分化实验（见第3.4步操作步骤）。星形胶质细胞至少可传代一次而不明显影响其活力。细胞可在培养中维持长达2个月。根据经验，原代胚胎第18天大鼠星形胶质细胞在多次传代后会逐渐趋于终末分化或活力下降。尽管可将星形胶质细胞冻存以备将来使用，但我们更倾向于在需要时直接从新鲜胚胎脑组织中分离获取。

2. 生成 rtTA/Ngn2 阳性的 hiPSCs

注意： 实验所用的hiPSCs系通过慢病毒转导技术，将重编程因子cMYC、SOX2、OCT4和KLF4导入人成纤维细胞而自行制备。

注意：为了生成 rtTA/Ngn2 阳性的 hiPSCs，使用慢病毒载体将外源基因稳定整合到 hiPSC 基因组中。慢病毒的制备方案此前已有发表²²。用于产生 rtTA 和 Ngn2 慢病毒颗粒的慢病毒包装载体的详细信息见于材料/设备表中。rtTA 慢病毒所用的转移载体为 pLVX-EF1α-(Tet-On-Advanced)-IRES-G418(R)；即 该载体在组成型 EF1α 启动子控制下编码 Tet-On Advanced 转录激活因子，并赋予细胞对 G418 抗生素的抗性。Ngn2 慢病毒所用的转移载体为 pLVX-(TRE-thight)-(MOUSE)Ngn2-PGK-Puromycin(R)；即 该载体在 Tet 可调控启动子控制下编码小鼠 neurogenin-2 基因，在组成型 PGK 启动子控制下编码嘌呤霉素抗性基因。因此，利用这两个转移载体可构建一种 hiPSC 细胞系，其小鼠 neurogenin-2 的表达可通过在培养基中添加多西环素来诱导。在对 hiPSCs 进行转导时，直接使用含有慢病毒颗粒的上清液（下文中称为“慢病毒悬液”），即 无需通过超速离心浓缩病毒颗粒。

1. 接种 hiPSCs（第 1 天）
   注意： 本方案中提及的体积均基于以下假设：hiPSCs 在6孔板中培养，并收获一个孔的细胞；此外，假设后续将细胞接种至12孔板中的12个孔。
   1. 配制10 mL冷的DMEM/F12培养基，加入1%（v/v）基底膜基质（BMM），制成稀释的BMM。每孔加入800 µL稀释后的BMM至12孔板中。在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育至少1小时。₂使用前，在室温下孵育平板1小时。
   2. 将15 mL含1%（v/v）青霉素/链霉素、9 mL DMEM/F12和1 mL细胞解离液（CDS）的Essential 8（E8）培养基预热至室温。向E8培养基中添加Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。
   3. 吸弃hiPSCs的旧培养基，加入1 mL CDS。在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育3 - 5 min₂在显微镜下观察细胞是否相互脱离。
   4. 在孔中加入 2 mL DMEM/F12，用 1,000 µL 移液器轻轻重悬细胞，并将细胞转移至 15 mL 离心管中。向细胞悬液中加入 7 mL DMEM/F12。在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
   5. 吸弃上清液，加入2 mL预先配制的E8培养基。将1,000 µL移液枪枪头紧贴15 mL离心管管壁，轻轻吹打使细胞重悬，获得单细胞悬液（确保hiPSCs分散，不形成细胞团块）。在显微镜下检查细胞是否已充分解离。
   6. 使用血细胞计数板确定细胞数量（细胞/毫升）。
      注意： 一个6孔板孔在80-90%汇合度时通常可获得3.0-4.0 x 10⁶个细胞。⁶ 细胞总数。
   7. 吸弃12孔板各孔中的稀释BMM。将细胞稀释至细胞浓度为3.0 × 10⁶个/mL的细胞悬液⁴ 细胞/mL。每孔加入1 mL细胞悬液至12孔板中。将12孔板置于含5% CO₂的湿润化37 °C培养箱中过夜培养。₂.
2. 将iPS细胞进行转导 rtTA 和 Ngn2 慢病毒（第2天）
   1. 将12 mL E8培养基与1% (v/v) 青霉素/链霉素在室温下预热。向E8培养基中添加ROCK抑制剂和polybrene，使其终浓度达到8 µg/mL。
   2. 解冻含有慢病毒悬液的分装样品。向慢病毒悬液中加入聚凝胺，使其终浓度为 8 µg/mL。吸除旧培养基，每孔加入 1 mL 已配制的 E8 培养基。
   3. 使用不同量的进行转导 rtTA- 和 Ngn2-lentivirus 悬液。例如，通过加入 100 µL 的两种 hiPSCs 进行转导 rtTA-慢病毒和 Ngn2-将慢病毒悬液加入12孔板的一个孔中。对于其他孔，分别使用200 µL、300 µL、400 µL和500 µL慢病毒悬液替代100 µL。12孔板中的两个孔的hiPSC不应进行转导，作为筛选过程中的对照。
      注意： 转导实验最好设置重复，以便在筛选开始后更准确地评估转导效率（参见实验方案步骤2.2.4）。有效转导大部分hiPSC所需的慢病毒悬液用量取决于慢病毒悬液的滴度以及所使用的hiPSC细胞系。在本研究中，我们通常使用100–500 µL的慢病毒悬液进行hiPSC转导。
   4. 将12孔板置于含5% CO2的湿润化37 °C培养箱中₂ 孵育6小时。在6小时孵育期结束前，将12 mL E8培养基和12 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）恢复至室温，并分别加入1%（v/v）青霉素/链霉素。向E8培养基中添加ROCK抑制剂。
   5. 吸弃用过的 E8 培养基。每孔加入 1 mL DPBS 洗涤。每孔加入 1 mL 预先配制的 E8 培养基。将 12 孔板置于含 5% CO₂ 的湿润化 37 °C 培养箱中过夜培养。₂.
3. 更换 E8 培养基（第 3 天）
   1. 将12 mL含1%（v/v）青霉素/链霉素的E8培养基预热至室温。吸除12孔板各孔中的废弃培养基，每孔加入1 mL已准备好的E8培养基。将12孔板置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中过夜₂.
4. 使用嘌呤霉素和G418进行筛选（第4–8天）
   注意： 根据hiPSC细胞系的分裂速率和慢病毒转导效率，在筛选期间细胞可能达到70–80%的融合度，此时需要对培养物进行传代。由于传代时间无法预先确定，因此本方案中不会提及具体操作。然而，此时可按照常规hiPSC培养方式对hiPSC培养物进行传代（包括将细胞接种至包被有纤连蛋白的培养板上），而不必更换添加了指定浓度嘌呤霉素和G418的E8培养基。唯一例外的是，E8培养基中仍需补充指定浓度的抗生素以维持筛选。
   1. 将12 mL E8培养基加入1%（v/v）青霉素/链霉素，室温预温。加入嘌呤霉素和G418用于筛选；在筛选期间加入不同量的抗生素（表1).
   2. 通过估算G418和嘌呤霉素抗性细胞的百分比来评估转导效率。为估算抗性细胞的百分比，需分别估算不同条件下（即用不同量的慢病毒悬液转导的培养物）以及非转导细胞（作为筛选对照的细胞）中死亡细胞（非抗性细胞）的百分比。抗性细胞的百分比按公式计算：[100% -（死亡细胞百分比）]。
      注意： 如果使用不同量的慢病毒悬液进行转导时设置了重复孔，则可更准确地估计转导效率。未转导细胞的组别作为筛选对照；经不同量慢病毒悬液转导的培养物中，死亡细胞百分比应较低。根据估算的抗性细胞百分比，用于选择可能同时携带两个转基因的hiPSCs。通常，我们选择来自转导条件的hiPSCs >90%的细胞存活了5天 筛选周期
   3. 吸弃hiPSCs的旧培养基，向各孔加入1 mL已配制好的E8培养基。将12孔板置于含5% CO₂的湿润化37 °C培养箱中过夜₂.

	G418 的终浓度	嘌呤霉素的终浓度
第 4 天	250 µg/mL	2 µg/mL
第 5 天	250 µg/mL	2 µg/mL
第 6 天	250 µg/mL	1 µg/mL
第 7 天	250 µg/mL	1 µg/mL
第 8 天	250 µg/mL	1 µg/mL

表1：筛选期间抗生素的浓度 嘌呤霉素和G418在5天内的浓度 选择周期的

5. 停止筛选，开始常规培养（第9天及以后）
   1. 5天后 筛选期，培养 rtTA/Ngn2阳性hiPSCs与正常hiPSCs相同，只是细胞的E8培养基中添加了G418，终浓度为50 µg/mL，同时添加了嘌呤霉素，终浓度为0.5 µg/mL。
      注意： 细胞现在可以按照细胞冷冻保存的标准方案进行冻存，以作为备份。这是确保分化方案可重复性的重要步骤，因为它允许使用同一批次的 rtTA/Ngn2阳性 hiPSCs，适用于未来的多种分化实验。

3. 在6孔MEA和玻璃盖玻片上将rtTA/Ngn2阳性的hiPSCs分化为神经元

注意：本方案中，提供了在两种不同基质上诱导 rtTA/Ngn2 阳性人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化的详细步骤，即 i.e. 6孔微电极阵列（MEA）（每孔包含9个记录电极和1个参考电极的6个独立孔）以及24孔板各孔中的玻璃盖玻片。然而，通过根据表面积按比例放大所述数值，该方案可轻松适用于更大的基质（e.g.，12- 或6孔板的孔）。

1. 准备多电极阵列（MEAs）或玻璃盖玻片（第0天和第1天）
   1. 在诱导分化开始的前一天，根据制造商的建议对MEAs进行灭菌处理。
   2. 将黏附蛋白聚-L-鸟氨酸（PLO）用无菌超纯水稀释至终浓度为50 µg/mL。通过在每个6孔MEA孔中加入100 µL稀释后的PLO液滴，覆盖其活性电极区域。使用无菌镊子将盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入800 µL稀释后的PLO。用1000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
   3. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。次日，吸除稀释的PLO溶液，并用无菌超纯水清洗6孔MEA的玻璃表面和盖玻片两次。
   4. 将层粘连蛋白（laminin）用冷的DMEM/F12培养基稀释至终浓度为20 µg/mL（用于6孔MEA）和10 µg/mL（用于玻璃盖玻片）。立即在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL稀释后的层粘连蛋白进行包被。同样，在24孔板的每个孔中加入400 µL稀释后的层粘连蛋白以包被盖玻片。用1,000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
   5. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育至少2小时。
2. 接种hiPSCs（第1天）
   注意： 步骤3.2.1至3.2.4中提到的体积假设rtTA/Ngn2阳性hiPSCs在6孔板中培养，并且收获一个孔的细胞。接种细胞至6孔MEA和/或盖玻片所需的体积取决于实验中使用的6孔MEA数量和/或盖玻片数量；步骤3.2.6至3.2.8中指定的数值允许根据不同的实验规模进行调整。
   1. 将DMEM/F12、CDS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的E8培养基恢复至室温。向E8培养基中加入强力霉素至终浓度4 µg/mL，并加入ROCK抑制剂。
   2. 吸除rtTA/Ngn2阳性hiPSCs的旧培养基，加入1 mL CDS。在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育3–5分钟。在显微镜下检查细胞是否彼此分离。
   3. 向孔中加入2 mL DMEM/F12，用1,000 µL移液枪轻轻吹打悬浮细胞，并将细胞转移至15 mL离心管中。向细胞悬液中再加入7 mL DMEM/F12。在200 × g条件下离心5分钟。
   4. 吸除上清液，加入2 mL预配的E8培养基。用1,000 µL移液枪头抵住15 mL管壁轻轻吹打，使hiPSCs解离。在显微镜下检查细胞是否已充分解离。
   5. 使用血细胞计数板测定细胞数量（细胞/mL）。
      注意： 一个6孔板孔在80–90%融合度时通常可收获约3.0–4.0 × 10⁶个细胞。
   6. 吸除稀释的层粘连蛋白。对于6孔MEA，将细胞稀释至7.5 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液，通过在每个孔的活性电极区域加入100 µL细胞悬液进行接种。对于盖玻片，将细胞稀释至4.0 × 10⁴ 个细胞/mL的细胞悬液，向24孔板的每个孔中加入500 µL细胞悬液。
      注意： MEAs上的最终细胞密度高于盖玻片上的密度（图1A和B）。我们发现，较高的细胞密度对于准确记录神经网络活动至关重要。本方案中提供的数值已被验证为检测中的最优条件。
   7. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育2小时（MEA）或过夜（24孔板）。
   8. 2小时后，向6孔MEA的每个孔中小心加入500 µL预配的E8培养基。将6孔MEA置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
3. 更换培养基（第2天）
   1. 次日，配制含1%（v/v）N-2补充剂、1%（v/v）非必需氨基酸和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。加入人重组神经营养因子-3（NT-3）至终浓度10 ng/mL，人重组脑源性神经营养因子（BDNF）至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。将培养基预热至37 °C。
   2. 向培养基中加入层粘连蛋白至终浓度0.2 µg/mL。过滤所得培养基。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
4. 添加大鼠星形胶质细胞（第3天）
   注意： 本方案中提到的体积假设大鼠星形胶质细胞在T75培养瓶中培养。所添加的大鼠星形胶质细胞质量必须良好。我们采用两个标准评估大鼠星形胶质细胞的质量：第一，从大鼠胚胎脑组织分离后，星形胶质细胞应在十天内达到完全融合；第二，传代后，星形胶质细胞应能形成致密、呈铺路石状的单层（图1C）。若大鼠星形胶质细胞培养物不符合这两个标准，建议不要用于分化实验。
   1. 将0.05%胰蛋白酶-EDTA恢复至室温。将DPBS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12预热至37 °C。
   2. 吸除大鼠星形胶质细胞培养物的旧培养基。加入5 mL DPBS轻轻晃动清洗。
   3. 吸除DPBS，加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，轻轻晃动使其覆盖瓶底。在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育5–10分钟。
   4. 在显微镜下检查细胞是否已脱落。通过轻敲培养瓶数次使剩余细胞脱落。
   5. 向培养瓶中加入5 mL DMEM/F12。用10 mL移液枪在瓶内轻轻吹打细胞。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。在200 × g条件下离心8分钟。
   6. 吸除上清液，用1 mL DMEM/F12重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞数量（细胞/mL）。
   7. 向每个6孔MEA孔中加入7.5 × 10⁴个星形胶质细胞。向每个24孔板孔中加入2.0 × 10⁴个星形胶质细胞。将MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
5. 更换培养基（第4天）
   1. 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，强力霉素至终浓度4 µg/mL。此外，加入阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside）至浓度2 µM。
      注意： 添加阿糖胞苷是为了抑制星形胶质细胞增殖，并清除未向神经元分化的残留hiPSCs。
   2. 过滤培养基并预热至37 °C。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板维持在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中。
6. 更换培养基（第6–28天）
   注意： 从第6天开始，每隔两天更换一半培养基。从第10天起，培养基中补充FBS以支持星形胶质细胞的存活。
   1. 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，强力霉素至终浓度4 µg/mL。从第10天起，还需在培养基中补充2.5%（v/v）FBS。过滤所得培养基并预热至37 °C。
   2. 使用1000 µL移液枪从6孔MEA和24孔板各孔中移除一半旧培养基，并替换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板维持在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中。

4. 建立人诱导多能干细胞衍生神经元的神经生理学特征

注意：在诱导分化后两到三周，可将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元用于不同的下游分析。本节提供了若干可执行的下游分析示例，以建立hiPSC来源神经元的神经生理学特征。

1. 使用微电极阵列（MEAs）表征神经元网络活动
   1. 记录在微电极阵列（MEAs）上培养的人诱导多能干细胞（hiPSC）来源神经元的20分钟电生理活动。记录期间，维持温度为37 °C，并通过向MEA表面持续通入缓慢流动的加湿气体（5% CO₂，20% O₂，75% N₂）防止培养基蒸发和pH变化。
   2. 经1200倍放大（MEA 1060，MCS）后，使用MCS数据采集卡以10 kHz采样率采集信号。使用定制软件包²³分析数据（包括动作电位和簇发放检测）。
2. 表征单细胞电生理活动
   1. 将含有hiPSC来源神经元培养物的盖玻片转移至直立显微镜下的浸没式固定记录室中。记录20分钟自发动作电位诱发的突触后电流（sEPSC）²⁴。使用神经科学程序检测突触事件。
3. 表征神经元形态及突触素表达
   1. 对hiPSC来源的神经元进行固定并染色，标记MAP2、突触素-1/2（synapsin-1/2）和PSD-95^{22, 24, 25}。使用图像分析软件定量分析突触素-1/2和PSD-95斑点的数量。

结果

在此，我们成功改进了一种将hiPSCs通过过表达转录因子neurogenin-2¹²直接分化为皮层神经元的实验方案，并将其优化用于微电极阵列（MEA）检测。该方法快速高效，可在诱导分化后的第三周内即获得具有功能的神经元及神经网络活动。

在诱导分化过程中，细胞在形态上开始呈现神经元特征：形成细小的突起，并开始相互连接（图1A）。我们通过检测神经元在发育过程中的形态学特征和突触特性，建立了来源于健康对照组hiPSC细胞系的神经元电生理学特征。在分化开始后的不同时间点，对hiPSC来源的神经元进行MAP2以及突触素-1/2（synapsin-1/2）染色（图2A）。结果表明，分化诱导3周后，所获得的神经元已表现出成熟的神经元形态。基于突触素-1/2免疫细胞化学染色结果，对突触素-1/2阳性斑点（代表突触数量）进行定量分析。随着时间推移，突触素-1/2阳性斑点数量逐渐增加，提示神经元之间的连接水平也在上升（图2B）。在两个独立的iPS细胞系中，分化诱导23天后突触素-1/2阳性斑点的数量相似（图2C）。在23天体外培养（DIV）时，大多数突触素-1/2阳性斑点与PSD-95阳性斑点相邻分布，表明已形成具有功能的突触（图2D）。

与 Zhang et al. 报道的结果一致，我们成功获得了兴奋性上层皮层神经元群体，并通过泛神经元标记物及亚型特异性皮层标记物（如 BRN2 和 SATB2（II/III 层））确认了其身份。我们未观察到表达深层皮层神经元标记物 CTIP2（V 层）或 Foxp2（VI 层）的神经元（图 2E 和  F）

为了表征由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化而来的神经元的电生理活性，我们采用了全细胞电流钳和电压钳记录技术。 即 在发育过程中测量了这些神经元的固有特性和兴奋性输入。神经元在分化后一周即可产生动作电位，且放电细胞的比例随时间逐渐增加（图 2G 和 H）。此外，神经元在诱导分化一周后即接收到兴奋性突触输入：随着发育的进行，兴奋性突触输入的频率和幅度均有所增加（图 2I - K).

为了更好地理解单个细胞的活动如何协同形成网络水平的功能，研究神经元如何协同工作至关重要。体外培养于多电极阵列（MEA）上的神经元网络是研究神经元动力学的有价值实验模型。我们记录了来源于健康对照组人诱导多能干细胞（hiPSC）系的神经元在6孔MEA上培养时持续20分钟的电生理网络活动（图2M）。在诱导分化数周后，来源于健康对照组hiPSC的神经元形成了功能活跃的神经元网络，表现出自发性放电事件（0.62 ± 0.05 峰电位/秒；图2N）。在此发育阶段（即 16 d 分化启动后），尚未检测到涉及MEA所有通道的同步事件（图2O）。随着发育进程，网络活动水平逐渐升高：在诱导分化后的第四周，神经元网络在装置的所有孔中均表现出高水平的自发活动（2.5 ± 0.1 峰电位/秒；图2N），并出现持续时间较长的同步性网络簇发放电（4.1 ± 0.1 簇发/分钟，图2O），持续时间为2,100 ± 500 ms。

图1： hiPSC向神经元的分化。 A. hiPSC在盖玻片上分化为神经元的三个时间点。 B. hiPSC在微电极阵列（MEA）上的接种。 C. T75培养瓶中达到100%汇合度的星形胶质细胞（注意细胞形成镶嵌状单层）。比例尺：150 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 由hiPSC衍生的神经元的表征。 A. 在诱导分化开始后的不同时间点，对由hiPSC衍生的神经元进行MAP2（绿色）和突触素-1/2（红色）染色。比例尺：10 µm。 B. 两次独立实验中突触素斑点的定量分析。每次实验至少分析10个细胞。 C. 在两个独立的iPS细胞系衍生的神经元中，于分化开始后第23天（DIV23）对突触素斑点进行定量分析。D. 在诱导分化开始23天后，对由hiPSC衍生的神经元进行PSD-95（绿色）和突触素-1/2（红色）染色。突触素斑点与PSD-95斑点相邻。 E. 在诱导分化开始23天后，对由hiPSC衍生的神经元进行MAP2（绿色）与BRN2（红色）或SATB2（红色）的染色。 F. 表达指定标记物的MAP2阳性细胞所占百分比。 G. 典型的电流钳记录显示，在诱导分化后第7天即可产生动作电位。 H. 在分化诱导后的不同时间点，能够产生一个或多个动作电位的细胞所占百分比。 I. 由hiPSC衍生的神经元在分化后不同时间点接收到的兴奋性突触后电流（EPSCs）的代表性轨迹。 J. 发育过程中兴奋性突触后电流的频率。 K. 发育过程中兴奋性突触后电流的幅度。 L. EPSC记录的代表性轨迹，分别为无CNQX（对照）和加入CNQX（CNQX）条件下的情况。 M. 来自一个hiPSC细胞系的神经元被培养在6孔MEA上，显示了在分化诱导后第16天和第23天hiPSC衍生神经元网络的活动情况。每个孔记录到的活动（采样率为10 kHz）以不同颜色表示（展示20分钟记录中的5分钟）。 N. 分化诱导后第16天和第23天 的放电率。 O. 分化诱导后第16天和第23天 的簇状放电率。 请点击此处查看该图的放大版本。

根据上述结果，可通过建立细胞的神经生理学特征来评估由hiPSC分化所得神经元的质量。即在分化开始后三至四周，可对神经元的形态、突触素-1/2表达以及电生理特性进行评估。在此时间点，预期hiPSC来源的神经元应呈现类似神经元的形态，免疫细胞化学检测显示MAP2、突触素/PSD-95阳性，并表现出自发性电生理活动（包括单细胞水平和网络水平）。

讨论

在此，我们采用了Zhang发表的一种高效的hiPSC分化方案 等 (2013)¹² 用于测量在微电极阵列上由人诱导多能干细胞衍生的神经元网络的网络活性。我们通过创建一种改良方案对原始方案进行了调整。 rtTA/Ngn2阳性hiPSC细胞系，再诱导其神经元分化。这一额外步骤使我们能够控制MEA上的神经元细胞密度。对神经元密度的控制是将本方案适配于MEA技术并确保实验一致性的关键前提。为了利用MEA测量神经元网络的活性，神经元需在MEA电极表面直接形成密集的网络。^17,18. 这必然要求对神经元的铺板密度进行严格控制。 rtTA/Ngn2阳性 hiPSC 细胞系可实现对神经元密度的调控，因为该策略不依赖于在分化前对 hiPSC 进行急性慢病毒转导；该方法 rtTA/Ngn2阳性hiPSC细胞系因此几乎消除了由慢病毒毒性及感染效率差异等因素导致的最终产量波动。

实验流程中的另一个关键步骤是与正在分化的 hiPSC 共培养的大鼠星形胶质细胞的数量。星形胶质细胞通过调控突触的形成、维持和消除，积极参与发育中神经回路的精细化过程，而这些过程对神经元功能至关重要。本文所介绍的方案高度依赖星形胶质细胞：神经元需要星形胶质细胞的支持，才能完全成熟并形成具有自发性活动的功能性突触。我们发现，星形胶质细胞的数量应大致等于 hiPSC 来源神经元的数量，以支持神经元的成熟以及能够表现出自发性活动的神经网络的形成。由于我们的星形胶质细胞培养方案所获得的是具有有限生命周期的原代细胞培养物，因此需要定期分离大鼠星形胶质细胞。

我们对 Zhang et al. (2013)¹² 发表的实验方案进行的改进，使其适用于微电极阵列（MEA）技术，有望显著提升研究由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经网络的网络活动能力。此前，利用MEA技术研究hiPSC来源神经元网络的实验方案依赖于耗时较长的分化流程^13-16。Zhang et al. (2013) 提出的方案提供了一种更快速的替代方法，而我们的修改进一步消除了一个变异来源，使得hiPSC来源神经元与MEA技术结合的应用变得更加可行，尤其适用于高通量或药理学研究。此外，由于Zhang et al. (2013)¹²发表的方法能够获得均一的上层皮层神经元群体，我们改进后的方案使得针对这一特定神经元亚群的网络活动开展集中研究成为可能。

尽管如此，这种方法也存在一些局限性。首先，培养物的均一性也可能被视为一种缺点，因为这种均一性使得培养物更难以模拟 体内 网络，其中不同类型的神经元（即 抑制性和兴奋性神经元）构成了一个异质性网络。为了进一步提升将hiPSC来源神经元与MEA技术结合的应用，开发针对其他神经细胞群体的快速（基于转基因）分化方案将至关重要。如果相关方案得以建立， 体外 网络将模拟 在体内 更紧密地研究神经网络。其次，目前必须将大鼠星形胶质细胞添加到hiPSC来源的神经元中以提供生长支持，因此所形成的神经网络并非完全的人类神经元网络 狭义上 可靠的将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为星形胶质细胞的实验方案，未来可能解决这一问题²⁶第三，正如本文所述，二维神经网络在研究复杂的三维结构时具有一定的局限性 体内 神经元网络。幸运的是，已有描述大鼠原代神经元三维培养与MEA技术结合的实验方案可供参考^27,28前瞻性地，将快速分化方案获取hiPSC来源的神经元和星形胶质细胞，与三维培养技术及MEA技术相结合，有望为揭示神经系统疾病潜在的生物学机制提供新的见解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lebovitz 的 L-15 培养基	Gibco	11415-064
B-27 添加剂	Gibco	0080085SA
多聚-D-赖氨酸 (PDL)	Sigma-Aldrich	P6407
无 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS	Gibco	14175-095
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
2.5% 胰蛋白酶	Gibco	15090-046
高糖 DMEM	Gibco	11965-092
FBS（胎牛血清）	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
70 µm 细胞筛	BD Falcon	352350
DPBS	Gibco	14190-094
psPAX2 慢病毒包装载体	Addgene	质粒 #12260
pMD2.G 慢病毒包装载体	Addgene	质粒 #12259
基底膜基质	Gibco	A1413201
DMEM/F12	Gibco	11320-074
细胞解离液	Sigma-Aldrich	A6964
E8 培养基	Gibco	A1517001
ROCK 抑制剂	Gibco	A2644501	也可使用如硫唑维林等其他 ROCK 抑制剂。
聚凝胺	Sigma-Aldrich	H9268-5G
G418	Sigma-Aldrich	G8168-10ML
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
玻连蛋白	Gibco	A14700
6 孔微电极阵列板 (MEAs)	Multi Channel Systems	60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
玻璃盖玻片	VWR	631-0899
多聚-L-鸟氨酸 (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655-10MG
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
强力霉素	Sigma-Aldrich	D9891-5G
N-2 添加剂	Gibco	17502-048
非必需氨基酸	Sigma-Aldrich	M7145
NT-3，人重组蛋白	Promokine	C66425
BDNF，人重组蛋白	Promokine	C66212
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺	Gibco	35050-038
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
阿糖胞苷β-D-呋喃型阿拉伯糖苷	Sigma-Aldrich	C1768-100MG
直头精细镊子	Fine Science Tools	11251
精细弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09