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一种用于研究乳腺癌肝转移的门静脉注射模型

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DOI：

10.3791/54903

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2016年12月26日

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

本文内容

摘要

通过门静脉注射将乳腺肿瘤细胞递送至小鼠肝脏的手术方法已建立。该模型可在完全免疫功能正常的宿主体内研究肝转移的晚期阶段，包括肿瘤细胞的外渗、定植、存活以及在肝脏内的转移性增殖。

摘要

乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的首要原因。在乳腺癌转移病例中，肝转移占比超过30%，且预后较差，中位生存期仅为4.8至15个月。目前常用的乳腺癌转移啮齿类动物模型，包括原发肿瘤细胞异种移植模型和自发性肿瘤模型，极少发生肝转移。虽然心内注射和脾内注射模型可导致肝转移，但这些模型常伴随其他部位的继发性转移，或因切除脾脏以避免注射部位肿瘤生长而导致免疫功能受损。为满足对更优肝转移模型的需求，研究人员开发了一种小鼠门静脉注射方法，可将肿瘤细胞首先且直接递送至肝脏。该模型可在不引起其他器官同时发生转移或切除脾脏的情况下，将肿瘤细胞靶向输送至肝脏。优化后的门静脉注射方案采用5–10 μl的小体积注射，使用≥32号针头，并在注射部位应用止血纱布以控制出血。该门静脉注射方法在Balb/c雌性小鼠中，利用三种具有不同转移潜能的同源乳腺肿瘤细胞系进行了验证：高转移性的4T1细胞、中等转移性的D2A1细胞和低转移性的D2.OR细胞。每只小鼠注射细胞数≤10,000个时，高转移性的4T1和D2A1细胞系出现肝转移的潜伏期约为20–40天， > 对于侵袭性较低的D2.OR细胞系，该模型为研究乳腺癌向肝脏转移提供了重要工具，并可能适用于其他常发生肝转移的癌症，包括结直肠癌和胰腺腺癌。

引言

乳腺癌肝转移

肝脏是乳腺癌转移的常见部位，其他常见部位还包括骨骼和肺1-3。乳腺癌患者的肝转移是预后极差的独立预测因子4,5，伴有肝转移的乳腺癌患者中位生存期仅为4.8至15个月6-9。相比之下，伴有肺转移或骨转移的乳腺癌患者中位生存期分别为9至27.4个月8,9和16.3至56个月8,10-12。转移是一个多步骤过程，称为转移级联反应，始于原发肿瘤中肿瘤细胞的播散，最终因循环肿瘤细胞在远端器官定植并生长而导致患者死亡13-15。啮齿类动物转移模型显示，转移级联过程效率极低，仅有0.02%至10%的循环肿瘤细胞能够形成明显的转移灶16,17。转移效率低下的一个主要瓶颈在于继发部位独特的组织微环境，即所谓的转移微环境18，这凸显了理解部位特异性转移的重要性。转移微环境因复发部位而异，部分特征表现为特定细胞外基质蛋白的沉积19,20、多种免疫细胞群体的浸润21-23，以及组织稳态的改变，包括多种细胞因子、趋化因子和生长因子的失调产生15,18,24,25。因此，理解组织特异性的转移微环境是进一步认识如何靶向治疗转移性疾病的前提。然而，目前尚缺乏可靠的肝转移模型。此外，建立更优的肝转移模型对于发现新的治疗靶点和开发针对伴有肝转移的乳腺癌患者的高效疗法至关重要。

研究乳腺癌肝转移的既定模型

目前可用于研究乳腺癌肝转移的模型包括在免疫缺陷小鼠中建立的人癌细胞异种移植模型。这些模型通常采用已深入研究的人乳腺癌细胞系，如 MCF-7 和 MDA-MB-231，以及裸鼠、Rag1-/-或免疫缺陷的SCID小鼠宿主26-29异种移植模型具有使用人源癌细胞系的优势，然而，鉴于近年来对免疫细胞在转移过程中作用的深入认识30-32 以及在治疗耐药性中的作用33-35在完全免疫活性宿主中研究转移至关重要。用于在免疫活性宿主体内研究乳腺癌肝转移的模型包括同系肿瘤细胞的原位注射（例如，将4T1和D2A1细胞系接种至乳腺脂肪垫，可选择性地结合原发肿瘤的手术切除，并随后评估转移情况36-38值得注意的是，与肺等其他转移部位相比，原位移植模型的肝转移率极低或几乎不存在39,40，或在肺转移灶形成后发生，这使得肝特异性转移的研究变得复杂37,39.

来自自发性基因工程乳腺癌模型的肿瘤外植体可作为同源肿瘤细胞重新注射到未处理宿主的乳腺脂肪垫中。例如，最近有报道称，K14CreECadf/fP53f/f 小鼠（模拟浸润性小叶型乳腺癌）产生的自发性肿瘤，在正位注射至野生型宿主后能够形成肿瘤。当这些肿瘤生长至15 mm2并进行手术切除后，18%的小鼠出现了肝转移40,41。第三种模拟肝转移的方法是利用基因工程小鼠中的自发性转移。迄今为止，关于乳腺癌转移的自发性小鼠模型能频繁发生肝转移的报道尚不多见。例外情况包括H19-IGF2、p53fp/fp MMTV-Cre Wap-Cre以及K14CreECadf/fP53f/f基因工程小鼠模型，这些模型中仅有少量比例的小鼠出现肝转移38,41-43。因此，尽管基因工程小鼠模型有助于研究转移级联过程的各个阶段，并提供强大且具有临床相关性的模型，但其应用受限于肝转移发生率较低38。

多种转移模型绕过了转移级联反应的初始步骤，包括肿瘤细胞从原发灶的播散和内渗过程。这些模型可用于研究转移级联反应的后期阶段，即从肿瘤细胞外渗到在继发部位形成肿瘤的过程。心内注射模型将肿瘤细胞注入左心室，细胞经主动脉进入循环系统。心内注射需要借助超声引导成像或其他成像技术（如荧光素酶标记细胞的生物发光成像）来确认注射是否成功。通过左心室注射肿瘤细胞可能在骨骼、脑、肺和/或肝脏等多个器官中引发转移44-48。由于存在多器官转移，这些小鼠通常需要在明显肝转移形成前实施安乐死，从而无法全面研究肝脏内的转移性生长。另一种可显著减少多部位转移发生的方法是脾内注射模型。脾内注射通过脾静脉将肿瘤细胞输送，脾静脉与肠系膜上静脉汇合后形成门静脉49,50。由于其他部位形成转移灶的情况罕见，因此可对动物进行长期监测以观察肝脏转移病灶的生长，同时动物整体健康状况得以维持49,50。然而需要注意的是，脾内注射模型需行脾切除术以避免脾脏肿瘤的形成49,50，而该手术会影响免疫功能。例如，心肌缺血再灌注损伤的特征之一是来源于脾脏的Ly6C+单核细胞亚群浸润，这些细胞在缺血后伤口愈合过程中发挥吞噬和蛋白水解作用51,52。脾切除后，参与伤口愈合的单核细胞数量明显减少52。此外，在非小细胞肺癌模型中，脾切除已被证明可通过减少循环中及肿瘤内的CCR2+CD11b+Ly6C+单核髓系细胞数量，从而抑制原发肿瘤生长和肺转移53。另外，在结肠癌细胞脾内注射后行脾切除，会导致肠系膜淋巴结中抗肿瘤自然杀伤细胞水平降低，并促进肝转移54。综上所述，这些研究结果表明，脾切除会削弱免疫系统在调控转移细胞命运中的作用。

门静脉注射肝转移模型

为在免疫功能完整的宿主中研究乳腺癌向肝脏的转移，同时避免小鼠因多器官转移而造成机体功能受损的情况，研究人员建立了门静脉注射模型。门静脉内注射模型此前已被用于研究结直肠癌的肝转移。55,56 和黑色素瘤16 细胞系；本文描述了门静脉注射在模拟同源性乳腺肿瘤细胞转移中的应用。该模型可用于研究转移级联的后期阶段，包括乳腺癌细胞的血管外渗与定植、肿瘤细胞在死亡/增殖/休眠之间的命运决定，以及进展为明显病灶的过程。在此模型中，将同源性乳腺肿瘤细胞系注入 通过 免疫活性雌性Balb/c小鼠门静脉注射，该方法可将肿瘤细胞直接且优先输送至肝脏，无需切除脾脏。为建立此模型，采用了四种具有从低到高不同转移能力的乳腺肿瘤细胞系：D2.OR、D2A1和4T1，并使用绿色荧光蛋白标记的D2A1细胞（D2A1-GFP）以研究肿瘤细胞注射后的早期时间点。4T1是一种高度转移性的细胞系，源自MMTV小鼠中自发产生的410.4肿瘤+ Balb/c 雌性小鼠36,37 并从乳腺脂肪垫原发肿瘤转移至肺、肝、脑和骨39,57,58D2A1 肿瘤细胞最初来源于将 D2 乳腺增生性腺泡结节细胞移植到 Balb/c 宿主后，宿主自发产生的乳腺肿瘤，且已证实该细胞系由原发肿瘤转移至肺部。59,60D2.OR 肿瘤细胞是 D2A1 细胞系的一个非转移性姊妹细胞系；尽管它们能够从原发肿瘤逃逸并到达继发部位，但极少形成远端转移灶60,61.

此外，在手术过程中或术后应避免使用常见的疼痛管理药物，包括非甾体抗炎药（NSAIDs）。NSAIDs 在某些乳腺癌中具有抗肿瘤活性62-65，且某些类别的 NSAIDs 会增加肝毒性风险66,67，可能干扰对肝转移及肝转移微环境的研究。此外，研究表明 NSAIDs 可直接影响组织微环境，降低促转移的细胞外基质蛋白——腱生蛋白-C68 和纤维状胶原62,65的表达。因此，本研究选用阿片类衍生物布托啡诺，因其在啮齿类动物疼痛管理中具有良好的镇痛效果69，且目前尚无证据表明阿片类药物具有抗肿瘤活性70。该门静脉注射模型已优化为较小的注射体积（5–10 µl），以避免对肝脏造成不必要的损伤。模型还优化了使用更小直径的针头（≥32 gauge）以及注射后立即使用止血纱布，以最大限度减少手术过程中的出血。与上述优化的注射参数不同，细胞数量应根据细胞系的成瘤潜力进行个体化确定。然而，对于长期研究，建议起始注射细胞数不超过 10,000 个/次。对于较短时间终点（例如，注射后 24 小时），如实验需要，可使用更多的肿瘤细胞（例如，1 × 105–1 × 106）。总之，本文详述的门静脉注射模型是研究乳腺癌肝转移的有力工具，克服了其他肝转移模型的多项局限性。该模型可在免疫功能健全的小鼠体内，用于研究肿瘤细胞的血管外渗、定植、早期存活、增殖与休眠等命运决定过程，以及转移灶的生长过程。

方案

本文中所有动物实验程序均经俄勒冈健康与科学大学动物护理与使用委员会审查并批准 & 科学大学机构动物护理与使用委员会

1. 手术区域和器械的准备

  1. 在计划手术前1至2天，将剪刀、镊子和止血钳在124 °C条件下高压灭菌30分钟。确保术后恢复期间可获取已灭菌的垫料、笼具和饲料。
  2. 准备无菌手术区域，最好在层流罩内进行。
    1. 使用10%次氯酸钠溶液擦拭手术区域的所有表面，包括加热垫、光源、麻醉管路和鼻罩，以及手术过程中可能靠近操作区域的手术设备其他任何部分。
    2. 在无菌手术区域内放置已覆盖无菌布的清洁加热垫、光源、麻醉管路和鼻罩、胰岛素注射器、1 ml注射器、布比卡因、人工泪液、无菌生理盐水、2 x 2"无菌纱布块、4 x 4"无菌纱布、切成0.5 - 1 cm2大小的止血纱布、剪刀、镊子、止血钳、带圆锥形针头的4-0薇乔缝线，以及装在已灭菌容器中的50 ml 2%葡萄糖酸氯己定溶液。
    3. 确保该区域内有空间放置冰上保存的制备好的肿瘤细胞。
    4. 在邻近手术区域的实验台面上，设置恢复区，配备第二个加热垫，以及装有无菌垫料的清洁笼具。
      注：此区域也可放置如玻璃珠灭菌器等设备。

2. 门静脉注射

  1. 在计划注射前1小时，对8至15周龄的Balb/c雌性小鼠进行皮下注射100 µl浓度为0.015 mg/ml的丁丙诺啡，用于镇痛管理。
    注意：该注射方案可适用于任何品系、任何年龄的雌性或雄性小鼠，只需根据品系选择相应的小鼠细胞系即可。
  2. 根据所选细胞系或肿瘤外植体的实验方案制备肿瘤细胞用于注射。在使用前应对所有肿瘤细胞系进行小鼠病原体检测，以降低将此类病原体引入动物种群的风险。
    1. 对于同系 Balb/c 肿瘤细胞系，包括 D2A1、D2.OR 和 4T1 肿瘤细胞，于接种前 3 天将细胞解冻至 10 cm 组织培养皿中，使次日细胞汇合度达到约 90–100%。
    2. 肿瘤细胞解冻后第1天，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，加入2 ml 0.05%胰蛋白酶，在37 °C孵育5 min消化贴壁细胞。加入8 ml完全培养基（DMEM高糖培养基，10%胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素），按1:10传代至新的10 cm培养皿中，加入10 ml完全培养基。
    3. 注射当天，用1×PBS洗涤细胞一次，并按上述方法进行胰蛋白酶消化。
    4. 将经胰蛋白酶消化的细胞重悬于8 ml完全培养基中，1,500 × g离心5分钟，弃去上清液，再用5 ml 1×PBS重悬细胞。
    5. 使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数细胞以评估细胞活力。将细胞重悬于预设浓度和体积的1×PBS中，用于注射。
      注意：建议注射体积为 5 - 10 μl，较小的注射体积可避免对肝脏造成不必要的损伤。
    6. 将细胞在冰上保存直至注射完成。注射结束后，取部分细胞送回实验室，置于完全培养基中培养1天，以确保细胞活性。
  3. 使用2-2.5%异氟烷（2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷）与氧气混合气体对小鼠进行麻醉。使用加热垫维持小鼠体温。通过脚趾夹捏反应评估麻醉是否完全，随后维持2-2.5%异氟烷麻醉。
    注意：在整个操作过程中，必须密切监测动物的呼吸频率，并相应调整异氟烷的流量。
  4. 在手术过程中，于每只眼睛上涂抹少量人工泪液或兽用眼膏，以防止眼睛过度干燥。
  5. 将小鼠置于仰卧位，背部朝下，腹部暴露。
  6. 从第二肋间隙向下至第四肋间隙，去除啮齿类动物左侧腹面的毛发th 用化学脱毛剂擦拭腹股沟乳腺乳头区域进行脱毛。让脱毛剂停留1-2分钟，然后用纱布和H完全清除2此步骤可提前1至2天完成，以便在计划进行大量手术时节省时间。
  7. 取一块 2 x 2" 无菌纱布块（用2%氯己定浸泡）擦拭小鼠脱毛部位，并对包括尾巴在内的整个周围区域进行消毒，以尽量减少器械的细菌污染。
  8. 用酒精消毒棉片擦拭脱毛部位及周围区域。
  9. 重复使用2%氯己定和酒精各一次，最后再用氯己定擦拭一次，共完成三次2%氯己定和两次酒精预处理垫清洗。最后一次氯己定擦拭时，应确保液体不滴漏至手术区域周围，以避免氯己定接触内部器官。 注意：在皮肤及周围毛发上使用大量氯己定和酒精可能导致体温显著下降。在步骤 2.7–2.9 中，避免使用过量液体擦拭。使用加热垫维持体温。
  10. 佩戴无菌手套，使用带无菌刀片的灭菌解剖刀，在小鼠左侧正中平面与矢状平面之间沿皮肤做一长约1英寸的切口，起始于肋骨下方稍远处，终止于第四对腹股沟乳腺乳头平面稍上方。
  11. 使用经高压灭菌或玻璃珠灭菌的剪刀和镊子，在腹膜上做一个类似的1英寸切口。避免切到乳腺脂肪垫，并确保不损伤肠道、肝脏或膈肌。
  12. 放置一个 4 x 4" 将浸有无菌生理盐水的纱布垫置于小鼠左侧手术切口处，以便将内脏器官放置于纱布上，避免其与周围皮肤或手术区域接触。
  13. 通过反复吹打重悬肿瘤细胞，因为在小鼠制备过程中细胞会沉降。用肿瘤细胞准备一支25 μl可拆卸针头注射器和32号针头。推动注射器推杆，使肿瘤细胞充满针尖并达到准确的注射体积；避免注入气泡。
  14. 用无菌酒精棉片擦拭针头外部，以去除任何外源性肿瘤细胞。操作时需小心，避免针刺伤。
  15. 用镊子夹住切口的中线侧，包括皮肤和腹膜层，并用无菌棉签小心地将大肠和小肠拉出，置于浸有无菌生理盐水的无菌纱布上。继续拉出大肠和小肠，直至门静脉可见。
  16. 用生理盐水浸湿的纱布覆盖内脏器官，以保持其内部湿润和无菌状态。
  17. 让一名同样戴有无菌手套的助手使用无菌棉签轻轻将浸有生理盐水的纱布包裹的肠管移开，以充分暴露门静脉。此外，可能需要使用经高压灭菌的止血钳或镊子将切口内侧的组织轻轻拨开。
  18. 将载有肿瘤细胞的针头以一定角度插入肝下方约10 mm处的门静脉，进针深度约为3–5 mm < 以5°角进针，针尖斜面朝上。缓慢注入含有肿瘤细胞的全部液体。让血液流过针头数秒钟，以避免肿瘤细胞从静脉回流。注射过程中尽量减少针头在静脉内的移动。再次提醒，注意避免针刺伤。
    注意：门静脉的观察无需放大，但可根据需要选用体视显微镜。
  19. 拔出针头的同时，立即用无菌棉签在静脉上施加压力。助手继续将肠管牵开，放置一段0.5 - 1 cm的2 在静脉注射部位上方覆盖止血纱布。
    注意：本方案中也曾尝试使用止血粉，但在注射后未能有效控制静脉出血。
  20. 用无菌棉签在注射部位按压止血纱布，持续5分钟。
  21. 通过小心抬起止血纱布来评估静脉闭合情况；如果纱布粘附于周围组织，可使用少量无菌生理盐水浸润后抬起纱布。
  22. 如果此时发生出血，在出血部位加放一块止血纱布并施加压力5分钟。待血液完全停止流出后，移除小鼠身上的纱布。
    注意：手术过程中必须仔细评估失血量，若达到或超过允许的总失血量（依据研究者所在机构审查委员会的监管标准操作程序），则需在麻醉状态下通过心脏灌注对小鼠实施安乐死。
  23. 一旦确认注射部位完整且无血液渗出，轻柔地将内脏器官放回腹腔内。
  24. 用无菌4-0薇乔缝线和圆锥形针，采用连续或间断缝合方式缝合腹膜层，然后缝合皮肤。通常关闭切口需要10–15针。
  25. 使用胰岛素注射器沿切口部位注射100 µl布比卡因（5 mg/ml）以进行局部镇痛。使用1 ml注射器配26号针头，皮下注射0.5 ml无菌生理盐水以维持水化。手术操作耗时15至25分钟完成。
  26. 在整个手术过程中，为维持无菌条件，确保所有与小鼠接触的器械和材料（包括戴手套的手）在接触前均已适当清洁。应尽可能使用无菌材料和手套，或至少使用70%乙醇溶液或10%次氯酸钠溶液进行清洁。
  27. 若单次手术过程中计划进行多个手术操作，需使用新的无菌手术巾、胰岛素注射器、1 ml 注射器、无菌生理盐水和 2 x 2 无菌纱布重新准备初始手术区域" 无菌纱布垫，4 x 4" 无菌纱布，止血纱布剪成 0.5 - 1 cm2 剪刀、镊子和止血钳在手术间需经 bead-sterilizer 灭菌，并在重新使用前充分冷却。

3. 动物恢复、监测啮齿类动物健康状况及终点分析

  1. 手术完成后，将小鼠置于无垫料的清洁笼中，并在加热垫上保温至少20分钟以促进恢复。小鼠通常在2至4分钟内从麻醉状态中苏醒。
  2. 手术后的动物在完全从麻醉中恢复之前，不得与其他动物共同饲养。动物在恢复意识期间不得无人看管，须持续监测，直至动物能够自主维持胸卧位。
  3. 给小鼠每6-12小时给予0.05-0.1 mg/kg的丁丙诺啡以进行疼痛管理 术后每小时一次，持续至72小时。
  4. 每日检查缝线，确保愈合期间缝线保持完整。若缝线松脱，需将小鼠置于麻醉状态下，移除残留缝线并重新缝合。如出现感染或炎症，应咨询兽医人员。
    注意：采用本方案未出现感染或炎症情况。
  5. 对于转移研究，需进行每日健康检查，直至观察到转移性疾病的外部体征，包括但不限于： >体重减轻或增加10%、毛发杂乱、对外界环境失去注意力、腹腔水肿或腹水、眼耳苍白、蜷缩姿势。
    注意：在使用新细胞系或细胞浓度建立模型时，每日健康检查尤为重要，直至明确转移的时间进程。
  6. 在研究终点，通过 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。
    注意：经研究人员监管委员会批准的其他安乐死方法也可使用，包括在麻醉状态下用1×PBS灌注。通过门静脉插管、剪断下腔静脉，并以4 ml/min的速度将1×PBS经肝脏血管系统灌注1–2分钟，以清除循环血液和白细胞。
    注意：根据研究终点、细胞系及所用浓度的不同，解剖时可能观察到明显的肝转移，也可能未见明显肝转移。通过肝脏组织学分析可揭示微转移病灶。研究终点将依据实验设计的不同而有所差异。
  7. 用剪刀和镊子取出肝脏，先移除胆囊，然后在肝脏上方剪断下腔静脉。在肝脏下方剪断下腔静脉、门静脉和肝动脉。
  8. 轻柔地取出整个肝脏，用1×PBS冲洗5次。
  9. 将肝脏分为左叶、右叶、中叶和尾状叶。
  10. 用10%中性缓冲福尔马林在室温下振荡固定肝脏48小时。将组织依次通过浓度递增的乙醇和二甲苯进行脱水透明处理，最后将固定后的组织包埋于石蜡中。71.
    注意：或者，可将组织置于包埋模具中，加入最佳切割温度（OCT）包埋剂，再将模具浸入95%乙醇中的干冰颗粒内速冻，从而对肝脏进行速冻处理。
    1. 使用切片机切割石蜡包埋的组织块，使露出火柴头大小的组织。
    2. 切取五张4微米的连续切片，作为分析的第一层。
    3. 切下250微米厚的组织，将这些切片弃入废料中。
    4. 在250微米处切割第二层，连续切五张4微米的连续切片。
    5. 根据需要重复操作，以完成整个肝脏的切片。对每一层面的第一张切片进行苏木精和伊红染色，以评估是否存在转移。72.
      注意：对于速冻组织，应使用冷冻切片机进行切片。
      注意：微转移性疾病的检测需要对肿瘤细胞进行特异性染色。
  11. 如果切口部位出现肿瘤生长，则将小鼠剔除出研究，因为这表明注射后肿瘤细胞泄漏至腹腔。
    注意：尚未观察到此问题。

结果

门静脉注射模型通过手术将肿瘤细胞直接递送至肝脏，从而实现对门静脉的肿瘤细胞注射。在无菌条件下，对麻醉小鼠于身体左侧、正中面与矢状面之间做长约1英寸的手术切口，切口起始于第四对腹股沟乳腺乳头稍上方，终止于肋骨稍下方。将大肠和小肠轻柔地经切口拉出，以充分暴露门静脉（图1A）。可通过印度墨水或类似染料进行注射操作练习，以准确识别门静脉解剖位置并验证门静脉内注射是否成功。经门静脉正确注射后，墨水将立即且特异性地分布至肝脏，而不会扩散至肺部（图1B）。此外，使用GFP标记的D2A1小鼠乳腺肿瘤细胞可见，在注射后90分钟，肿瘤细胞已广泛分布于整个肝脏，进一步证实了门静脉注射成功将细胞递送至肝脏（图1C）。在更高倍镜下观察发现，注射后90分钟，肿瘤细胞不仅存在于肝窦内，也出现在门管区附近肝实质中，即门静脉血液进入肝脏的区域（图1C）。这些结果提示，在肿瘤细胞注射后90分钟时，肿瘤细胞已发生活跃的外渗。综上所述，这些数据证实门静脉注射模型可将注射体积直接递送至肝脏，墨水或肿瘤细胞均广泛分布于肝内，且无明显注射物向肺部转运。

为评估门静脉注射模型的稳健性，在成年雌性 Balb/c 小鼠中测试了三种不同的同源小鼠乳腺肿瘤细胞系。这些乳腺肿瘤细胞系的选择基于其在乳腺脂肪垫模型中的已知行为，包括高侵袭性和高转移性的 4T1 细胞系、侵袭性较低但仍具转移性的 D2A1 细胞系，以及低转移性或非转移性的 D2.OR 细胞系37,61,73,74。在每次注射 2,000 和 10,000 个细胞的条件下进行了测试，使用这些低细胞浓度时，在明显转移形成时间上未观察到显著差异。在这些研究中，采用缺乏理毛行为、苍白和体重减轻等转移的替代标志作为实施尸检的依据，随后通过肉眼观察肝脏及其他器官以确认是否存在肝转移，并验证门静脉内给药的成功。这些数据证实了先前的报道，即 4T1 和 D2A1 细胞系代表更具侵袭性的乳腺肿瘤模型，与注射低侵袭性 D2.OR 细胞的小鼠相比，其无转移生存期更短（图 2A）。注射 4T1 或 D2A1 肿瘤细胞的小鼠在注射后约 30 至 40 天出现明显的肝转移，部分小鼠甚至在注射后 18 天即出现转移（图 2A），而注射 D2.OR 细胞的小鼠中，仅有一只在实验结束时（即肿瘤细胞注射后 60 至 65 天）出现明显的肝转移。随后通过以 250 µm 间隔切取肝脏组织，并对苏木精-伊红（H&E）染色切片进行分析，进一步确认了转移灶的存在（图 2B-D）。

除了检测小鼠肝脏中明显的转移性病灶外，门静脉模型还可用于研究转移级联过程中更早期的事件，包括检测血管外渗后的单个细胞或细胞簇，以及微转移性病灶的形成。采用多重免疫荧光染色法检测作为单个细胞或微转移性病灶存在于肝脏中的4T1、D2A1和D2.OR乳腺肿瘤细胞，如H&E不足以确认小病灶的存在。 图3A 显示一个典型的Balb/c小鼠肝脏，其中存在D2A1肿瘤细胞的疑似微转移灶，该细胞表达上皮性角蛋白CK18，不表达广谱免疫标记物CD45，也不表达肝细胞标记物Heppar-1。肝细胞本身也表达CK18，因此本染色方案中需使用Heppar-1以作区分。需要注意的是，胆管上皮细胞和肝前体细胞同样表达CK18，因此在判读时需仔细区分肿瘤细胞与胆管结构，尤其是在评估门静脉周围区域时图3A）。一种用于鉴定单个播散细胞和微转移灶的多重免疫荧光替代方法是利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和/或荧光素酶的同源性乳腺肿瘤细胞系，并对标签进行免疫组化检测（图1C由于eGFP、荧光素酶及其他蛋白质具有免疫原性，必须使用对这些蛋白质具有免疫耐受的小鼠模型，例如新型的免疫功能健全的“发光头部”小鼠，该小鼠在垂体前叶表达eGFP和荧光素酶75对于未标记同源细胞系（如 D2A1 肿瘤细胞系）的巨转移病灶鉴定，CK18/Heppar-1/CD45 多重免疫荧光染色是理想方法（图3B）。

肝门静脉注射示意图及PBS与印度墨水肝脏结果、肝脏组织学分析。
图1： 门静脉注射将肿瘤细胞直接递送至肝脏。A) 门静脉注射示意图；切口位于中线与左矢状面之间，起自第四乳头腹股沟乳腺平面以上，止于肋缘稍下方。 B) 注射PBS的Balb/c小鼠肝脏（左图）。经门静脉注射印度墨水后，肝脏（中图）可摄取墨水，而肺脏（右图）则无摄取。 C) 通过门静脉注射1×106个GFP标记的D2A1小鼠乳腺肿瘤细胞后90分钟，Balb/c小鼠肝脏中肿瘤细胞的代表性薄切片图像。肝脏组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片，并使用抗GFP抗体染色以检测肿瘤细胞。上排图像显示深棕色染色的肿瘤细胞（箭头所示）在肝脏中广泛分布，星号表示中央静脉周围肝细胞的非特异性染色；比例尺 = 300 µm。下排图像显示注射后90分钟肿瘤细胞仍紧密与血管结构相关联的代表性视野；比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

Kaplan-Meier 曲线、组织学图像；无转移生存率，4T1、D2A1、D2.OR 肿瘤分析。
图 2： 小鼠乳腺肿瘤细胞系经门静脉注射后在肝脏中的生长情况。A) Kaplan-Meier 曲线显示，注射 2,000–10,000 个 4T1、D2A1 或 D2.OR 小鼠乳腺肿瘤细胞后小鼠的无转移生存率。将肿瘤细胞注射入小鼠体内后，监测其是否出现转移迹象，包括梳理行为减少、眼睛发白以及体重变化。在尸检时通过大体观察及肝脏组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色确认转移情况。样本量：2 只小鼠注射 4T1 细胞（2,000 个细胞）；2 只小鼠注射 4T1 细胞（10,000 个细胞）；2 只小鼠注射 D2A1 细胞（2,000 个细胞）；3 只小鼠注射 D2A1 细胞（10,000 个细胞）；3 只小鼠注射 D2.OR 细胞（2,000 个细胞）；3 只小鼠注射 D2.OR 细胞（10,000 个细胞）。代表性 H&E 染色图像显示：B) 注射 10,000 个 4T1 细胞后第 21 天的病灶；C) 注射 10,000 个 D2A1 肿瘤细胞后第 26 天的病灶；以及 D) 注射 10,000 个 D2.OR 细胞后第 59 天的病灶；比例尺 = 75 µm。当注射 2,000 个 4T1 或 D2A1 肿瘤细胞时，也可观察到类似病灶。注射 2,000 个 D2.OR 细胞的小鼠未检测到任何病灶。在本研究的所有小鼠中，其他器官或手术切口部位均未发现转移证据。请点击此处查看该图的放大版本。

肝脏组织的荧光显微镜图像；DAPI、CD45、Heppar-1、CK18 标记物；细胞鉴定。
图 3：利用多重免疫荧光法在小鼠肝脏中检测单个细胞和转移性病灶。A） 通过门静脉注射模型，在注射后 90 分钟时对 Balb/c 小鼠肝脏中的 D2A1 肿瘤细胞进行代表性多重免疫荧光染色。染色使用多重试剂盒完成。从左至右依次显示：DAPI；标记白细胞的 CD45；标记肝细胞的 Heppar-1；以及标记肿瘤细胞、肝细胞和胆管上皮的 CK18。合并图像显示一群推测的 CK18+Heppar-1-CD45- D2A1 肿瘤细胞，紧邻门脉三联体分布。箭头 = D2A1 肿瘤细胞，星号 = 胆管上皮；比例尺 = 25 µm。B） 使用与 A 相同的染色组合所获得的一个典型的 D2A1 转移病灶。肿瘤细胞为 CK18+，而邻近的肝细胞为 CK18+Heppar-1+；比例尺 = 25 µm。图像使用配备 20 × 0.8、40 × 1.3 和 60 × 1.4 物镜及 CCD 相机的显微镜，通过显微镜软件采集。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

Balb/c 小鼠门静脉注射模型可用于在无多器官转移干扰且具有完整免疫功能的宿主中研究乳腺癌在肝脏的病灶。本方案是在先前已发表的外科手术方法基础上的改进，可实现门静脉通路，直接将肿瘤细胞注射至肝脏16,55,56。我们的一项改进是将注射的肿瘤细胞数量从原先的 ≥ 1 × 105 个细胞/次16,55,56 显著减少至 ≤ 10,000 个肿瘤细胞/次。此外，我们还拓展了该模型用于乳腺癌肝转移的研究。利用本方案，两种已知具有转移潜能的乳腺癌细胞系相较于一种更静止的乳腺肿瘤细胞系，可在肝脏中更快地形成转移灶。此外，在早期时间点，注射肿瘤细胞后，细胞以单个细胞或少量细胞团的形式分布于整个肝实质中。该模型适用于研究转移效率相关的问题，包括肿瘤细胞的外渗、细胞存活、休眠及增殖——这些表型均参与肝脏微转移及显性转移性疾病的形成过程。

在开展研究之前，必须充分考虑门静脉注射方案的多个方面。强烈建议根据小规模探索性研究的结果，仔细确定细胞系、细胞浓度、总细胞数以及感兴趣的终点指标。此外，使用免疫功能健全的宿主和同源细胞系对于理解宿主与肿瘤细胞之间的相互作用至关重要。新开发的"发光头部"小鼠模型能够从前脑垂体表达eGFP和荧光素酶，是消除宿主对异源性eGFP和荧光素酶（常用于标记乳腺肿瘤细胞系的蛋白）产生免疫反应的重要工具75。结合使用"发光头部"小鼠与同源标记的肿瘤细胞，可在免疫组化（IHC）检测中轻松识别单个播散性肿瘤细胞和微转移灶，同时避免因eGFP或荧光素酶引发的炎症反应干扰。同样，建议谨慎选择镇痛策略，以确保药物治疗方案对肿瘤无促进或抑制作用。本方案中的关键步骤包括在整个手术过程中维持无菌条件，防止感染发生，否则将干扰实验结果。此外，必须确保针头准确插入门静脉，以保证肿瘤细胞被有效输送至肝脏。使用印度墨水等染料预先练习该操作有助于提高准确性。若在皮肤切口处出现肿瘤生长，则提示针头位置不当。最后，在缝合动物前，必须充分控制并完全止住门静脉的出血。使用止血纱布可显著降低注射后门静脉不可控出血的风险。据我们经验，使用止血纱布后，因注射后门静脉出血导致的手术相关死亡率从小鼠群体的30%降至2%。

需要注意的是，门静脉注射模型并不能完全复制整个转移级联过程，仅限于研究肿瘤细胞的血管外渗、血管外渗后的肿瘤细胞-微环境相互作用以及肿瘤生长。目前迫切需要能够准确复制临床上患者肝脏转移全过程的模型。门静脉注射模型的另一个局限性在于，手术对宿主的影响会干扰实验结果，已知伤口愈合过程会影响疾病进展76,77。

门静脉注射模型是对其他用于研究肝转移的注射模型（包括心内注射模型和脾内注射模型）的改进。具体而言，与心内注射模型相比，门静脉注射模型能够研究更广泛的疾病进展过程，因为心内注射模型常受到其他组织同时发生转移的限制。此外，与脾内注射模型需要切除脾脏不同，门静脉模型无需切除脾脏，因而操作更为简便。

门静脉注射模型可能成为研究肝转移的有用工具。总体而言，肝转移是腺癌最常见的转移部位，尤其在胰腺癌中转移率极高（85%的转移灶位于肝脏），结肠和直肠腺癌（>70%），以及胃和食管腺癌（>30%）1。尽管胰腺癌和结肠腺癌的自发性及原位肿瘤模型更易发生肝转移78,79，但门静脉注射模型有助于理解这些癌症的转移过程，因为通过可控地输送肿瘤细胞，可在肿瘤细胞到达肝脏后的特定时间点进行生化、分子和组织学评估。总之，门静脉注射模型是对现有乳腺癌肝转移模型的重要改进，也可能广泛适用于肝转移研究领域。

披露

作者无任何利益冲突需要披露，并声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者谨此感谢 Alexandra Quackenbush 在视频实验方案拍摄期间对手术操作的协助，感谢 Hadley Holden 提供组织学支持，感谢 Sonali Jindal 在方法开发过程中对肿瘤和肝脏病理学提出的建议，以及感谢 Breanna Caruso 对手稿的严格审阅。D2A1 和 D2.OR 乳腺肿瘤细胞由 Ann Chambers 博士惠赠，D2A1-GFP 肿瘤细胞由 Jeffrey Green 博士惠赠，4T1 肿瘤细胞由 Heide Ford 博士惠赠。本研究成像工作使用了位于 Jungers 中心的俄勒冈健康与科学大学（OHSU）先进光学显微镜核心设施。本手稿所包含的研究工作获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）NRSA F31CA186524（资助对象：ETG）和 NIH/NCI 5R01CA169175（资助对象：PS）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 ml 注射器配26号针头BD 注射器309597用于皮下注射布托啡诺；使用时需谨慎，注意锐器安全
酒精消毒片菲舍尔科技06-669-62手术切口前清洁腹部
通用型海绵，无菌Kendall80444" × 4"，使用时浸入无菌生理盐水，以在手术期间保护并保持大小肠的湿润
人工泪液Rugby370114矿物油15%，白凡士林83%；用于手术期间保护眼睛
盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mlReckitt Benckiser 生产NDC-12496-0757-1按体重0.05–0.1 mg/kg给药，每日1–2次，持续72小时，皮下注射
盐酸布比卡因，0.5% (5 mg/ml)Humira Inc 生产NDC-04091163-01使用浓度0.5%，术后立即使用一次，于切口部位皮下注射10 μl 
抗CD45抗体BD Pharmingen550539用于多重免疫荧光染色，以排除白细胞干扰，识别转移灶
Celox™ 快速止血纱布Medtrade Products Ltd.FG08839011剪成5 mm²小片，注射后加压用于控制门静脉出血
化学脱毛剂用于去除手术区域毛发；多个供应商
氯己定，2% 溶液Vet One1CHL008使用时需谨慎，避免接触小鼠黏膜或耳部
抗CK18抗体Abcamab53118用于多重免疫荧光染色以识别转移灶
棉签，无菌菲舍尔科技23-400-1146" 木柄，每袋2支
DMEM高糖培养基HyCloneSH30243.01用于D2A1、D2.OR和4T1乳腺肿瘤细胞系的细胞培养基础培养基
干式玻璃珠灭菌器用于手术间歇期间对不锈钢器械进行灭菌；使用时需谨慎，温度极高；多个供应商
70%乙醇溶液易燃，使用时需谨慎；根据需要清洁手术区域；多个供应商
胎牛血清HyCloneSH30071.03用于D2A1、D2.OR和4T1乳腺肿瘤细胞系的细胞培养添加剂，在高糖DMEM中使用浓度为10%
纱布，无菌Kendall21462" × 2"，使用时浸入2%氯己定溶液，用于术前腹部清洁
抗绿色荧光蛋白抗体Vector LaboratoriesBA0702用于染色GFP标记的D2A1或其他乳腺肿瘤细胞系
L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)Gibco25030-081用于D2A1、D2.OR和4T1乳腺肿瘤细胞系的细胞培养添加剂，在高糖DMEM中使用浓度为2 mM (1倍)
加热垫，2–3个用于手术及恢复期间维持体温；多个供应商
血细胞计数板Hausser Scientific1483用于细胞培养中的细胞计数
止血钳不锈钢材质；多个供应商
抗Heppar-1抗体DakoM7158用于多重免疫荧光染色，以排除肝细胞干扰，识别转移灶
胰岛素注射器，0.3 ml，29号针头BD  324702用于缝合部位布比卡因注射；使用时需谨慎，注意锐器安全
异氟烷PiramalNDC-66794-017-25给药浓度为2.5%
异氟烷挥发器VetEquip911103使用时需谨慎，可汽化麻醉气体
光源用于术中视野照明；多个供应商
中性缓冲福尔马林，10%Anatech Ltd.135有毒，使用时需谨慎；用于组织固定，以通过组织学评估转移终点和转移负荷
Opal™ 四色免疫荧光染色试剂盒PerkinElmer, Inc.NEL794001KT用于Heppar-1/CD45/CK18多重免疫荧光染色，检测小鼠肝脏中的转移灶
手术剪不锈钢材质；使用时需谨慎，注意锐器安全；多个供应商
青霉素/链霉素，100倍浓缩液Corning30-002-Cl用于D2A1、D2.OR和4T1乳腺肿瘤细胞系的细胞培养添加剂，在高糖DMEM中使用浓度为1倍
磷酸盐缓冲液使用1倍浓度，在注射前重悬肿瘤细胞；多个供应商
可拆卸针头注射器，25 μl，型号1702Hamilton7654-01用于门静脉注射；使用时需特别谨慎，尤其是操作载有肿瘤细胞的针头时，针头安装后具锐性
手术刀柄不锈钢材质；多个供应商
手术刀片，#15碳钢，无菌，尺寸15；多个供应商
小接头可拆卸针头，32号Hamilton7803-04用于门静脉注射，长度1"，尖端类型4，角度12°；也可使用33–34号可重复使用针头；使用时需特别谨慎，尤其是操作载有肿瘤细胞的针头时，具锐性
次氯酸钠具腐蚀性，使用时需谨慎；使用浓度10%对工作区和表面进行消毒；多个供应商
无菌生理盐水菲舍尔科技BP358-2120.9% NaCl溶液；也可自行配制并经无菌过滤
外科手套，无菌多个供应商
缝合线，无菌 EthiconJ310H4-0，27" 涂层Vicryl，配22 mm 1/2c圆锥Ethalloy针；使用时需谨慎，注意锐器安全
台式便携式麻醉机VetEquip901801与异氟烷挥发器配合使用，用于小鼠麻醉
持针钳不锈钢，带齿，钝头；多个供应商
手术巾，无菌 Dynarex441018" × 26"，用于覆盖加热垫并在手术期间提供无菌操作区域
台盼蓝Life TechnologiesT10282用于细胞培养中细胞活力检测，按1:1比例与1倍PBS中的细胞混合使用
胰蛋白酶/EDTA，0.05% (1倍)Gibco25300-054用于细胞培养中使肿瘤细胞从培养皿表面脱落

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