ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

摘要

ACT-PRESTO（活性透明技术——基于压力的高效稳定大分子递送至器官）能够实现快速、高效且低成本的组织透明化，并通过被动扩散或压力辅助递送方式，促进抗体快速渗透入透明化组织。利用该方法，可对多种组织进行透明化处理，使用多种抗体进行免疫标记，并实现整体体积成像。

摘要

在细胞水平上对器官或整个生物体的精细结构进行鉴定和探索，是生物学中的基本挑战。传统方法需要耗费大量时间和精力才能获得三维图像，包括对完整组织进行切片、免疫标记以及对连续切片组织进行成像，这些步骤在每个环节都会导致信息丢失。在近期发展的完整组织高分辨率成像技术中，分子表征被限制于蛋白质标记。然而，目前可用的器官透明化方案通常需要相当长的时间，使得组织透明化技术难以在实验室中广泛应用。我们近期建立了一种快速且高度可重复的方案，称为 ACT-PRESTO（active clarity technique–pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs，主动透明技术——压力相关的大分子高效稳定递送至器官），可在数小时内实现组织透明化。此外，ACT-PRESTO 能够结合常规方法实现快速免疫标记，并通过施加压力或对流流动，加速抗体向致密厚组织深层的渗透。本文描述了组织样本的制备方法、利用电泳去除脂质实现透明化的步骤，以及通过压力辅助递送进行免疫染色的操作流程。该方案的快速性和一致性将加速三维组织学研究及基于体积的病理诊断的开展。

引言

神经科学领域的挑战之一是可视化完整脑组织中的神经环路连接以及单个细胞。直到最近，以这种方式展示神经元之间的连接需要三个步骤：1）对组织进行连续切片；2）对特定靶标（如轴突或蛋白质）进行分子标记；3）通过计算机对二维连续图像进行配准或对齐，进而实现全脑的三维重建¹。这些步骤费时费力，且在切片和标记过程中容易丢失信息，使得神经网络的绘制极为困难。然而，目前已开发出多种无需切片即可实现完整组织可视化的技术。通过组织透明化技术，生物组织可变得光学透明^2-10。其中主要方法之一是降低完整组织与浸没溶液之间的折射率差异，从而减少光在组织中的散射，使组织透明化，进而实现深层结构的观察。某些类型的浸没溶液具有疏水性，在脱水过程中会导致荧光迅速淬灭。因此，这些方法不适用于长时间的荧光成像^11,12。与使用疏水性试剂的方法不同，其他方法采用亲水性试剂进行组织透明化处理，例如 SeeDB⁴ 和 Scale⁶，这些方法能够较好地保持生物组织的结构信息和荧光信号^4,6,8。然而，包括抗体在内的大分子仅靠扩散难以渗透至完整组织的内部核心区域。因此，在致密组织深层区域对靶分子进行预先标记在技术上仍具有挑战性。

在最近开发的一种组织透明化方法CLARITY³中，使用丙烯酰胺形成水凝胶包埋的生物组织，并在含十二烷基硫酸钠（SDS）的溶液中通过电泳去除脂质。随后将样品浸入折射率匹配的溶液中，以减少光散射³。后续在高级CLARITY¹³和PACT（被动透明化技术）¹⁰中对脂质清除系统进行了改进。聚合后，丙烯酰胺链与蛋白质交联，形成水凝胶-组织复合物。脂质成分无法与丙烯酰胺交联，因此可在含SDS的缓冲液中通过电泳将其去除。通过主动清除脂质，脑组织的透明度显著提高⁹。然而，这些方法并未解决游离扩散无法实现深层标记的问题。为克服这一局限性，需要开发将试剂主动输送至厚组织最深层的技术。

尽管CLARITY技术能够实现组织透明化和深层组织成像，但它并非一种简单或快速的流程。清除整个小鼠大脑可能需要数周时间^7,14。组织的快速透明化对于将此类方法应用于生命科学研究或体积诊断的基本或临床实验室环境至关重要。本方案提供了一种简化的生物组织透明化流程，并通过压力辅助递送免疫染色实现后续蛋白质检测。该方法适用于与成像技术联用，进行大视野高分辨率体积成像以及三维数据处理系统分析。

方案

动物实验必须符合所有相关的政府和机构规定。

1. 试剂的准备

1. 对于水凝胶单体溶液（A4P0）：将20 g丙烯酰胺加入450 mL 0.1x磷酸盐缓冲液（PBS）中，再用0.1x PBS定容至500 mL。
   警告：丙烯酰胺单体具有毒性。所有操作均须在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备，包括面罩、实验服、手套和封闭式鞋。
   1. 使用前立即在通风橱中，将100 mg 2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐加入50 mL锥形管中的40 mL水凝胶单体溶液（A4P0）内。
2. 用于电泳组织透明（ETC）缓冲液：将40 g十二烷基硫酸钠（SDS）和12.37 g硼酸加入800 mL去离子H₂O (dH₂O）。用 NaOH 调节 pH 至 8.5，并用额外的 dH₂O 定容至 1 L。₂O.
   注意：SDS 是一种有害化学物质，操作时需小心谨慎。
3. 对于CUBIC-mount溶液：加入250 g蔗糖、125 g尿素和125 g N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺加入至150 mL去离子水中₂O，并用去离子水定容至 500 mL₂O.

2. 样品制备 & 固定

1. 处死小鼠。
   1. 在同一注射器中配制阿法沙龙（1 mg/kg）和赛拉嗪（0.5 mg/kg）。
   2. 腹腔注射阿法沙龙与赛拉嗪的混合液，等待3分钟，使小鼠进入无意识状态。
   3. 在继续操作前，需确认麻醉后的小鼠对疼痛刺激（如尾部夹捏）无反应。
      注意：动物操作应遵循所在机构的相应指导原则。
2. 用含肝素（100 U/mL）的100 mL 0.9% NaCl溶液（pH 7.4–7.5）经心脏灌注小鼠以清除血液，随后用100 mL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液（pH 7.4）进行灌注固定¹⁴。
   注意：PFA溶液具有毒性，配制PFA溶液及后续所有操作必须在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备。
3. 剪下小鼠头部，切开皮肤，用小剪刀在两眼之间剪开颅骨。
4. 使用小型弯头镊子移除颅骨碎片。
5. 取出脑组织或所需器官。
6. 将脑组织和器官在4 °C条件下，置于4% PFA后固定液中孵育过夜。
   注意：如需对特定区域进行组织透明化处理，可在组织固定后解剖出目标区域或修剪组织。
   注意：PFA溶液具有毒性，经心脏灌注及后续所有小鼠操作必须在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备。

3. 水凝胶单体灌注与聚合

1. 将固定的器官在 A4P0 水凝胶单体溶液中于 4 °C 下孵育 12–24 小时，并轻轻振荡。
2. 水凝胶单体浸渗组织的聚合。
   1. 将样品转移至含有 5 mL 水凝胶单体溶液的 10 mL 圆底管中。用 Parafilm 封闭圆底管管口。
   2. 向装有浸渗了水凝胶的完整小鼠脑组织样品的圆底管中通入氮气 1 分钟，以去除氧气。迅速并紧密地封闭含有样品的管子。
3. 将管子置于 37 °C 水浴中 2 小时。
4. 用 0.1x PBS 快速洗涤聚合后的样品，以去除多余的水凝胶。
   注意： 水凝胶单体具有毒性。为避免皮肤接触水凝胶单体，所有操作均应在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备，包括面罩、实验服和手套。
   备注： 聚合后的组织可在含叠氮化钠的 0.1x PBS 中于 4 °C 保存超过 2 周。
   注意： 叠氮化钠具有高度急性毒性。所有操作均应在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备，包括面罩、实验服和手套。

4. 电泳组织透明化（ETC）

1. 将聚合后的样品转移至组织容器中，并将组织容器放入ETC室。
2. 使用蠕动泵将ETC缓冲液注入ETC室。
3. 设定ETC运行条件并启动ETC。采用以下设置：
   1. 对于完整器官的ETC设置，使用以下参数：电流（1.5 amp）、温度（37 °C）、运行时间（6.0 h）、泵速（30 rpm）。
   2. 对于1至2 mm厚的小鼠脑切片的ETC设置，使用以下参数：电流（1.5 amp）、温度（37 °C）、运行时间（2.0 h）、泵速（30 rpm）。
4. 将透明化后的样品转移至含有45 mL 0.1x PBS的50 mL锥形管中。用0.1x PBS多次清洗样品，直至轻轻振荡管子时不再出现气泡（以确认SDS已完全去除）。

5. ACT 处理组织的免疫标记

1. 对于小鼠全脑：将样本置于含有1x PBS、6% 牛血清白蛋白（BSA）、0.1% Triton X-100 和 0.01% 叠氮化钠的3 mL抗体溶液（抗体稀释液）中，加入酪氨酸羟化酶（TH）抗体（稀释比例为1/500），在37 °C条件下轻度振荡孵育4天。在第2天结束时更换抗体溶液。
   1. 在50 mL锥形管中用45 mL的0.1x PBS清洗样本，持续3–5小时，每小时更换一次缓冲液。
   2. 将样本置于3 mL抗体稀释液中，加入驴抗兔488二抗（稀释比例为1/500），在37 °C条件下轻度振荡孵育4天。在第2天更换稀释后的抗体溶液。
2. 对于1–2 mm厚的脑组织切片：将样本置于0.5–1 mL抗体稀释液中，加入IV型胶原抗体（稀释比例为1/500），在37 °C条件下轻度振荡孵育过夜或最长1天。
   1. 在15 mL锥形管中用12 mL的0.1x PBS清洗样本，持续1–2小时，每小时更换一次缓冲液。
   2. 将样本置于0.5–1 mL抗体稀释液中，加入Cy3标记的抗兔二抗（稀释比例为1/500），在37 °C条件下轻度振荡孵育过夜或最长1天。
3. 用0.1x PBS清洗样本3–5小时，每小时更换一次缓冲液。
4. 成像前，将样本置于适量CUBIC-mount溶液中，在室温下轻柔振荡孵育1小时。更换新鲜的CUBIC-mount溶液，再孵育1小时。
   注意： 在小鼠ACT处理的组织中，已有76种抗体表现出良好的效果，其中包括31种单克隆抗体¹⁴。预先标记的组织可与ACT处理组织中另外两种荧光染料的免疫标记联合使用。

6. 致密组织的免疫标记（PRESTO）

1. c-PRESTO
   注意：c-PRESTO 适用于小尺寸样本，例如完整睾丸、完整肾脏或较大器官的小片组织。
   1. 将样本转移至 1.5-mL 离心管中，加入 500 µL 抗体稀释液（IV 型胶原抗体稀释比例为 1/500），在 600 × g 条件下离心 2 小时。
   2. 用 0.1x PBS 通过 600 × g 离心 30 分钟洗涤染色后的样本。
   3. 加入 500 µL 抗体稀释液（Cy3 标记的兔抗二抗稀释比例为 1/500），在 600 × g 条件下离心 2 小时。
   4. 用 0.1x PBS 通过 600 × g 离心 30 分钟洗涤染色后的样本。
2. s-PRESTO
   注意：s-PRESTO 适用于较大组织。
   1. 准备一支 30-mL 注射器，并将其连接至三通阀（图 1A）。使用热熔胶枪对三通阀进行加固，以承受高压条件（图 1B）。
   2. 将样本转移至处于关闭状态的三通阀连接注射器中。
   3. 加入 5–7 mL 抗体稀释液（IV 型胶原抗体稀释比例为 1/500）。打开阀门，将抗体溶液注入样本中。
   4. 将注射器活塞调至 17-mL 位置，以提供足够的灌注/回吸行程空间。此操作可在阀门开启状态下完成。注射器设置完成后关闭三通阀。
   5. 将装有样本的注射器置于注射泵上。设置注射泵参数为灌注/回吸流速 10 mL/min，暂停时间 4 分钟，运行模式为连续循环（图 1C）。
      注意： 泵持续灌注至目标体积（10 mL）后，经短暂暂停（4 分钟）改变流动方向。
   6. 在室温下运行注射泵 3–24 小时（图 1F）。
   7. 打开三通阀，用 0.1x PBS 更换溶液。
   8. 使用注射泵，每次用 0.1x PBS 洗涤染色样本 1 小时，共洗涤两次。
   9. 更换为含 Cy3 标记的兔抗二抗的抗体稀释液（稀释比例为 1/500），并运行注射泵 3–24 小时。
   10. 打开三通阀，用 0.1x PBS 更换溶液。
3. 成像前，将染色样本置于适量 CUBIC-mount 溶液中，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。更换新鲜的 CUBIC-mount 溶液，继续孵育 1 小时。

7. 成像

1. 将标记好的组织放入共聚焦培养皿中，加入CUBIC-mount溶液至完全覆盖组织。在组织上放置盖玻片。使用共聚焦显微镜在10倍物镜下对组织进行成像¹⁴。

结果

ACT-组织透明化

影响组织透明化的一个重要因素是组织固定。在本方案中，PFA固定和丙烯酰胺灌注是两个独立的步骤。在组织-水凝胶聚合步骤之后，游离的A4P0溶液不会发生聚合，尽管组织内已渗入的水凝胶会与内源性大分子交联。因此，在组织外部不应形成凝胶（图2A）。与CLARITY方案相比，ACT方案导致蛋白质与丙烯酰胺之间的交联程度较低。因此，组织-水凝胶样品具有更高的多孔性。这一特性使得脂质能够快速被提取，同时有利于大分子的扩散。厚度为1至2毫米的小鼠脑组织切片在1至2小时内即可实现充分透明化（图2B），而完整的小鼠脑组织经5至6小时的电泳透明化（ETC）即可完成透明（图2C）。水凝胶介导的组织透明化在ETC步骤后会引起组织膨胀，但在折射率匹配溶液中，组织可恢复至原始大小。ACT方案中形成的组织-水凝胶样品高度多孔，因此小分子化合物和大分子均可高效渗透并易于扩散（图3）。将1毫米厚的小鼠脑切片与酪氨酸羟化酶（TH）和IV型胶原抗体共同孵育2小时后，再与二抗孵育2小时，即可在深度达500 µm处有效标记多巴胺能神经元（图3）。

PRESTO-组织免疫标记

致密器官通常含有高浓度的细胞外基质（ECM）纤维，这会影响抗体向组织内部的渗透。因此，在孵育12小时后，抗体在肾组织等致密组织中的渗透深度仅为20–30 µm。为克服这一限制，我们设计了能够将试剂递送至深层组织的活性大分子渗透方法，即PRESTO（压力相关高效稳定的大分子器官递送技术）（图4）。与对经ACT处理的肾组织进行静态孵育相比，使用台式离心机施加离心力（600 × g）（离心式PRESTO，c-PRESTO）显著提高了抗体向深层组织的递送效率（图5）。当我们将c-PRESTO方法应用于致密组织时，仅需3小时的孵育即可标记深度达250–300 µm的结构。为了在不造成显著组织损伤的前提下改善组织形变，我们还设计了一种利用注射泵提供对流流动的装置（注射泵式PRESTO，s-PRESTO）。该方法与被动扩散相比，同样显著提升了抗体的渗透效果（图5）。

图1. s-PRESTO装置的准备。A. 一个注射器（30 mL）和一个三通旋塞阀。B. 将三通旋塞阀连接并粘接到注射器上。C. 注射器中装有样品和抗体溶液，并将注射器放置在注射泵上。D. 注射泵及工作条件设置。E. 泵将含有标记试剂的溶液注入样本中。当达到指定体积后，泵送方向改变，在设定的时间后将溶液抽出。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 小鼠脑组织的ACT透明化处理。A. 聚合后，未结合组织的A4P0溶液未发生聚合；而渗入组织的水凝胶则通过与内源性大分子交联形成凝胶。 B. 1至2毫米厚的脑切片透明化处理1至2小时，并记录在折射率（RI）匹配溶液中膨胀程度及尺寸恢复情况。 C. 整个小鼠脑组织厚度约为0.8 cm，经过5至6小时的ETC处理即可实现完全透明化。ETC处理3小时后，仍有大量组织未被透明化；然而，至6小时时，整个脑组织均已透明。ACT处理后脑组织在ETC缓冲液中呈白色或不透明状；通过调节折射率，组织变为透明。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 使用ACT透明化处理的小鼠脑组织进行免疫标记。 经ACT处理的1毫米厚小鼠脑切片图像，显示小鼠脑皮层使用IV型胶原抗体染色，中脑部分使用酪氨酸羟化酶（TH）抗体染色。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. PRESTO 免疫标记方法。 抗体无法通过扩散方式渗透进入致密组织。PRESTO 免疫标记方法的设计旨在主动灌注大分子并将试剂递送至致密组织内部。使用标准台式离心机施加离心力（离心式 PRESTO，c-PRESTO）显著促进了抗体的递送。采用注射泵施加对流流动（注射式 PRESTO，s-PRESTO）进一步改善了抗体的渗透效果。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. ACT透明化致密组织的PRESTO免疫标记。 对于c-PRESTO，使用标准台式离心机在600 × g条件下离心3小时，以加速一抗和二抗的渗透。对于s-PRESTO，则采用注射泵输送抗体。小鼠器官（如肾脏和肝脏）使用IV型胶原进行标记。与传统方法相比，c-PRESTO或s-PRESTO处理3小时显著提高了标记深度。在肾脏和肝脏中，PRESTO样本（右）的Z轴标记深度可达300–350 µm甚至更深，而对照样本（左）的标记深度仅为40–50 µm。三维重建图像通过共聚焦显微镜获得。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

固定不充分或水凝胶渗透不完全可能导致组织在透明化过程中蛋白质丢失和组织变形。完整的成年小鼠脑组织应先在4%多聚甲醛中4℃孵育过夜，随后在至少20 mL的水凝胶单体溶液中轻轻振荡浸润12至18小时。对于较大的组织，包括人脑切片和脊髓等人类组织，需延长在水凝胶单体溶液中的浸泡时间。ACT方案易于应用于固定组织的透明化，因为组织固定与聚合物灌注步骤是分离的。在组织透明化后，人类组织可被多种抗体良好染色。需要注意的是，ACT透明化技术与乙醇、甲醇等醇类固定剂不兼容。

组织-水凝胶聚合步骤对于透明化处理后获得高质量的组织样品也至关重要。由于氧气会抑制丙烯酰胺的聚合反应，因此应通过在氮气注入系统下对含有组织的溶液进行脱气处理以去除氧气。或者，也可使用真空腔室配合加热模块处理23小时来实现去氧。

清除速率取决于多种因素，包括器官大小、脂质或细胞外基质纤维蛋白的含量、固定状态等。 等等。 大多数成年小鼠组织均可在ETC中过夜完成透明化。然而，存在过度透明化和组织肿胀的风险，因此透明化时间的差异需予以重要考虑。组织透明化的条件应通过实验经验确定。重要的是，细胞外基质（ECM）的成分可能影响透明化后组织的外观。由于ACT无法清除致密的蛋白质纤维，即使经过ETC缓冲液中的ACT处理，组织颜色仍保持白色或不透明状态。然而，当这些器官浸入折射率匹配溶液后，即变为透明。

组织肿胀的速率似乎取决于组织的细胞外基质（ECM）含量，柔软的器官（如脑）比致密器官表现出更高的肿胀比例。由于增强的组织肿胀有助于组织透明化过程，ACT 通常在大多数情况下使用基于蒸馏水的缓冲液。在某些情况下，当组织肿胀或暂时性形变不可取时（例如胚胎样本），可采用含有 0.1x PBS 的缓冲液以实现高分辨率成像。还应注意，缓冲液中较高的盐浓度可能导致组织收缩。

ACT 方法可以实现小鼠整个器官甚至全身体组织的透明化¹⁴。然而，对透明化组织进行深层成像需要特殊的显微镜和物镜。因此，使用常规共聚焦显微镜成像时，厚度为 1 至 2 毫米的脑组织效果最佳。据我们经验，ACT 处理后的组织中已标记抗体的去除效果依赖于具体抗体，因此不建议进行多轮不同抗体的标记。多种抗体（如 TH 和 GFAP）在全脑免疫标记中表现出特别良好的效果¹⁴。另一方面，某些抗体（如 Tuj1 或 Map2）通常仅能标记组织表面。这一问题可能通过其他方法（如 SWITCH¹⁵）得到改善。另一个潜在的局限性在于，由于组织透明化过程中会发生组织膨胀与收缩，可能难以在 ACT 处理后的组织中保持精细的蛋白质结构。

PRESTO 技术可广泛应用于多种组织标记方法。例如，在使用预先标记组织的透明化组织技术（如 SeeDB⁴ 和 iDISCO⁷）中，致密组织的免疫标记需要数天至数周的孵育时间。然而，PRESTO 可将孵育时间缩短至数小时，使得在一天内完成整个流程成为可能，即使对于厚度达 1 mm 的致密组织亦是如此。PRESTO 能够提高对厚且致密组织，甚至未经透明化处理的厚组织进行深层标记的效率。由于 PRESTO 仅需使用台式离心机或注射泵，无需任何特殊设备，因此该技术易于与常规实验室操作流程相结合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Lugen SCI	LGB-1175-4B	样本固定
丙烯酰胺	Affymetrix	75820	水凝胶单体溶液
2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐	Wako Pure Chemical Industries	VA-044	水凝胶单体溶液
硼酸	Affymetrix	76324	ETC 缓冲液
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Affymetrix	18220	ETC 缓冲液
氢氧化钠颗粒	Junsei chemical	1310-73-2	ETC 缓冲液
牛血清白蛋白 (BSA)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323A	免疫标记
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787	免疫标记
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	免疫标记
酪氨酸羟化酶 (TH)	Millipore	AB152	抗体/免疫标记
Alexa Fluor Cy3 驴抗兔 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	二抗/免疫标记
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG (H+L)	Life Technologies - Molecular Probes	A21206	二抗/免疫标记
共聚焦培养皿	SPL lifesciences	101350	成像
共聚焦显微镜	Leica	SP8	成像
蔗糖	Junsei chemical	31365-0301	CUBIC-封片溶液
尿素	Affymetrix	23036	CUBIC-封片溶液
N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺	Sigma-Aldrich	122262	CUBIC-封片溶液
ETC 电泳室	Logos Biosystems, Inc.	C10101	ETC 系统
ETC 电泳室控制器	Logos Biosystems, Inc.	C10201	ETC 系统
温度探头	Logos Biosystems, Inc.	C12101	ETC 系统
蠕动泵	保定雷诺恒业精密泵有限公司	YZ1515X	ETC 系统
缓冲液储液罐	Logos Biosystems, Inc.	C10401	ETC 系统
组织容器	Logos Biosystems, Inc.	C12001	ETC 系统
单组织容器支架	Logos Biosystems, Inc.	C12002	ETC 系统
小鼠脑片支架	Logos Biosystems, Inc.	C12004	ETC 系统
大鼠全脑支架	Logos Biosystems, Inc.	C12007	ETC 系统
蠕动泵管路	Logos Biosystems, Inc.	C12104	ETC 系统
台式离心机	韩一科学工业有限公司	MICRO 12	c-PRESTO
注射泵	保定雷诺恒业精密泵有限公司	LSP02-1B	s-PRESTO
注射器 (30 mL)	韩国疫苗株式会社	KV-S30	s-PRESTO
三通旋塞阀	协成医疗株式会社	HS-T-01N	s-PRESTO