一种利用简易方法测量奖赏寻求行为变化的方式 黑腹果蝇

摘要

我们描述了一种利用果蝇（Drosophila melanogaster）自愿摄入乙醇作为奖赏状态变化指标的方法，用于诱导其产生奖赏性和非奖赏性体验的实验方案。

摘要

我们描述了一种利用果蝇（Drosophila melanogaster）测量乙醇自我给药行为的实验方案，以此作为评估奖赏状态变化的间接指标。本方法展示了一种简便途径，用于探查果蝇的奖赏系统，调控与自然奖赏相关的经验，并将乙醇的自主摄入作为奖赏状态改变的衡量指标。该方法为研究在经验介导的内部状态变化中起作用的神经元和基因提供了有效工具。本方案包含两个独立部分：一是使果蝇经历奖赏性和非奖赏性体验，二是通过检测乙醇的自主摄入量来评估获取药物奖赏的动机。这两个部分可分别独立使用：前者可用于诱导经验调控，作为后续下游实验的初始步骤；后者可作为独立的双选择摄食实验。该方案无需复杂的设备，因此可在任何具备基本果蝇培养工具的实验室中实施。

引言

动物通过经验调整行为，使其能够适应环境的变化¹。在此过程中，动物将自身的内部生理状态与外部环境的变化相整合，并据此在多种行为中选择其一，以提高生存和繁殖的机会。奖赏系统在进化过程中形成，旨在通过强化对个体和物种生存至关重要的行为，来驱动这些行为的发生——例如摄食或饮水等促进短期生存的行为，以及交配行为或育幼等保障长期生存的行为²。滥用药物等人工化合物也能通过劫持介导自然奖赏的神经通路，影响奖赏系统²。

在过去的二十年中，果蝇Drosophila melanogaster已被确立为研究乙醇对行为影响的分子和神经机制的有前景的模式生物^3,4。

此前，我们已鉴定出果蝇中一类表达神经肽的神经元（NPF/NPF受体（R）神经元），这类神经元能够将自然奖赏（如交配经历）与获取药物奖赏的动机联系起来⁵。NPF的表达水平对交配经历和药物奖赏（如乙醇中毒）均敏感。NPF表达水平的变化会转化为乙醇自我给药行为的改变⁵，其中高水平NPF降低、低水平NPF则增加果蝇对乙醇的摄取偏好。激活NPF神经元对果蝇具有奖赏效应，表现为果蝇对与激活配对的气味表现出强烈偏好，同时乙醇摄入量也相应减少。更重要的是，激活NPF神经元会干扰果蝇形成乙醇中毒与气味线索之间正向关联的能力。NPF/R系统、奖赏记忆与乙醇摄入之间的因果关系表明，可以通过乙醇自我给药行为来评估奖赏状态的变化⁵。

在本出版物中，我们展示了一种整合性方法，用于激活果蝇的天然奖赏系统并检测奖赏状态的变化。该方法包括两个独立部分：首先采用训练方案调控与天然奖赏相关的经历，随后通过双选择毛细管饲喂实验（CAFE）评估乙醇的自我摄入，以此作为奖赏状态变化的指标。CAFE实验类似于啮齿类动物药物自我摄入研究中使用的双瓶选择实验，已被证明能够反映果蝇中类似成瘾行为的某些特性⁶。

方案

注意：实验设计的总体概述：本实验设计包含一种改良的求偶抑制方案^7-9，其中雄性果蝇在4天内连续经历3轮训练，分别接受具有奖励性和无奖励性的经历。在经历阶段结束后，果蝇将接受为期3 – 4天的双选自愿乙醇摄入实验检测。本文所述方案包括多个准备步骤，其中部分步骤可提前完成，并可用于多个实验；而另一些步骤则需在实验开始前适时进行（表1）。

1. 准备步骤

1. 制备毛细管饲喂系统
   1. 加热 27 G针头，并用其在小瓶上穿刺出若干小孔图1).
   2. 用剃刀刀片将小瓶塞横向切成两半。在瓶塞表面标记四个点，形成一个方形，用于定位毛细管支架。使用18 G针在塞子上扎出4个孔（图1b).
   3. 使用剃须刀片切割微量移液器，使其能够牢固地夹持 5 µL 玻璃毛细管，用作连接适配器。
   4. 将4个毛细管接头插入制备好的胶塞中。
   5. 标记2个乙醇和 插头上两个不含乙醇的毛细管
      注意：建议在所有小瓶中保持两种毛细管位置的一致性。注意孔的大小，过大的孔会导致果蝇从小瓶中逃逸。此外，建议将塞子较光滑的一面（通常与切割面相对）朝下插入小瓶，因为切割塞子会产生一些细小松散的纤维，果蝇可能被缠住。
   6. 准备大量小瓶和接头，用于步骤2.3中所述的毛细管饲喂系统（CAFE）实验。
2. 准备小型玻璃食品瓶
   1. 在收集果蝇的前一天（步骤1.4），将200个玻璃小瓶放置于微量离心管架上。融化果蝇培养基（按照玉米粉糖蜜配方，参见 材料清单) 使用微波炉加热。将 2 mL 果蝇培养基倒入玻璃小瓶中（尽量避免将培养基沾到瓶壁上）。待培养基凝固后，用塑料膜封住瓶口。
      注意：装有食物的玻璃小瓶可保存于 4 °C 数周。
   2. 在收集果蝇当天，将试管从冰箱中取出，待其恢复至室温后再用于盛放果蝇。
      注意：如果食物瓶已存放数周，需确保培养基仍保持完整，未从瓶壁脱落，因为果蝇可能被困在培养基与玻璃之间的缝隙中。
3. 为毛细管饲喂实验配制储备食物溶液
   1. 配制储备食物溶液（5%蔗糖和5%酵母提取物）：将5.88 g酵母提取物和5.88 g蔗糖溶解于100 mL蒸馏水中。
      注意：该储备液极易被污染，因此建议对其进行高压灭菌（121 °C，30 分钟，且不进行干燥循环）并分装至 850 µL 工作分装样品应保存于 4 °C 直至进一步使用。储备液中各成分的浓度为5.88%，在加入15%乙醇或水后，终浓度将降至5%。150 µL 进入 850 µL （在步骤2.3使用前立即加入预制食物溶液）
4. 收集实验果蝇
   1. 使用 CO₂ 收集 200 只未经交配的雄性果蝇₂ 垫
      注意：根据实验问题选择任何相关的实验室品系。可在果蝇羽化挑选阶段从五个培养瓶中轻松收集约250只果蝇。收集果蝇时，需仔细挑选刚羽化的个体（外观 virgin 的果蝇：体色鲜亮、腹部带有粪便斑的果蝇）。实验用果蝇应单独饲养于含食物的小型玻璃小瓶中，并培养至3–4日龄。 在实验使用前需保持一定时间的陈化。
   2. 使用软塞封闭小瓶。
      注意：在实验阶段使用口吸法将雌蝇插入和移出试管时，相同的软塞在训练阶段也非常有用。
5. 收集训练用果蝇
   注意：所有收集的果蝇应置于12 h/12 h 光照/黑暗培养箱于 25 °C 和70%相对湿度（RH）。12 h/12 h 光照/黑暗周期可调整为方便的起始时间。
   1. 处女雌性训练果蝇
      1. 从野生型品系或 virginator 品系中收集 500 只处女雌性训练用果蝇，作为处女受精雌蝇使用。将雌蝇按每瓶 25 只分装至常规大小的培养瓶中，置于培养基上饲养，待其羽化后 3–4 天再用于实验。
   2. 交配过的雌性训练果蝇
      1. 从野生型品系或virginator品系中收集300只处女雌蝇，用于训练阶段前的交配（步骤1.6.1）。
         注意：雌蝇在实验使用前，以每支常规大小的培养管饲养10只雌蝇为一组，饲养至3–4日龄。
   3. 用于产生交配后雌性训练果蝇的雄性果蝇
      1. 收集150只雄性果蝇（不一定是处女蝇）。
         注意：果蝇以每支标准大小的食物小瓶饲养15只雄蝇为一组，待其生长至3 - 4日龄后，与处女雌蝇配对，以制备交配过的训练用雌蝇。
6. 产生交配过的雌性训练果蝇
   1. 为获得用于训练的交配雌蝇，在训练阶段（步骤2.1）前16–18小时，将装有10只雌蝇的培养瓶与装有15只雄蝇的培养瓶对接，使雌雄蝇交配。¹⁰.
      注意：此步骤通常应在训练前一晚进行。雄性果蝇与雌性果蝇1.5:1的比例可确保所有雌蝇均完成交配。
   2. 实验当天，使用口吸器将雄蝇从试剂瓶中吸出，从而将交配过的雌蝇与雄蝇分离开来。此操作应在每次训练开始前立即进行。

2. 实验步骤

1. 设置实验阶段
   1. 尽可能在培养箱光照期开始时启动实验。将训练用雌蝇（包括处女蝇和交配过的雌蝇）放入行为观察室。
      注意：建议在行为实验箱或任何安静且隐蔽的环境中进行实验， 25 °C 以及60-65%的相对湿度（RH）。保持湿度在50%以上非常重要，因为求偶和交配行为依赖于信息素感知，而信息素感知已知对湿度敏感。
2. 让雄性果蝇经历奖励性和非奖励性体验
   1. 将装有单只雄蝇的玻璃小瓶放置于微量离心管架上，沿管架边缘排列小瓶。
      注意：这种设置使实验者能够方便地观察正在进行交配的果蝇配对，而无需将试管从架子上取出。
   2. 按照步骤2.2.1所述，准备两组各100个玻璃小瓶，每瓶含一只雄蝇，分别放置于不同的架子上，用于经历奖励性与非奖励性交配体验的雄蝇即 拒绝和交配
   3. 吸出训练用雌蝇，加入各含有雄蝇的西林瓶中。设置计时器为1小时。从被拒绝组开始，向每支西林瓶中加入一只交配过的雌蝇；随后处理待交配的雄蝇组，向每支西林瓶中加入一只未交配雌蝇。
   4. 密切观察交配过程，确保与未交配雌虫接触的雄虫在1小时内成功交配，而与已交配雌虫接触的雄虫不发生交配。为监测被拒绝交配的雄虫群体在1小时内的行为，设置第二个15分钟计时器，每隔15分钟观察一次雄虫行为。
   5. 将第一轮训练结束时未能成功交配的已配对组雄性，以及成功交配的被拒绝组雄性从实验中移除。
   6. 用移液器将先前交配过的雌性训练果蝇吸出，转移至一个普通的果蝇培养管中，并保留这些果蝇用于下一次条件化训练。随后，轻柔地用移液器将雌性果蝇从已交配的雄性组中吸出。
   7. 让果蝇静置 1 h。
   8. 重复步骤 2.2.3 至 2.2.7 两次。
   9. 按照步骤 2.2.3 - 2.2.8 每天重复训练，持续 3 天。
3. 记录摄食量（CAFE）
   1. 在最后一次条件化训练结束时（第四天），吸取单独的雄性果蝇，并将其分组移入毛细管饲喂小瓶中。插入果蝇时，先用软塞暂时封住毛细管饲喂小瓶，待所有果蝇插入后，迅速替换为预先制备好的毛细管饲喂塞。将每个实验组的6–8只果蝇分至一个小瓶中，每种实验条件至少制备8个小瓶。
   2. 通过向插塞顶部轻轻加入 5 mL 水来润湿插塞。加水时需小心，避免水溢出至小瓶中。每个小瓶中加入等量的水。
      注意：此步骤旨在减少毛细管中的蒸发，因此在实验剩余时间内需每天重复一次。根据相对湿度的不同，后续几天可能需要向塞子中添加较少的水量。
   3. 通过向储备食物分装液中分别加入乙醇或水，制备两种独立的食物溶液，使最终浓度为15%。
   4. 为了将毛细管充满两种食物溶液，制备5 µL 液体食物滴加到实验室试纸条上，使溶液充满毛细管，直至达到5 µL 标记。务必使用毛细管靠近5的透明端 µL 黑色标记线
      注意：为同时填充多个毛细管，可将6至8个毛细管接头连接在一起，并将其用作插入装置以固定毛细管。
   5. 轻轻敲击毛细管，使其在石蜡条上定位，确保食物溶液液面恰好对准黑线标记。将每根毛细管末端浸入少量矿物油液滴中，以密封毛细管。此步骤可最大限度减少食物溶液的潜在蒸发。
   6. 将两根含乙醇的毛细管和两根不含乙醇的毛细管分别插入塞子的4个适配器/支架中，直至毛细管暴露端刚刚露出瓶内侧（距塞子表面1 mm或更短）。
      注意：将毛细管的开口端靠近湿润的塞子可减少蒸发，并便于果蝇取食，因为果蝇通常停在塞子上，并沿暴露的毛细管向下爬行以进食。
   7. 除了装有实验果蝇的管子外，还需准备一个不含果蝇的模拟管。该对照用于评估自然蒸发情况。
      注意：尽量保持毛细管开口相对于塞子的位置相对一致，位置差异可能导致蒸发量不同，从而产生误导性的消耗数据。实验过程中应维持足够的湿度，并将毛细管开口尽可能靠近湿润塞，因为低湿度以及与湿润塞距离过大会导致不受控的蒸发。
   8. 使用直尺测量每根毛细管中液面相对于黑线标记的位置（mm），并记录这些数值。
      注意：若液面恰好位于黑线处，读数应为零；若液面在黑线上方或下方，则读数分别为正值或负值。液体的初始液面位置用于设定最终过夜消耗量（O/N consumption）的参考点。
   9. 将离心管放回培养箱中孵育24小时。在整个实验过程中，于固定时间更换毛细管。
   10. 从样品瓶中轻轻取出毛细管，并测量液体相对于黑色标记线的液面高度。
   11. 仔细检查模拟小瓶中的液位。
       注意：如果液面下降超过 2 mm，则表明蒸发量较大，消耗量数据不可靠。
   12. 用2 mL水轻轻润湿塞子，并按照步骤2.3.3 - 2.3.10中的说明插入一组新的毛细管。将小瓶放回培养箱中孵育24小时。
4. 确定偏好
   1. 通过从初始液面高度减去结束时的液面高度，计算每根毛细管的总消耗量。
   2. 将相同食物的两根毛细管的数值合并即 不含乙醇的毛细管应与含乙醇的毛细管分开存放。
   3. 通过从含乙醇毛细管的消耗量中减去不含乙醇毛细管的消耗量，再除以同一试剂瓶中所有毛细管的总消耗量，计算乙醇偏好值。
   4. 计算同一实验组所有小瓶的偏好指数的平均值。
      
      注意：非乙醇1（NE1）、非乙醇2（NE2）、乙醇1（E1）、乙醇2（E2）、总非乙醇量（Total NE）= NE1 + NE2、总乙醇量（Total E）= E1 + E2、总消耗量（Total Sum）= Total NE + Total E，以及乙醇偏好指数（PI）

结果

此前，Devineni 等 结果显示，当果蝇被给予选择摄取含乙醇食物的机会时，它们表现出对含乙醇食物的强烈偏好，而非不含乙醇的食物⁶图中展示的是我们在检测未经训练方案处理的雄性果蝇对乙醇的先天偏好时获得的一些代表性结果。

收集刚羽化的 Canton S 品系雄性果蝇，饲养至 4 日龄，检测其在 4 天内对乙醇的天然摄食偏好（图 2）。通过分析果蝇对含乙醇和不含乙醇溶液的摄食量发现，果蝇对 15% 乙醇食物的摄食偏好显著高于不含乙醇的食物（图 2）。

通过对比不同的交配经历，我们此前已证明，允许多只雄蝇群体交配（“已交配-群体”）的雄蝇对乙醇的偏好低于被已交配雌蝇拒绝的单只饲养雄蝇（“被拒绝-孤立”）。我们采用了多种对照实验，将...

讨论

本文基于 Devineni 等⁶ 以及 Shohat-Ophir 等⁵ 之前描述的研究，详细阐述了一种综合方法，用于检测奖赏寻求行为的变化。本实验方案的第一部分采用不同类型的性互动作为经验输入，第二部分则使用双选择摄食实验来评估该经验对乙醇摄取偏好的影响。

如 Devineni 等人et al.⁶ 所示，果蝇对乙醇的自我摄入是一种稳定的行为，其特征最初表现为较低且多变的偏好，随后偏好逐渐增强并趋于一致。这种逐渐发展的偏好可能反映了一个学习过程，即果蝇学会将乙醇的药理作用与其所在位置相关联，尽管乙醇具有令人不悦的味道⁶，并且在初次接触乙醇蒸气时已知会引发厌恶反应¹¹。若每天改变含有乙醇的毛细管的位置，则果蝇的偏好水平将保持恒定，这有力地证明了学习在其中所起的作用，并提示果蝇可能在偏好的毛细管附近留下了化学线索¹²。此外，不同实验之间偏好曲线的形状、斜率和起始点可能略有差异，但经历奖赏性与非奖赏性体验的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚苯乙烯 25 x 95 mm 样品瓶	FlyStuff	32-109
窄口塑料样品瓶塞	FlyStuff	42-102
一次性无菌针头 18 G 和 27 G	可从任意公司采购		1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm 硼硅酸盐玻璃一次性培养管	kimble chase	73500-1075
5 μL 刻度移液管	VWR	53432-706	白色编码，容量为 5 μL
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904
蔗糖，分子生物学级	CALBIOCHEM	573113
微生物学用酵母提取物粉末	可从任意公司采购
乙醇	Sigma-Aldrich	32221
标准移液器吸头（微量移液器）	ThermScientific	T114R-Q	体积：0.1 - 20 μL（超微量）
IDENTI-PLUGS（泡沫管塞）	Jaece	L800-A	适用于 6 - 13 mm 开口
IDENTI-PLUGS（泡沫管塞）	Jaece	L800-D	适用于 35 - 45 mm 开口
virginator 果蝇品系	bloomington 果蝇品系中心	#24638
窄口样品瓶，托盘包装（PS）	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
果蝇培养基配方与方法	Bloomington 果蝇品系中心	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
丙酸	Sigma-Aldrich	P5561
磷酸	Sigma-Aldrich	W290017
对羟基苯甲酸甲酯	Sigma-Aldrich	H3647
琼脂	可从任意公司采购
玉米粉	可从任意公司采购
Grandma's 糖蜜	B&G Foods, Inc	未标明
速溶干酵母	可从任意公司采购