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一种优化的分析淋巴细胞糖酵解和线粒体呼吸的实验方案

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DOI：

10.3791/54918

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2016年11月21日

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1Laboratory of Mitochondrial Biology and Metabolism, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

代谢研究在免疫学领域中的重要性日益凸显。本文介绍了一种优化的方法，用于检测小鼠脾细胞以及T和B淋巴细胞的糖酵解和线粒体呼吸作用。

摘要

淋巴细胞通过激活细胞内信号通路，对多种刺激产生应答，进而引发快速的细胞增殖、迁移与分化以及细胞因子的产生。所有这些事件均与细胞的能量状态密切相关，因此研究能量生成通路可能为了解这些细胞的整体功能提供线索。细胞外通量分析仪是一种常用于评估多种细胞糖酵解和线粒体呼吸功能的设备。尽管已有少数发表的研究使用该系统分析免疫细胞，但目前尚缺乏专门针对淋巴细胞优化的全面实验方案。淋巴细胞是较为脆弱的细胞，在体外（ex vivo）条件下存活能力较差。此外，淋巴细胞亚群通常数量稀少，不可避免地需要在低细胞数量条件下进行操作。因此，亟需一种能够应对这些困难的实验策略。本文提供了一种可快速从淋巴组织中分离出活淋巴细胞，并利用细胞外通量分析仪检测其代谢状态的实验方案。此外，我们还展示了在不同细胞密度下比较多种淋巴细胞亚型代谢活性的实验结果。这些结果表明，即使在低细胞浓度下，本方案仍可获得一致且高度标准化的结果，因此在今后聚焦于免疫细胞代谢事件表征的研究中具有广泛的应用前景。

引言

针对抗原的免疫反应是免疫激活与免疫抑制之间的一种严格调控的平衡。免疫激活可促进细胞快速增殖和迁移，以及在刺激物作用下产生细胞因子、分泌抗体和增强吞噬作用；而免疫抑制则简单地抑制这些事件，因此在防止不必要的免疫反应中具有重要作用1-6。近期研究表明，免疫细胞的活化状态与多种代谢通路的活性之间存在直接关联7。免疫细胞可通过开启或关闭能量生成通路，在静息状态与活化状态之间转换。此外，已有观察发现，不同类型的免疫细胞在活化期间可能采用不同的代谢策略以满足其增加的能量需求。例如，T淋巴细胞的活化会使细胞几乎完全进入糖酵解状态8，而活化的B淋巴细胞则同时依赖糖酵解与氧化磷酸化的平衡9,10。这些研究凸显了探讨免疫细胞活化对细胞代谢影响的重要性。

实时同步测量氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），作为氧化磷酸化和糖酵解的指标，是研究能量生成通路状态的常用策略11-13。为实现这一目标，通常使用细胞外通量分析仪，例如 Seahorse XF 96。此类仪器能够快速比较不同细胞类型或在不同刺激条件下OCR和ECAR的变化。迄今为止，已有多种细胞类型（包括免疫细胞）通过这些设备进行了研究。然而，目前尚无专为免疫细胞优化设计的实验方案。

免疫细胞，尤其是淋巴细胞，在多个关键方面与其他细胞类型不同。淋巴细胞是脆弱的细胞，在离体（ex vivo）条件下存活时间较短14-16。当使用缺乏必需营养成分的非最佳培养基（如细胞外通量分析中所用的培养基）进行培养时，这一问题尤为突出。与巨噬细胞和许多细胞系不同，淋巴细胞不会贴附于塑料表面；因此，在不产生应激的情况下将其固定在分析板上至关重要。最后，某些淋巴细胞亚群可能极为稀少，获取达到所需最佳数量的细胞可能具有挑战性17-19。

本文提供了一种专为淋巴细胞优化的实验方案。利用从小鼠脾脏和淋巴结中分离得到的脾细胞、B 淋巴细胞以及初始型 CD4+ T 淋巴细胞20，我们展示了这些细胞在不同细胞密度下静息状态的糖酵解和氧化磷酸化特征。实验数据通过测定终末检测时细胞裂解液的蛋白浓度进行归一化处理，以校正各孔初始细胞数量的差异，该蛋白浓度与细胞数量成正比。本方案不仅为活性淋巴细胞的快速分离以用于细胞外通量检测提供了操作指南，还可实现在非最佳细胞浓度条件下操作，同时不损害数据质量。

方案

所有动物实验均按照LIG-4动物实验方案进行，并已获得美国国家过敏与传染病研究所动物护理与使用委员会的批准。

1. 试剂的准备

  1. 配制磁分离（MS）缓冲液：在 PBS（pH 7.2）中添加 0.5% BSA 和 2 mM EDTA，或在自动分离溶液中添加 0.5% BSA。经无菌过滤（0.22 µm）后，于 2–8 °C 保存。
  2. 配制 RF10 培养基：RPMI 1640 培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清、50 U/ml 青霉素、50 µM 链霉素、1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM 非必需氨基酸、50 µM 2-巯基乙醇和 10 mM HEPES。使用无菌试剂。经无菌过滤后，于 2–8 °C 保存。
  3. 配制线粒体应激测试培养基：XF 基础培养基中添加 1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺和 25 mM 葡萄糖。
  4. 配制糖酵解应激测试培养基：XF 基础培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺。
  5. 将线粒体应激测试培养基和糖酵解应激测试培养基的 pH 值调节至 7.4，经无菌过滤后于 2–8 °C 保存。使用前将培养基预热至 37 °C 并重新调节 pH 值（在 37 °C 下进行 pH 测量）。
    注意：使用不含碳酸氢盐的 XF 培养基至关重要。由于细胞外通量分析仪内的气氛仅含有环境水平的 CO2，若培养基中含有碳酸氢盐，其会与糖酵解过程中释放的质子结合，并解离生成 CO2 和水。实验过程中 CO2 会脱气，导致 pH 漂移，从而掩盖糖酵解酸化信号。
  6. 配制寡霉素：用 DMSO 配制 10 mM 储存液；于 -20 °C 保存。
  7. 配制 2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP）：用 DMSO 配制 1 M 储存液；于 -20 °C 保存。
  8. 配制抗霉素 A：用 DMSO 配制 10 mM 储存液；于 -20 °C 保存。
  9. 配制鱼藤酮：用 DMSO 配制 10 mM 储存液；于 -20 °C 保存。
  10. 配制葡萄糖：将葡萄糖溶解于糖酵解应激测试培养基中，配制成 250 mM 溶液；每次实验前新鲜配制，不可冷冻。
  11. 配制 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）：将固体 2-DG 溶解于糖酵解应激测试培养基中，配制成 500 mM 溶液；每次实验前新鲜配制，不可冷冻。

2. 小鼠脾脏和淋巴结的采集

  1. 采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
  2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表。
  3. 如需后续分离 T 细胞，采集脾脏、浅表颈淋巴结、浅/深腋窝淋巴结、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结及肠系膜淋巴结。
  4. 如需后续分离 B 细胞，仅采集脾脏。
    注意：所有操作应在生物安全柜中进行，采集的器官应置于冰上含 PBS 或 RF10 培养基的容器中，直至处理。所有处理和分离步骤均需使用无菌实验器材并遵循无菌操作技术。所有缓冲液和培养基均应置于冰上，以提高细胞分离效率并减少细胞死亡。

3. 组织处理

  1. 将70 µm细胞筛置于50 ml锥形管上，并将器官转移至筛网上。如需分离T细胞，合并所有器官；如需分离B细胞，则仅转移脾脏。
  2. 使用无菌3 ml注射器的推杆将组织研磨通过细胞筛。研磨过程中，确保滤膜和器官始终湿润，必要时添加MS缓冲液以保持湿润。这有助于维持较高的细胞活力，并防止滤膜堵塞。
  3. 研磨完成后，在滤膜上加入5–10 ml MS缓冲液以提高细胞回收率。将悬液在4 °C下以400 × g离心5分钟。（除非另有说明，后续所有离心步骤均采用此条件）。
  4. 倾去上清液，将沉淀重悬于5 ml ACK红细胞裂解缓冲液中。冰上孵育5分钟以裂解红细胞（需去除红细胞，因其会干扰磁性分离）。加入10–20 ml MS缓冲液后再次离心。
  5. 将30 µm细胞滤膜置于15 ml锥形管上，并用1 ml MS缓冲液预润洗（此步骤可去除红细胞裂解后的碎片）。将离心后的上清液弃去，将沉淀重悬于5 ml MS缓冲液中，然后通过滤膜。用4 ml MS缓冲液冲洗初始离心管，将冲洗液用于淋洗滤膜，以提高细胞回收率。
  6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞总数。该细胞数量将用于确定第4节中磁性分离试剂的使用量。若脾细胞将用于后续的细胞外通量分析，请在此时保留所需数量的细胞。
  7. 将细胞悬液离心，随后进行磁性分离。将未用于B细胞分离的脾细胞重悬于5 ml RF10培养基中，置于冰上保存，直至进行细胞外通量分析。

4. B细胞和初始CD4+ T细胞的磁珠分离

  1. 确定生物素化抗体混合液、抗生物素磁珠和MS缓冲液所需的体积。以下体积以108 个细胞为参考，可根据需要按比例放大或缩小。
    注意：应将样品在冰箱中孵育，而非置于冰上，因为在冰上孵育可能会降低抗体结合效率，并可能需要更长的孵育时间。
初始CD4+ T细胞分离试剂每108个细胞所需体积
 （按比例调整）
生物素标记抗体混合液100 μl
第一次孵育用MS缓冲液400 μl
抗生物素磁珠200 μl
CD44磁珠100 μl
第二次孵育用MS缓冲液200 μl
将生物素标记抗体混合液与细胞在4 °C孵育5分钟。加入抗生物素磁珠、CD44磁珠和MS缓冲液，于4 °C继续孵育15分钟。

表1：T细胞分离体积及操作说明。

B细胞分离试剂每108个细胞所需体积 
（按比例调整）
生物素标记抗体混合液100 μl
第一次孵育用MS缓冲液400 μl
抗生物素磁珠200 μl
第二次孵育用MS缓冲液300 μl
将生物素标记抗体混合液与细胞在4 °C孵育15分钟。加入适量的生物素标记抗体混合液和MS缓冲液，在4 °C孵育15分钟。再加入适量的抗生物素磁珠和MS缓冲液，于4 °C孵育15分钟。第二次孵育结束后，用MS缓冲液补满离心管并进行离心。

表2：B细胞分离的体积与操作说明。

  1. 将沉淀重悬于MS缓冲液中：手动分离时使用500 µl，自动分离时使用3–4 ml。
  2. 继续进行手动或自动分离，步骤如下：
    1. 手动分离：
      1. 将LS柱插入分离磁铁中，在下方放置一个无菌15 ml锥形管以收集流出液，用3 ml MS缓冲液冲洗柱子进行预处理。弃去流出液。
      2. 将细胞悬液转移至预处理的LS柱中，使其流穿；用3 ml MS缓冲液洗涤孵育过程中使用的离心管，并将洗涤液也过柱。流出液即为纯化的细胞。对于B细胞分离，将纯化的细胞再次过柱，收集至新的15 ml离心管中，并重复洗涤步骤。此操作可提高纯度和得率。
    2. 自动分离：
      1. 打开自动分离仪，检查运行缓冲液、冲洗液和70%乙醇的液位。分离开始前，确保废液容器已清空。
      2. 根据未纯化样品的离心管尺寸选择合适的预冷管架（例如，15 ml）。为确保细胞在分离过程中保持活性，使用已在2-8 °C预冷3-4小时或直至冷却剂凝固的试管架。
      3. 将冷却的支架安装到自动分离仪的样品台上。
      4. 将样本管置于 A1 孔位，阴性组分管置于 B1 孔位，阳性组分管置于 C1 孔位。若需收集多个样本，将额外的管子依次放入后续列的对应孔位（A2、B2、C2， 等等。).
      5. 在触摸屏上选择分离选项卡，并指定试管在架上的排列方式。从分离菜单中选择 "耗竭" 程序，并使用适当类型的洗涤完成程序循环（见下文注释）。
        注意： "耗竭" 程序将采用设备最敏感的模式进行耗竭，该模式优先保证纯度。此外，提供三种不同的洗涤选项：快速冲洗、冲洗和休眠。如果样本来源于同一来源且需要合并，请选择快速冲洗；如果样本需要保持分离，请选择冲洗；如果当天不再进行后续分离操作且分离后将关闭设备，请选择休眠选项。
      6. 开始分离操作，按压 "运行，" 并在提示时确认缓冲液液位。程序结束后，负相组分将含有纯化的细胞。
    3. 用MS缓冲液将锥形管补至15 ml，然后离心。
    4. 弃去MS缓冲液，将细胞重悬于5 ml RF10培养基中。在进行细胞外通量分析前，将细胞置于冰上保存。
      注意：理想情况下，细胞外通量检测应在细胞分离后立即进行。然而，在初步实验中，分离后3小时内使用的细胞与 freshly-isolated 细胞在检测结果上未观察到显著差异。

5. 细胞外通量检测

注意：此处所述方案适用于该仪器的96孔板规格。若使用其他规格，需调整体积。

  1. 传感器盒的水合处理
    1. 抬起传感器盒，向校准板的每个孔中加入 200 µl 校准液，然后将传感器盒放回校准板上，使传感器浸入校准液中。
      注意：请确认校准液液面足够高，以确保传感器始终浸没。试剂盒中含有与O相关的荧光染料2 和 H+ 每个孔都需要加样；这些样品必须经过水合才能正常发挥作用。
    2. 将 cartridge 置于 37 °C 培养箱中孵育，无需添加 CO2 或氧气/氮气环境中进行。除非另有说明，后续所有孵育步骤均需在此条件下进行。将 cartridge 孵育过夜以充分水化。
  2. 黏附剂包被板的制备
    1. 在0.1 M、pH 8.0的碳酸氢钠溶液中配制2.5 ml浓度为22.4 µg/ml的黏合剂溶液（碳酸氢钠可提供黏合剂吸附的最佳pH条件）。
    2. 向检测板的每个孔中加入25 µl溶液，在室温下于实验台上孵育20分钟。
    3. 吸去粘附剂，每孔用 200 µl 无菌水洗涤两次。待孔板干燥后，再接种细胞。
  3. 在黏附涂层培养板中接种细胞
    1. 在室温下以200 × g离心细胞5分钟。将细胞重悬于5 ml相应的检测培养基中（线粒体应激和葡萄糖应激培养基的配制方法见上文）。再次离心细胞，并以所需浓度将细胞重悬于检测培养基中（重悬体积根据浓度而定；每孔将含有180 µl细胞悬液）。
      注意：只要使用适当的检测培养基和化合物，细胞外通量分析仪便可在同一块培养板上同时进行线粒体和糖酵解压力测试。
    2. 每孔加入 180 µl 细胞悬液。使用 A1、A12、H1 和 H12 孔进行背景温度校正：在这些孔中加入 180 µl 检测培养基（不加细胞）。
    3. 37 °C 下孵育平板 25 分钟。
    4. 以200 × g离心5分钟，不启用刹车，以确保所有细胞完全贴壁。在显微镜下观察，确认细胞已稳定黏附于培养表面并形成单层。将培养板放回培养箱中继续孵育30分钟。
  4. 化合物10倍浓度溶液的制备及进样针端口加载
    1. 线粒体应激测试中，分别准备2.5 ml的10 µM 寡霉素、1 mM DNP，以及含10 µM 鱼藤酮和10 µM 抗霉素A的混合液，均用线粒体应激检测试剂基质配制。
      注意：2,4-DNP 的浓度基于先前已发表的研究；21 这是一个通用指南，但研究人员应确定所用每种细胞类型的解偶联剂浓度。
    2. 对于糖酵解应激测试，分别在糖酵解应激检测试剂中配制 2.5 ml 的 250 mM 葡萄糖、10 µM 寡霉素和 500 mM 2-脱氧葡萄糖（2-DG）。
    3. 将10倍浓度溶液预热至37 °C，并调节pH至7.4。
    4. 使用多通道微量移液器和加载引导装置，按照以下步骤将化合物加入到卡盒的相应进样孔中：
      端口线粒体应激检测糖酵解应激检测
      A20 µl 寡霉素20 µl 葡萄糖
      B22 µl 2,4-二硝基苯肼22 µl 寡霉素
      C25 µl 抗霉素A/鱼藤酮25 µl 2-DG
      表3：化合物体积

      注意：每组端口（例如所有A端口必须含有相同体积。必须加载系列中的所有孔，即使实验中未使用某些孔也需如此，否则化合物将无法被注入（未使用孔的端口可加入相同体积的检测培养基）。
    5. 孵育样本盒的同时设置程序。
  5. 建立细胞外通量测定实验方案
    1. 设置以下程序（表4).
      步骤环
      校准––
      平衡––
      基线读数3 次：混合 3 分钟，等待 0 分钟，测定 3 分钟
      结束循环––
      注射端口A––
      测量3 次：混合 3 分钟，等待 0 分钟，测定 3 分钟
      结束循环––
      注射端口B––
      测量3 次：混匀 3 分钟，等待 0 分钟，测定 3 分钟
      末端环––
      注射端口 C––
      测量3 次：混合 3 分钟，等待 0 分钟，测定 3 分钟
      结束循环––
      结束程序––
      表4：程序布局。
      注意：在特定条件下， 例如，当使用活化细胞时，酸化过程可能比初始细胞持续更长时间。因此，可能需要延长 "等待" 在上述程序中增加次数或重复每个测量循环更多次。
    2. 启动程序。校准步骤完成后，根据提示将校准板更换为检测板。
      注意：使用该软件时，可以标记具有相似条件的孔组。此外，必须标明哪些孔为对照孔（在本方案中，对照孔位于板的四个角），并标明哪些孔为空孔。有关仪器及其软件设置的更详细、逐步的操作方案，应参考制造商的网站。
  6. 测定蛋白质含量
    1. 轻轻移除每孔中剩余的检测培养基，避免扰动细胞。
      注意：如果无法立即进行蛋白质浓度测定，可将整块板在 -20 °C 冻存至分析前。若已冻存，需先解冻再继续操作。
    2. 在RIPA裂解液中配制蛋白酶抑制剂的1x溶液（100x母液），每孔使用50 µl。
    3. 每孔加入50 µl含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。在摇床上振荡5分钟，然后将培养板置于冰上孵育30分钟，以充分裂解细胞。
    4. 在室温下以200 × g离心5分钟，使脂质和其他分子沉降至板底，避免干扰二辛可宁酸（BCA）测定。
    5. 根据制造商的建议，通过BCA法测定蛋白质浓度。

结果

真核细胞利用糖酵解、三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化构成的整合网络来满足其大部分能量需求，并为细胞生长和增殖提供所需的中间代谢物。这些代谢通路始于游离葡萄糖以葡萄糖-6-磷酸的形式在细胞内被捕获，随后被进一步加工生成丙酮酸。丙酮酸可被还原为乳酸，或被转运至线粒体中生成乙酰辅酶A（CoA）。乙酰CoA随后进入TCA循环。TCA循环中的高能中间产物推动电子传递链（ETC）中电子的传递，进而将H+从线粒体基质排出，在线粒体内膜两侧形成H+梯度。氧气作为最终的电子受体，H+通过FO/F1复合体回流至线粒体基质，其间释放的势能用于合成ATP（图1A）。

细胞外通量分析的工作原理依赖于在特定节点干扰糖酵解和氧化磷酸化，并评估由此产生的效应。为此，我们使用葡萄糖促进饥饿细胞中的糖酵解，以及使用2-脱氧葡萄糖（2-DG）；2-DG可转化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，后者是磷酸葡萄糖异构酶的竞争性抑制剂。23，通过己糖激酶作用以阻断糖酵解。鱼藤酮（电子传递链复合体I特异性抑制剂）、抗霉素A（电子传递链复合体III特异性抑制剂）、寡霉素（ATP合酶抑制剂）24），以及解偶联剂 2,4-二硝基苯酚（DNP）25 用于干预与电子传递、质子梯度及ATP合成相关的特定事件（图1A）。除了2,4-DNP外，也可使用羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），但可能需要进一步优化。无论使用哪种解偶联剂，都必须在使用前针对特定细胞类型进行滴定，以确定所需的最适浓度。

糖酵解应激测试（图1B）首先测量先前经过饥饿处理的细胞的细胞外酸化率（ECAR）作为基础值。由于这些细胞处于其基础最低状态，实际上可被视为非糖酵解状态，因此此时测得的ECAR被称为非糖酵解性酸化。这种酸化可能对应于三羧酸（TCA）循环中产生的呼吸性CO2转化为HCO3-和H+的过程。随后注入葡萄糖以激活糖酵解，导致乳酸生成而引起细胞外酸化的增加，该增加代表正常的糖酵解速率。接着向细胞注入寡霉素（oligomycin），以阻断通过氧化磷酸化生成ATP的过程。细胞对此ATP生成急剧减少的反应是将糖酵解激活至最大水平，从而导致ECAR水平的二次升高（即糖酵解储备）。测试最后通过使用葡萄糖类似物2-DG完全抑制糖酵解，使ECAR恢复至非糖酵解水平而终止。有趣的是，已有研究提出，与制造商的建议相反，注射寡霉素并不一定能够达到最大糖酵解水平26。在糖酵解能力较高的细胞中，如果ATP需求没有显著增加，糖酵解可能完全能够应对线粒体ATP的损失，而无需上调。通过添加呼吸链抑制剂（如鱼藤酮和黏噻唑）可超越寡霉素诱导的糖酵解速率，这些抑制剂相比寡霉素具有若干优势：1）它们增加ATP需求，因其导致ATP合酶逆转，通过水解ATP泵出质子以试图恢复线粒体膜电位26；2）它们可防止呼吸作用引起的培养基酸化，从而避免对ECAR结果造成干扰（见下文）。其他增加ATP需求的方法还包括添加可刺激细胞膜ATP酶水解ATP的化合物26。研究人员在设计糖酵解应激测试时应仔细考虑上述所有因素。

线粒体应激测试（图 1C）首先测量非饥饿状态下细胞的氧消耗率（OCR）作为基线。随后加入寡霉素（oligomycin），其可抑制质子通过FO/F1复合体回流，从而迅速使线粒体膜超极化。膜超极化会阻止呼吸链复合体进一步泵送质子，导致呼吸速率下降。此时残余的呼吸作用称为质子漏（proton leak），代表质子通过脂质或其他通道的流动。该超极化状态可通过加入解偶联剂2,4-DNP迅速逆转，后者作为质子离子载体发挥作用。细胞为恢复膜电位会通过增加电子传递速率达到最大水平进行无效尝试，从而导致OCR升高。最后，加入两种电子传递链抑制剂（抗霉素A和鱼藤酮）后，线粒体呼吸完全停止，OCR降至最低水平。在此状态下，氧消耗不再源于线粒体活性（即非线粒体性氧消耗）。由这些抑制剂引起的OCR差值称为最大线粒体呼吸能力，其等于基础呼吸与备用呼吸能力之和。

B 细胞和 T 细胞分离可获得高活力的高纯度淋巴细胞群体。

B细胞和初始CD4+ T细胞的分离方法如方案第4节所述，脾细胞则通过第3.3节所述的红细胞裂解法直接获得。

细胞类型特异性代谢检测的灵敏度取决于起始细胞群体的活力和纯度。因此，为了验证分离的小鼠T细胞、脾细胞和B细胞的活力以及T细胞和B细胞的纯度，取少量细胞进行染色并用于流式细胞术分析（图2）。在前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）图中圈定淋巴细胞门，在此门内，根据前向散射高度（FSC-H）与FSC-A图中沿对角线分布的细胞群确定单细胞。在单细胞群体中，通过圈选对活/死标记物染色阴性的细胞来评估细胞活力（图2A）；T细胞活力为97.9%，脾细胞活力为92%，B细胞活力为94%。B细胞纯度通过B220+ CD19+细胞群26测定，为99%；CD4+ T细胞纯度通过CD44- CD4+细胞群27测定，为98.3%（图2B）。

细胞裂解液的蛋白浓度可用作检测铺板细胞数量的直接指标。

分离的淋巴细胞和脾细胞以每孔 5 × 10⁵ 个的密度接种于经包被的 96 孔检测板中5 细胞/孔，2.5 × 105 细胞/孔，1.25 × 105 细胞/孔，以及 0.625 × 105 细胞/孔。在光学显微镜下观察三种细胞在每种接种密度下的汇合度（图3A）。如预期所示，汇合度与初始接种密度呈正相关。在完成细胞外通量检测后，将培养板上的细胞裂解，并使用BCA法测定其蛋白浓度。对于所有细胞类型，裂解液中的蛋白浓度均显示出与初始接种 density 呈线性相关。图3B），这证实了在解读细胞外通量数据时，裂解液蛋白浓度可作为细胞数量归一化的准确指标。本实验所用的铺板密度已针对未受刺激的初始淋巴细胞进行了优化。若使用经刺激或先前培养过的细胞，则可能需要进一步优化。

线粒体和糖酵解应激实验的结果取决于接种的细胞数量。

使用细胞外通量分析仪测定每种细胞类型和铺板密度的OCR。正如预期，细胞数量越多，测得的OCR越高，且对寡霉素、2,4-二硝基苯酚以及抗霉素A/鱼藤酮的反应也更为显著。图 4A）。将每个样品的氧消耗率（OCR）测量值标准化为其蛋白质浓度后显示，通常情况下，细胞数量越多，OCR测量结果越准确。接种密度为5 × 10⁵和2.5 × 10⁵时5 细胞/孔在T细胞和脾细胞中产生了相似的归一化耗氧率（OCR）测量值，且分别为5和1.25 × 105 每孔细胞数得到B细胞中相似的标准化耗氧率（OCR）测量值图 4B）。标准化B细胞OCR测量值的微小差异可能间接表明，B细胞在2.5 x 105 细胞/孔，与其他细胞密度相比。在所有检测指标中，0.625 x 105 每孔细胞数过少导致结果不理想，表明该接种密度不足。对于所有细胞类型，基础呼吸、质子漏、线粒体最大呼吸、非线粒体呼吸和ATP生成均与接种密度呈线性相关。图4C）。此外，大部分基础呼吸作用被用于合成ATP，这由三种细胞类型中较低的质子漏现象得以证实。尽管线粒体应激实验的主要目的是测量OCR的变化，但仍有必要记录ECAR，以确保实验成功实施。与OCR相似，两种较高的铺板密度均导致更高的ECAR，以及对寡霉素、2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP）和抗霉素A/鱼藤酮更显著的反应。图 4D). 添加2,4-DNP以及抗霉素A/鱼藤酮后ECAR的显著变化可能不仅源于糖酵解的改变，还可能与呼吸作用的变化有关，因为CO₂2 在三羧酸循环中生成的转化为HCO3 - 和 H+这一问题 recently 得到解决，目前已有一种简单方法，可利用氧气消耗数据校正总的细胞外酸化信号，从而获得真实的糖酵解速率12,29.

糖酵解应激实验在最高接种密度下效果最佳（图 5A、B）。在所有细胞类型中，5 × 105 个细胞/孔的样本在加入葡萄糖、寡霉素和 2-DG 后，ECAR 的变化最为显著（图 5B）。此外，以蛋白浓度归一化后显示，对于所有细胞类型，5 × 105 个细胞/孔的样本均获得最优结果，而较低浓度——尤其是 0.625 × 105 个细胞/孔——则未表现出明显的糖酵解储备能力。非糖酵解性酸化、糖酵解和表观糖酵解能力在所有细胞类型中均与接种密度呈线性相关（图 5C）。在糖酵解应激实验中，OCR 曲线显示葡萄糖轻微促进线粒体呼吸，随后被寡霉素抑制；加入 2-DG 对 OCR 无明显影响（图 5D）。OCR 曲线可作为糖酵解应激实验成功实施的进一步验证指标。此外，若需要，也可如上文线粒体应激实验所述，利用 OCR 曲线对 ECAR 曲线进行校正12,29。

糖酵解和氧化磷酸化示意图，附细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）代谢分析图。
图 1： 细胞外通量检测示意图。（A）糖酵解（左）和氧化磷酸化（右）示意图，显示细胞外通量检测中所用代谢药物的作用位点。（B）细胞外酸化率（ECAR）图解；氧消耗率（OCR）图解（C）。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术分析示意图；T细胞、脾细胞、B细胞；活死细胞门控；FSC，SSC。
图2： 通过逐步门控分析T细胞、B细胞和脾细胞以确定其活力与纯度。 流式细胞术图显示T细胞、脾细胞和B细胞的活力（A）以及T细胞和B细胞的纯度（B）。结果代表至少三次独立实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

T细胞、B细胞、脾细胞的细胞密度显微图像；蛋白水平图表；实验；相关性分析。
图3： 不同接种密度下，各细胞类型的汇合度与其裂解液蛋白浓度呈相关性。（A）接种密度为 5 × 105 个细胞/孔 至 0.625 × 105 个细胞/孔 时，检测板孔中细胞的明场显微图像。比例尺为 50 µm。（B）通过BCA法测定的不同接种密度下的裂解液蛋白浓度。结果代表至少三次独立实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

T细胞、脾细胞、B细胞OCR/ECAR图。基础值、质子泄漏、ATP生成分析。
图4： 线粒体应激检测。 显示了每种细胞类型和铺板密度的原始（A）和标准化（B）耗氧率（OCR）。(C) 显示了不同细胞类型在细胞数量依赖性条件下，基础呼吸、最大线粒体呼吸和非线粒体呼吸水平的变化，以及与质子泄漏或ATP生成相关的氧气消耗。(D) 显示了线粒体应激实验中获得的原始细胞外酸化率（ECAR）值。每个数据点代表7-8个复孔的平均值±标准差。标注的箭头表示依次加入的寡霉素（O）、2,4-二硝基苯酚（D）和鱼藤酮/抗霉素A（R/A）。结果至少代表了三次独立实验。请点击此处查看该图的放大版本。

T细胞、脾细胞、B细胞糖酵解图谱；ECAR、OCR随时间变化；糖酵解能力分析。
图5： 糖酵解应激实验。 显示了每种细胞类型和铺板密度的原始（A）和标准化（B）ECAR。(C) 显示非糖酵解性酸化、葡萄糖诱导的糖酵解及总糖酵解能力随细胞数量变化的情况。( D) 显示糖酵解应激实验中获得的原始OCR值。每个数据点代表7-8个孔的平均值及标准差。标注的箭头表示葡萄糖（G）、寡霉素（O）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）的注射。结果至少代表三次独立实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们开发的实验方案能够高效地分离出高纯度且具有活性的淋巴细胞亚群，并将其用于不同浓度下的胞外通量分析，以评估糖酵解和线粒体呼吸功能的差异。该方案专为淋巴细胞设计，针对此类细胞的特殊性质进行了优化，例如基础代谢活性低、细胞脆弱、频率较低以及无法贴附于检测板等特性。因此，与先前发表的方案11,12相比，本方法为免疫学领域的研究人员提供了更为便捷且优化程度更高的操作指南。本方案中的几个关键步骤包括：获得高纯度且具活性的细胞群体、以最佳密度接种细胞，以及根据每孔中的蛋白质浓度对胞外通量检测结果进行标准化校正。

通过光学显微镜可观察接种的初始细胞数量，也可通过蛋白质浓度测定进行定量。细胞数量与蛋白质浓度之间的线性相关性表明，蛋白质浓度确实可用于标准化不同孔之间细胞数量变化所带来的影响。

通过将ECAR和OCR结果标准化为蛋白浓度，我们证明了尽管细胞汇合度较低，大多数实验中每孔仅使用低至2.5 × 105个细胞仍可在不损害数据质量的情况下进行检测。然而，可使用的细胞数量下限因细胞类型和实验类型而异。例如，在B细胞的OCR检测中，最低可使用1.25 × 105个细胞；但对于同种细胞类型的糖酵解能力评估，即使每孔2.5 × 105个细胞仍不足以获得可靠结果。因此，只要细胞数量不是限制因素，建议以超过90%的汇合度接种细胞，这大约相当于每孔5 × 105个淋巴细胞。当使用不同大小的细胞（如先前激活并部分分化的淋巴细胞）时，可能需要进一步优化实验条件。此外，在使用先前培养的原代淋巴细胞时，不同处理条件之间的细胞活力可能存在差异，这会降低蛋白浓度作为细胞数量指标的可靠性，因为死亡或濒死细胞也可能对测得的蛋白水平有所贡献。在此类情况下，在进行细胞外通量检测前，通过流式细胞术分选活细胞可能有助于提高实验准确性。

在使用新鲜分离且活力很高的淋巴细胞群体进行的实验中，我们获得了可靠的OCR和ECAR功能检测数据。在进行线粒体应激测试时，所有细胞类型的反应相似；但在糖酵解应激测试中，不同细胞类型之间表现出显著差异。例如，初始T细胞的糖酵解能力相较于脾细胞或B细胞较低，且在加入寡霉素后未发生明显变化。该结果与先前已发表的研究一致7,30，验证了本实验方案的有效性。

总之，我们的方法提供了一种利用细胞外通量分析仪检测淋巴细胞代谢活性的高效且便捷的手段，在广泛免疫学研究中具有重要应用价值，可用于探索免疫细胞在活化、细胞分化过程中或因感染、自身免疫及血液系统恶性肿瘤等疾病表型所引发的代谢变化。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。本文的开放获取费用由安捷伦科技公司提供。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所 Michael N. Sack 博士的支持与讨论，Ann Kim 女士在优化B细胞分离方案方面的帮助，Joseph Brzostowski 博士在显微镜技术方面的协助，以及 Mirna Peña 女士对实验动物的维护。本研究得到了美国国立卫生研究院院内研究项目、国家过敏与传染病研究所和国家心肺血液研究所的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBS（pH 7.2）Gibco-ThermoFisher20012-050用于配制 MACS 缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3803用于配制 MACS 缓冲液
0.5 M EDTA，pH 8Quality Biological10128-446用于配制 MACS 缓冲液
autoMACS 冲洗液Miltenyi Biotec130-091-222可替代 PBS + EDTA 配制 MS 缓冲液，也可用于 autoMACS Pro 分离仪
RPMI-1640Gibco-ThermoFisher11875-093含酚红和 L-谷氨酰胺
胎牛血清Gibco-ThermoFisher10437-028热灭活操作：将冷冻储存的血清瓶在 37 °C 水浴中解冻，随后在 56 °C 灭活 30 分钟。将灭活后的血清分装（例如，使用 50 ml 锥形管）并储存在 -20 °C，待需要时使用。 
青霉素-链霉素（Pen Strep）Gibco-ThermoFisher15140-122将 Pen Strep 与 L-Glut 按 1:1 混合（若配制 500 ml 培养基，则共需 12 ml Pen Strep/L-Glut 混合液）；分装后保存于 -20 °C，待配制培养基时使用。
L-谷氨酰胺 200 mM（L-Glut）Gibco-ThermoFisher25030-081RF10 培养基和应激测试培养基的组分
丙酮酸钠 100 mMGibco-ThermoFisher11360-070RF10 培养基和应激测试培养基的组分
HEPES 1 MGibco-ThermoFisher15630-080RF10 培养基的组分
MEM 非必需氨基酸溶液（100x）Gibco-ThermoFisher11140-050RF10 培养基的组分
2-巯基乙醇（55 mM）Gibco-ThermoFisher21985-023RF10 培养基的组分
Falcon 70 μm 细胞筛Falcon-Fischer Scientific87712用于细胞分离
Monoject 3 ml 注射器，鲁尔锁扣头Covidien8881513934用于细胞分离
Falcon 15 ml 锥形离心管 Falcon-Fischer Scientific14-959-53A用于细胞分离
Falcon 50 ml 锥形离心管 Falcon-Fischer Scientific14-432-22用于细胞分离
ACK 裂解缓冲液Lonza10-548E用于细胞分离
CellTrics 30 μm 细胞滤膜，无菌，单包装Partec CellTrics04-004-2326用于细胞分离
小鼠 B 细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-090-862用于细胞分离
小鼠初始 CD4ïve CD4+ T 细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-104-453用于细胞分离
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401用于细胞分离
MidiMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302用于分离的磁铁装置
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303磁铁支架
autoMACS 冲洗液130-091-222autoMACS Pro 分离仪的冲洗溶液
autoMACS Pro 分离仪Miltenyi BiotecN/A
2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）Sigma-AldrichD8375-5G
Cell-TakCorning354240细胞粘附剂。注意每批浓度可能不同（包装为 1 mg），需仔细核对。
寡霉素Sigma-Aldrich75351
2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP）Sigma-AldrichD198501
抗霉素 ASigma-AldrichA8674
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
Halt 蛋白酶抑制剂混合液ThermoFisher Scientific78429以 100x 混合液形式提供，与 RIPA 缓冲液混合后形成 1x 裂解液。
RIPA 缓冲液Boston BioProductsBP-115
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒ThermoFisher Scientific23225按照制造商说明书操作
Seahorse XFe96 FluxPakSeahorse Bioscience101085-004包含检测板、检测探针、用于将化合物转移至检测探针的加样导板以及校准液。
Seahorse XF 基础培养基Seahorse Bioscience102353-100用于配制应激测试培养基
Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪Seahorse Bioscience
Stericup 无菌真空过滤装置，0.22 μmEMD Millipore-Fisher ScientificSCGPU10RE用于培养基的无菌过滤
碳酸氢钠Sigma-Aldrich487031溶解至 0.1 M，用于稀释 Cell-Tak。

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