高效且位点特异的抗体标记通过张力促进的叠氮-炔烃环加成反应

摘要

本文介绍一种通过基因编码将含叠氮基团的氨基酸引入抗体片段，并利用应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）将该叠氮基团与化学探针特异性偶联，从而在特定位点引入化学探针的实验方案。

摘要

目前已有多种化学工具可用于将化学探针引入蛋白质，以研究其结构与功能。一种有效的方法是通过基因引入含生物正交官能团的非天然氨基酸，实现蛋白质偶联。本文报道了一种位点特异性抗体偶联的详细实验方案，内容包括含叠氮基氨基酸的基因整合方法，以及通过应变促进的叠氮-炔环加成反应（SPAAC）进行偶联的实验步骤。该应变促进反应在生理pH和温度下仅需将反应分子简单混合即可进行，无需额外添加如一价铜离子或铜螯合配体等试剂。因此，该方法适用于常规蛋白质偶联及抗体药物偶联物（ADCs）的开发。

引言

自从在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现对p-甲氧基苯丙氨酸的遗传编码以来¹，已有超过100种非天然氨基酸（UAAs）被成功地整合到各种蛋白质中^1-3。在这些非天然氨基酸中，含有生物正交功能基团的氨基酸被广泛研究，且占比最大。这些非天然氨基酸中所使用的生物正交功能基团包括酮基⁴、叠氮基⁵、炔基⁶、环辛炔⁷、四嗪⁸、α,β-不饱和酰胺⁹、降冰片烯¹⁰、反式环辛烯¹¹以及双环[6.1.0]壬炔¹¹。尽管每种功能基团各有优缺点，但含叠氮基的氨基酸在蛋白质偶联中应用最为广泛。p-叠氮苯丙氨酸（AF）是含叠氮基的氨基酸之一，易于获得，且其整合效率优异。含有该氨基酸的突变蛋白可通过铜催化的环加成反应与炔烃反应，或通过SPAAC反应与环辛炔反应^12-20。

近年来，生物制药在制药行业中备受关注。抗体-药物偶联物（ADC）是一类治疗性抗体，因其能够实现靶向治疗人类癌症而具有显著优势²¹ 和 其他疾病。目前有超过50种抗体药物偶联物（ADC）正处于临床试验阶段，且数量正在迅速增加。在ADC的开发过程中，需考虑多种因素以最大化疗效并最小化副作用。其中，实现抗体与药物之间高效且位点特异的共价连接反应至关重要。通过将非天然氨基酸特异性地引入抗体中，并利用其携带的生物正交功能基团进行偶联反应，可实现所需的高度高效性和特异性。^22-26 在此，我们报告一种位点特异性整合的方案 将AF转化为抗体片段，并将突变的抗体片段与生化探针进行偶联。

方案

1. 质粒构建

1. 使用传统的定点突变技术，构建一个表达质粒（pBAD-HerFab-L177TAG），用于表达带有 His₆-标签的目标抗体基因（pBAD-HerFab-WT），并将亮氨酸-177 的密码子替换为琥珀密码子（TAG）²⁷。
   参见材料表。
2. 构建另一个表达质粒（pEVOL-AFRS），其中包含进化后的 tRNA^Tyr 和氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）配对的基因。使用专门设计的质粒载体 pEVOL，以实现非天然氨基酸（UAA）的高效插入。详细的质粒信息和克隆方案已在先前的报道中描述²⁸。
3. 使用 commercially available 质粒提取试剂盒获得高质量的质粒 DNA。纯化后的 DNA 其 260/280 比值约为 1.8 时为最佳。如有需要，可进行 1% 琼脂糖凝胶电泳以检测 DNA 的纯度。

2. 培养物制备

1. 电穿孔
   1. 将各1 µL的pEVOL-AFRS²⁸和pBAD-HerFab-L177TAG质粒DNA加入20 µL的大肠杆菌（Escherichia coli）DH10β菌株中，用移液器轻轻混匀。质粒可共同转化或分别进行转化反应。
   2. 使用0.1 cm电穿孔杯时，将电穿孔仪参数设置为25 µF和2.5 kV。
   3. 将电穿孔杯插入电击室的滑槽中，推入滑槽直至电穿孔杯与电击室电极紧密接触。
   4. 按下脉冲按钮进行一次电击，直至电穿孔仪发出蜂鸣声。
   5. 迅速向电穿孔杯中加入1 mL含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤（SOC）培养基（含2% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂ 和20 mM葡萄糖），并将混合液转移至离心管中。在37 °C、振荡条件下培养1小时。
   6. 将转化后的大肠杆菌（E. coli）细胞涂布于含有适当抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（分别添加35 µg/mL氯霉素和100 µg/mL氨苄青霉素以筛选pEVOL-AFRS和pBAD-HerFab-L177TAG质粒）。于37 °C培养12小时。
2. 培养物制备
   1. 挑取单个转化菌落接种于5 mL含抗生素的LB培养基中，在37 °C、振荡条件下培养12小时。

3. HerFab-L177AF 的表达与纯化

1. HerFab-L177AF 的表达
   1. 将初级培养物（5 mL）转移至含有氨苄青霉素（100 µg/mL）和 AF（1 mM）的 200 mL LB 培养基中，37 °C 摇床培养。
      注意：100 mM AF 储存液（10 mL）通过将 206 mg AF 溶解于 100 mM 盐酸（10 mL，终体积）中制备。
   2. 当培养物达到对数生长期（OD₅₅₀ = 0.8，OD = 光密度）时，加入 2 mL 1.6 M 阿拉伯糖（终浓度 16 mM），30 °C 摇床培养 12 小时。
   3. 在 11,000 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞，弃上清，将沉淀在 -20 °C 冻存。
2. 细胞裂解
   1. 将细胞沉淀用 20 mL 周质裂解缓冲液重悬，缓冲液含 30 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA、20% 蔗糖和 0.2 mg/mL 溶菌酶，37 °C 孵育 1 小时。
   2. 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟，将上清转移至新离心管中，弃去沉淀。
3. Ni-NTA 亲和层析
   1. 向每个离心管中加入 Ni-NTA 树脂悬浮液（每 200 mL 培养物加 400 µL 树脂），4 °C 轻柔混合 1 小时。
   2. 将悬浮液倒入聚丙烯柱中，用 5 mL 洗涤缓冲液（含 50 mM NaH₂PO₄（pH 8.0）、20 mM 咪唑和 300 mM NaCl）洗涤树脂三次。
   3. 用 300 µL 洗脱缓冲液（含 50 mM NaH₂PO₄（pH 8.0）、250 mM 咪唑和 300 mM NaCl）洗脱目标抗体。
   4. 通过 Bradford 蛋白测定法²⁹或测定 280 nm 处吸光度确定突变蛋白浓度。使用蛋白消光系数计算器，根据 AF 的消光系数（2,471 M^-1cm^-1）计算 HerFab-L177AF 在 280 nm 处的消光系数（75,866 M^-1cm^-1）。
      注意：HerFab 的氨基酸序列可在 NCBI 网站查询（GI:783282791 和 GI:783282792）。

4. 使用应变促进的叠氮-炔基环加成反应（SPAAC）将纯化的 HerFab-L177AF 与炔基探针偶联

1. 在含有 10 mM Na₂HPO₄（pH 7.0）和 100 mM NaCl 的磷酸盐缓冲液中，向 10 µL 浓度为 10 µM 的 HerFab-L177AF 溶液加入 20 µL 浓度为 200 µM 的 H₂O 溶液中的 Cy5.5-叠氮二苯并环辛炔（Cy5.5-ADIBO）。
   注意：作为替代方案，二氟环辛炔（DIFO）和双环[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物也可用于相同应用。
2. 在 37 °C 下孵育 6 小时，使应变促进的环加成反应进行。若使用对光敏感的探针（例如，Cy5.5），需用铝箔包裹反应容器。
3. 根据步骤 5 纯化标记后的 HerFab。

5. 标记 HerFab 的纯化

1. 向离心过滤旋柱中加入 500 µL 样品。
2. 在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 15 分钟。
3. 弃去滤过液，并将旋柱中纯化的样品转移至 1.5 mL 微量离心管中。
4. 作为步骤 5.1–5.3 的替代方法，可通过透析法在相同缓冲液中进行纯化。
5. 将纯化后的标记 HerFab 在 4 °C 下保存。

6. 标记 HerFab 的 SDS-PAGE 分析

1. 向13 µL纯化的标记HerFab（7.8 µM或0.38 mg/mL）中加入5 µL含有106 mM Tris·HCl、141 mM Tris碱（pH 8.5）、2% LDS、10%甘油、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250和0.175 mM酚红的LDS蛋白上样缓冲液，并在存在（+）或不存在（−）2 µL二硫苏糖醇（DTT，终浓度100 mM）的条件下混合。将混合物在95 °C孵育10分钟。
2. 将4-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶盒安装到电泳槽中并加入电泳缓冲液。上样偶联蛋白样品及预染蛋白分子量标记物。在200 V条件下进行35分钟凝胶电泳。
   注意：整个电泳过程中应将电泳槽避光保存，以尽量减少荧光染料的光漂白。
3. 电泳结束后，将凝胶转移至荧光凝胶扫描仪，在适当波长下扫描荧光发射信号。对于Cy5.5，使用扫描仪软件中的Cy5模式。
4. 使用商用蛋白质染色剂对凝胶进行染色。

结果

本研究中，通过将含叠氮基团的氨基酸引入抗体片段，并使突变型抗体片段与张力环辛炔发生反应，实现了抗体片段与荧光染料的位点特异性偶联（图1）。选择HerFab作为目标抗体片段，并将含叠氮基团的氨基酸AF引入其中。为确定HerFab中适合被AF取代的残基，分析了HerFab的X射线晶体结构³⁰。所选残基需满足两个关键条件：与抗体结合位点保持足够距离，以尽量减少对其结合亲和力的影响；同时具有溶剂可及性，以确保偶联反应高效进行。第177位的亮氨酸是一个较理想的候选位点，因为该残基充分暴露于抗体外部，且位于两个免疫球蛋白结构域的界面附近，距离抗体结合位点较远。

首先，构建了带有C端His₆-标签的HerFab表达质粒，并通过定点突变在第177位引入琥珀密码子，用于非天然氨基酸（AF）的掺入。在1 mM AF存在下，共表达优化后的tRNA^Tyr和氨酰-tRNA合成酶配...

讨论

将非天然氨基酸遗传整合到蛋白质中，相较于其他蛋白质修饰方法具有多项优势^1-3。其中一项重要优势是其适用于各类蛋白质的普适性。理论上，选择目标蛋白质及其靶向位点并无限制。然而，若将结构或功能关键的残基替换为非天然氨基酸（UAA），可能会影响目标蛋白质的结构与功能。通常选择暴露于溶剂且不与其他残基相互作用的残基进行UAA整合。因此，常利用高分辨率晶体结构提供的结构信息，以确定UAA整合的最佳位点³⁰。由于UAA整合在技术上较为简便，仅需简单的定点突变，因此可快速筛选多个位点，从而为目标蛋白质的特定功能选择最优的残基。

在此方案中，将非天然氨基酸AF通过遗传方式引入抗体片段，并利用SPAAC反应对抗体片段突变体进行位点特异性荧光标记。该方法的偶联产率可达定量水平，且无任何副反应，较此前报道具有重要改进。 ²⁵ 这是通过仔细的结构分析以选择最佳位点并延长反应时间来实现的。因此，非天然氨基酸（UAA）插入位点的选择对于快速且定量的偶联反应至关重要。此外，使用高效的UAA插入系统（例如pEvol-AFRS）对于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 质粒构建
质粒 pBAD_HerFab_L177TAG			可选择在目标位置包含琥珀终止密码子（TAG）。Ko, W. et al. 利用张力促进的叠氮-炔烃环加成实现高效且位点特异性的抗体标记。 BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
质粒 pEvol-AFRS			Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., 和 Schultz, P. G. 一种增强的非天然氨基酸在 E. coli. 中的诱变系统。 J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B	Invitrogen	C6400-03	表达宿主
质粒小提试剂盒	Nucleogen	5112	200/包
琼脂糖	Intron biotechnology	32034	500 g
溴化乙锭	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB 肉汤	BD Difco	244620	500 g
2. 培养物制备
2.1 电穿孔
微型脉冲仪	BIO-RAD	165-2100
微型脉冲电击杯	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm 电极间隙，每包50个
氨苄青霉素钠	Wako	018-10372	25 g
氯霉素	Alfa Aesar	B20841	25 g
琼脂	SAMCHUN	214230	500 g
SOC 培养基	Sigma	S1797	100 mL
3. HerFab-L177AF 的表达与纯化
3.1 HerFab-L177AF 的表达
p-叠氮-L-苯丙氨酸（AF）	Bachem	F-3075.0001	1 g
L(+)-阿拉伯糖，99%	Acros	104981000	100 g
盐酸，35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
3.2 细胞裂解
三（羟甲基）氨基甲烷，99%	SAMCHUN	T1351	500 g
EDTA 二钠盐二水合物，99.5%	SAMCHUN	E0064	1 kg
蔗糖	Sigma	S9378	500 g
溶菌酶	Siyaku	126-0671	1 g
3.3 Ni-NTA 亲和层析
Ni-NTA 树脂	QIAGEN	30210	25 mL
聚丙烯柱	QIAGEN	34924	50/包，1 mL 容量
咪唑，99%	SAMCHUN	I0578	1 kg
磷酸二氢钠，98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
氯化钠，99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
4. 利用张力促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）将纯化的 HerFab-L177AF 与炔基探针偶联
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1 mg
5. 标记 HerFab 的纯化
Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器	MILLIPORE	UFC500396	96/包，500 μL 容量
6. 标记 HerFab 的 SDS-PAGE 分析及荧光凝胶扫描
1,4-二硫代-DL-苏糖醇，DTT，99.5%	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS 上样缓冲液，4x	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES 电泳缓冲液	Thermofisher	NP0002	500 mL
NuPAGE Novex 4-12% SDS-PAGE 凝胶	Thermofisher	NO0321	12孔
考马斯亮蓝 R-250	Wako	031-17922	25 g
Typhoon 9210 多功能成像仪	Amersham Biosciences