我们提出了一种可靠的方案，用于仔细保存和制备尸体股骨，以进行骨折测试和定量计算机断层扫描成像。该方法可精确控制输入条件，旨在确定骨密度、骨折强度之间的关系，并定义有限元模型的几何结构和属性。
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摘要
摘要
尸体骨折测试常用于研究影响股骨近端强度的因素。因为 离体 生物组织随着时间推移容易丧失其力学性能，因此在实验测试前必须谨慎进行样本制备，以获得能够真实反映其特性的可靠结果 体内 条件。因此，我们设计了一套实验方案和固定装置，以制备股骨试样，使其力学性能变化最小化。除制备步骤和力学测试期间外，股骨均保持冷冻状态。使用临床双能X射线吸收测定法（DXA）骨密度仪获取全髋关节和股骨颈骨矿物质密度（BMD）的相关临床测量值，通过CT扫描结合校准体模，基于灰度值进行定量估算，获得骨矿物质的三维几何结构和分布情况。通过X射线扫描排除任何可能的骨病、骨折，或影响骨结构的植入物或伪影。制备过程中，所有骨骼均仔细清除多余的软组织，并在设定的内旋角度下进行截断和包埋。使用切割夹具将骨远端切除，保留所需长度的近端股骨。为在后续CT扫描和力学测试中实现股骨颈在指定角度的准确定位，采用特制夹具将近端股骨干包埋于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中。实验所获得的数据用于验证基于定量计算机断层扫描（QCT）的有限元分析（FEA），具体方法见另一实验方案。本文中，我们介绍用于力学测试及后续QCT/FEA建模的精确骨样制备方案。该方案已在6年时间内成功应用于约200例尸体股骨的制备。
引言
通过力学测试确定尸体股骨近端骨折强度是一种破坏性方法，需要采用严格的测试方案才能获得准确的测量结果。特别是，在进行力学骨折测试之前，必须采用适当的骨骼制备方法，以维持骨骼接近体内状态的完整性1。这可通过适当的骨骼储存方式以及尽量减少在室温下的操作来实现。这些测试数据被广泛用于验证股骨骨折的定量CT/有限元分析（QCT/FEA）模型，这些模型有望在临床上用于评估骨折风险，尤其是在骨质疏松患者中。然而，目前尚无制备用于力学测试的股骨近端样本的标准化操作流程。良好的测试流程应确保样本制备过程的可重复性和可再现性。因此，样本制备所需的夹具必须经过精心设计和加工，以最大限度地降低各种测试误差的发生概率。我们还需要尽量缩短骨骼组织处于室温环境的时间，从而避免其发生降解，防止力学性能出现不可逆的改变。
为此，我们开发了一种可在多个制备步骤中保持骨组织完整性的方法。这一点至关重要，可确保骨组织在室温下的暴露时间最短，同时尽量减少冻融循环次数，因为冻融循环可能影响组织的物理特性2。整个操作流程耗时较长且较为复杂，各步骤跨越数周时间，并需协调扫描程序及人员安排。具体步骤包括：解冻骨样本，使用双能X线吸收测定法（DXA）扫描样本以获取骨密度（BMD）值，进行X射线检查以排除病变样本，最后通过CT扫描评估骨矿物质分布及股骨几何结构。所有样本均需进行测试前处理，包括清除骨表面多余的软组织，将股骨截断至测试所需长度，并将股骨以特定方向固定，以便在后续实验中模拟髋部侧向跌倒情况。必须尽可能缩短上述各项操作的持续时间。因此，制定一套严谨的方案对于确保样本制备的一致性、各步骤间组织的保存以及缩短整体准备时间至关重要。
本文旨在详细介绍在不同条件下对股骨样本进行后续力学测试前的制备步骤。在此过程中，骨组织的保存至关重要，我们通过在各步骤间将样本保持冷冻状态，并始终将其仔细包裹在生理盐水浸润的毛巾中（仅在扫描和进行力学测试时除外），从而实现组织保存。在涉及PMMA固化的步骤中，股骨也始终保持包裹在生理盐水湿润的毛巾中，以防止骨组织干燥。
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方案
注意：本方案中所述的所有研究均经梅奥诊所机构审查委员会（IRB）批准。骨骼样本在6年期间从多个机构获取，所有标本均在死亡后72小时内收集，用生理盐水浸湿的毛巾包裹，并在-20 °C下保存至进行处理。
1. 使用双能X线吸收法测量骨密度
- 将保存在 -20 °C 冰箱中的标本取出，在室温下解冻约 24 小时；如果大部分软组织已被去除，则无需将标本从原始包装中取出。
- 使用两个 5 磅的米袋来模拟软组织。用塑料袋覆盖 DXA 桌面上的两个米袋，以防止污染。在扫描过程中，米袋将模拟周围软组织（in vivo）环境，如图 1所示。
- 用带塑料衬里的纸张保护 DXA 扫描仪表面，并将两个用塑料包裹的米袋放置在扫描仪台面上（图 1A）。
- 将两个股骨（右侧和左侧）放置在米袋上方，使近端（包括股骨头）居中于米袋上，且后侧朝下（图 1B）。此体位模拟患者仰卧姿势。
- 用另外两个 5 磅的米袋覆盖前侧暴露的股骨近端（图 1C）。
- 将机器探头定位在股骨近端上方，按照本机构用于患者骨密度（BMD）测量的标准操作程序进行扫描（图 1C）。请遵循特定 DXA 设备制造商的操作说明。
- 通过 DXA 仪器的软件界面执行常规股骨扫描。选择股骨检查项目，根据需要按下 DXA 机械臂上的左或右箭头按钮，将机械臂定位到尸体股骨上方，然后单击"开始"按钮启动检查。单击"分析"按钮进行骨密度分析。
注意：扫描生成的自动 T 值可将骨状态分类为正常、骨量减少或骨质疏松（图 1D）。请遵循特定 DXA 设备制造商的操作说明。
- 通过 DXA 仪器的软件界面执行常规股骨扫描。选择股骨检查项目，根据需要按下 DXA 机械臂上的左或右箭头按钮，将机械臂定位到尸体股骨上方，然后单击"开始"按钮启动检查。单击"分析"按钮进行骨密度分析。
2. 清洁、切割和钻孔骨骼的远端
- 仔细去除股骨最靠近近端的300 mm范围内的所有残留软组织，以清洁骨表面。此步骤的目的是在后续浇注过程中使PMMA能够与骨组织充分接触，为力学测试做好准备。此过程无需将骨骼解冻至室温。
- 使用70%异丙醇对工作区域进行消毒，并在桌面上铺设一侧带有塑料薄膜的吸水纸垫（图2A）。将完整的股骨放置于桌面上（图2B），从清洁到切割的整个过程均在此进行（图2A至2H）。操作时需佩戴个人防护装备（PPE），包括手套和眼部防护装置。
- 使用刮匙和手术刀刮除多余的骨膜，并切除多余组织（图2C、2H）。
- 将骨骼放入定制的切割夹具中，如图2D所示，使股骨头紧贴夹具的亚克力板。
- 将骨干与夹具上的两个定位销对齐并固定（图2D）。
- 通过拧紧夹具上带槽的压板来固定骨骼；若骨骼无法平稳贴合夹具，可将远端悬于桌面之外，并根据需要使用扎带固定股骨颈，以确保样本位置稳定（图2D）。
- 使用铸件切割器沿带槽压板的引导方向切割股骨远端骨干（图2E）；操作时用干燥的布或毛巾握住骨骼以增加抓握力。
- 将骨骼从夹具中取出；切割后的正常骨长度为255 mm（图2F）。
- 使用刮匙清理髓腔内的骨髓，深度约为25 mm。然后插入纱布海绵以帮助干燥髓腔内表面。在将股骨远端放入模具前，及时取出纱布。用干燥的毛巾或布握住骨骼，在距近端切面约25 mm处的远端钻一个直径为10 mm的通孔。注意：此孔可使PMMA渗入髓腔，从而牢固固定骨骼。
3. 骨组织的包埋
- 设计并制作浇铸容器。浇铸容器由5 mm厚的亚克力板制成，外部尺寸为：横截面50 mm × 50 mm的正方形，高度100 mm（图3A）。
- 在浇铸容器上标注相应的骨骼编号（图3A 和 3B — 见亚克力盒上的标签）。
- 调整包埋夹具至正确方向（左腿或右腿；例如 15° 或 30° 内旋）。
- 将浇铸容器放置于包埋夹具底座中，将骨骼放入浇铸容器内（图3B），并使股骨颈与夹具中的指针对齐（图3C），以调节骨骼至所需的内旋角度。
- 在通风橱中称取60 g PMMA粉末，并与30 g液态树脂混合，直至粉末完全溶解。混合物应具有可倾倒的流动性。此过程使用一次性纸杯。
- 在通风橱中将混合物倒入装有骨骼的浇铸容器中（图3D），静置固化约10–15分钟，直至PMMA变为透明且坚硬。PMMA应仅填充浇铸容器约1/2体积。为防止PMMA聚合过程中产热导致组织干燥，需小心用生理盐水浸湿的毛巾包裹骨骼（图3E）。
- 定期检查股骨，确保其在固化过程中始终保持在容器中的正确位置。
- 将股骨从浇铸夹具中取出，并用生理盐水浸湿的纸巾包裹（图3E）。
- 按照步骤3.5所述方法，在通风橱中配制90 g PMMA，并将浇铸容器完全填满。固化约10–15分钟，直至PMMA完全硬化。
- 树脂完全固化后，用生理盐水浸湿的纸巾紧密包裹或重新包裹骨骼，外覆塑料袋，并将样本储存于-20 °C冰箱中。
4. 使用X射线对骨骼进行成像
（注意！使用该设备时需谨慎操作X射线辐射）
- 若使用胶片进行X射线成像，请在扫描前至少20分钟（根据制造商说明）打开X射线显影机，方法是在显影室中顺时针旋转旋钮。
- 在进行X射线照射前，确保暗盒中装有未曝光的胶片；暗盒只能在暗室中打开。
- 打开设备电源，以解锁并伸出机器头部。
- 在射线路径下方放置推车，并将暗盒置于推车上的射线束下方（图4A）。
- 将股骨放置并定位在暗盒上（图4B）；将采集两个方向的图像：内侧-外侧位和前侧-后侧位。相应地标记标本图像。
- 第一次曝光后，交换铅板与骨骼的位置。
- 用铅板覆盖已曝光的一半胶片，并在未曝光的一侧对骨骼进行第二种方向的曝光。这样用户可在一张X射线胶片上以两种方向成像单根骨骼（图4C-D）。
- 更换暗盒，并将每根股骨旋转至第二个方向。
- 对于单根股骨的情况，用铅板覆盖暗盒的一半，以避免整个胶片初始即暴露于X射线下。
- 移动到带铅衬的便携式防护墙后方以进行个人防护，并使用触发装置对骨骼进行曝光。
- 操作完成后，将X射线头部复位至锁定和存放位置，将X射线机钥匙转至“OFF”（关闭）状态，并取出已曝光的X射线胶片。
- 使用常规胶片显影机显影胶片以获得X射线图像（图4E）。打开房间内的白光灯，找到胶片显影机。在打开暗盒前，打开红光灯并关闭白光灯，然后进行胶片显影操作。打开暗盒，将胶片送入显影机中。胶片显影完成后，打开白光灯并关闭红光灯。
5. 骨骼的CT扫描
- 在扫描前约24小时将骨骼从冷冻箱中取出。扫描前骨骼必须完全解冻。
- 确保扫描时骨骼包裹在塑料袋中，以尽量减少后续清理工作。
- 将股骨和校准体模放置并固定在CT扫描夹具中（图5A-B）。该夹具用于固定校准体模（图5C），并以与后续力学测试所需方向一致的方向固定股骨（图5D-E）。这种交叉配准是将CT扫描数据（图5F）用于定量CT/有限元分析（QCT/FEA）建模过程（见其他实验方案）所必需的。
注意：夹具设计为在不遮挡近端股骨（股骨头、股骨颈、大转子及近端骨干）的前提下暴露股骨进行CT扫描。 - 使用系统激光作为引导，确保夹具连同股骨在CT扫描仪中正确对齐（图5D-E）。通过按下激光开关按钮重新检查夹具与CT长轴激光的对齐情况。体模无需与激光对齐，因其已牢固固定于夹具中。在控制面板上按下归零按钮（→ 0 ←），将扫描床位置归零。
- 按照CT标准操作程序，在超高清分辨率模式（zUHR）下运行CT设备，参数设置为：120 kVp、216 mAs、旋转时间1 s、螺距1。此设置可获得0.4 mm的层厚，像素大小为0.30–0.45 mm，具体取决于视野（FOV）的大小。
- 在进行力学测试前检查CT扫描数据，确保目标图像已被捕获并保存。将骨骼在-20 °C下重新冷冻，直至实验当天。
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结果
尸体股骨以冷冻状态运输，并在准备开始前保存于 -20 °C 环境中。采用双能X线吸收测定法（DXA）扫描仪对每根标本进行骨密度（BMD）扫描，测量其髋关节整体及股骨颈部位的BMD值，并计算T值（图1）。T值表示所测BMD值与健康青年人群平均值相比的标准差数目，其范围通常为：骨质疏松骨骼≤-2.5，骨量减少骨骼介于-1至-2.5之间，正常骨骼则高于-1。扫描完成后，清除骨骼上多余的组织，并使用实验室自行设计和制作的切割夹具切除远端部分（图2）。随后，将标本远端嵌入固定夹具中，以便保持所需的内旋方向；将远端置入嵌入容器后，注入液态聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以填满容器（图3）。对成对的骨骼及单独的骨骼分别获取X射线图像，以判断是否存在骨折或癌症等可能影响股骨强度的病变（图4）。若发现此类异常情况，在后续分析中应详细记录骨骼的病理状态。最后，使用特制的丙烯酸CT扫描夹具对股骨进行CT扫描，以获取CT图像；该夹具可将骨骼固定在预设的特定方位（内收...
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讨论
我们提出了一种可靠的骨样本制备方案，用于确保在模拟髋部侧向跌倒配置下进行股骨强度的力学测试及定量计算机断层扫描/有限元分析（QCT/FEA）建模。该方法已成为我们实验室的标准内部操作流程。在六年的时间里，尽管人员有所更替，仍成功按照此方案制备了约200根股骨样本。该方案的实施结果包括：利用双能X线吸收测定法（DXA）对骨状况进行分类，通过X射线排除转移性病变、既往骨折或植入物，并通过CT获取骨矿物质分布和三维几何结构，以用于后续的QCT/FEA建模。切割、包埋和扫描夹具的设计可适配左侧和右侧股骨，并满足未来测试、建模和分析所需的多种骨取向。实验室自制的夹具确保了测试样本的可重复性和可复现性。
由于骨实验的复杂性，以及在进行力学测试前需要结合骨密度（BMD）、X射线和CT扫描，股骨必须经历多次冻融循环。通过采用适当的方案以尽量减少在室温下的暴露时间，冷冻保存骨样本可有效维持组织的力学测试性能，即使长期保存亦如此3,4。先前的研究表明，在-20 °C下冷冻骨组织不会改变...
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披露
作者无相关披露信息。
致谢
我们感谢梅奥诊所材料与结构测试核心设施提供的技术支持。此外，我们感谢Lawrence J. Berglund、Brant Newman以及Jorn op den Buijs博士在本研究期间给予的帮助。本研究由格兰杰基金会格兰杰创新基金提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CT 样品容器和扫描夹具 | 内部自制 | 不适用 | 定制设计与制造 |
| CT 扫描仪 | 西门子 | Somatom Definition 扫描仪（Siemens，美国宾夕法尼亚州马尔文） | CT 扫描设备 |
| 定量 CT 模体 | Midways 公司，美国加利福尼亚州旧金山 | 型号 3 CT 校准模体 | 用于从 CT 图像的 Hounsfield 单位获取骨密度（BMD）值 |
| 双能 X 射线吸收测定仪 | 通用电气 | 不适用 | GE Lunar iDXA 骨密度扫描仪或其他类似 BMD 扫描仪 |
| Hygenic 正畸树脂（PMMA） | Patterson 牙科供应公司 | H02252 | 受控物质，需获得适当批准后方可购买 |
| 冷冻柜 | Kenmore | 不适用 | 用于骨骼的 -20 °C 储存 |
| X 射线扫描仪 | 通用电气 | 46-270615P1 | X 射线成像设备。 |
| X 射线胶片 | 柯达 | 不适用 | 用于显示 X 射线图像 |
| X 射线显影液 | 柯达 X-Omatic | M35A X-OMAT | 用于显影 X 射线图像 |
| X 射线暗盒 | 柯达 X-Omatic | 不适用 | 用于装载 X 射线胶片 |
| 5 磅大米袋 | Great Value | 不适用 | 用于在 DXA 扫描过程中模拟软组织 |
| 生理盐水（0.9% 氯化钠） | 百特公司 | NDC 0338-0048-04 | 用于保持样本湿润 |
| 手术刀和刮匙 | Bard-Parker | 不适用 | 用于清除骨骼上的软组织 |
| 石膏切割器 | Stryker | 810-BD001 | 用于切割股骨干 |
| 钻孔机 | 博世 | 不适用 | 用于对股骨干进行钻孔 |
| 通风橱 | Hamilton | 70532 | 制备 PMMA 时用于通风 |
参考文献
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