建立成体神经干细胞（aNSCs）的培养体系，有助于研究并应用aNSCs进行治疗。胼胝体下区（SCZ）最近被确认为成年小鼠中一种新的成神经细胞形成区域。本文介绍了SCZ来源的aNSCs的分离、扩增和分化方法。
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本文内容
摘要
摘要
成年神经干细胞（aNSCs）可用于受损脑组织的再生。aNSCs具有分化并增殖为三种细胞类型的潜能：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。鉴定aNSC来源的区域并表征其特性，对于aNSCs的潜在应用及其在神经再生中作用的阐明至关重要。胼胝下区（subcallosal zone, SCZ）位于白质与海马之间，近期研究报道该区域含有aNSCs，并能持续产生神经前体细胞。来自SCZ的aNSCs中仅有少量比例分化为神经元，大多数细胞则分化为胶质细胞，如少突胶质细胞和星形胶质细胞。这些细胞被认为在治疗创伤性皮质损伤方面具有潜在应用价值。本方案详细描述了从成年小鼠脑组织中分离获取SCZ-aNSCs的操作流程。使用间隔为1 mm的脑组织切片矩阵，以获得包含SCZ的冠状脑片，并精确地从全脑中解剖出SCZ区域。SCZ组织片段首先进行神经球培养。一个完善成熟的培养体系不仅有助于验证这些细胞的特性，还可促进对NSCs的深入研究。神经球培养系统是评估细胞增殖能力及富集真正NSCs的有效工具。此外，单层培养也是一种 体外 用于检测增殖与分化的系统。值得注意的是，该培养系统为神经干细胞（NSCs）提供的环境比神经球培养系统更为均一。因此，利用特定脑区，这些培养系统将有助于拓展我们对成体神经干细胞（aNSCs）及其治疗应用的认识。
引言
神经干细胞（NSCs）具有自我更新和多向分化潜能的特性。为验证这些特性，神经球培养体系已被广泛应用。该体系建立于20世纪90年代初，现已成为标准的干细胞培养体系。1根据自我更新能力的不同，神经干细胞（NSCs）在悬浮培养中持续增殖并形成细胞团。细胞数量和神经球的大小通常被认为与NSCs的增殖特性密切相关。单层培养也广泛用于NSCs的维持和分化。与神经球培养相比，单层培养体系能够更均一地维持和扩增NSCs。2这两种成熟的培养体系有助于对aNSCs的特性进行表征 体外.
神经干细胞（NSCs）存在于大脑的不同区域，例如侧脑室的室下区（SVZ）和海马体的颗粒下区（SGZ）。3-5尾侧皮层下白质中的胼胝下区（SCZ）被认定为一个新的神经发生区域6-8最近有报道称，精神分裂症患者来源的神经干细胞（SCZ-aNSCs）在治疗创伤性脑损伤方面具有潜在疗效。9与其它神经发生区域相比，SCZ 位于皮层下白质区域。在人脑中，皮层下白质所占区域大于小鼠脑中的相应区域。10因此，利用SCZ-aNSCs的特性进行研究具有重要意义 体外 培养体系对于促进这些细胞在神经再生中的潜在应用至关重要。需要精确分离目标脑区，以排除含有活跃或静止状态神经干细胞的非目标区域可能带来的污染。例如，在非神经发生区域的成体神经干细胞可在脑损伤情况下或某些病理状态下被激活，并产生新的神经细胞。 体外 培养11为获取侧脑室下区（SCZ）的神经干细胞（NSCs），首先从包含SCZ的脑切片中收集细胞，随后使用细针进行SCZ区域的精细显微解剖。为从SCZ生成神经球，将显微解剖获得的SCZ组织块解离为单细胞，并在表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）存在条件下以悬浮培养方式培养。当SCZ来源的成体神经干细胞（SCZ-aNSCs）形成神经球后，可继续以神经球形式或转换为单层培养进行扩增。本实验流程还展示了在单层培养中扩增与分化后，利用多种标记物对NSCs及其子代细胞进行免疫染色的检测方法。本文提供了一套SCZ-aNSC培养系统的可视化操作流程，包含SCZ区域显微解剖以及细胞维持与传代的详细操作步骤。 关键词：神经干细胞，侧脑室下区，显微解剖，神经球，表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，免疫染色，单层培养，细胞扩增，细胞分化
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方案
1. 材料与培养基的准备
- 解剖和分离SCZ时，用铝箔包裹脑组织切片模具、双刃剃须刀片和镊子，然后通过高压灭菌进行消毒。
- 准备50 ml冷的PBS缓冲液，用于清洗整个小鼠脑组织。
- 设置解剖显微镜，并准备好脑组织解剖所需的手术器械（已灭菌的剪刀和镊子）以及SCZ分离所需的工具（1 ml注射器、30 G针头、脑组织切片模具和精细镊子）。
- N2培养基的配制：
- 使用F-12/DMEM（含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠）培养基，添加2% B27、1% N2补充剂和1%青霉素-链霉素。
注意：生长培养基由N2培养基和生长因子组成（20 ng/mL纯化的表皮生长因子（EGF）和20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF2））。
- 使用F-12/DMEM（含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠）培养基，添加2% B27、1% N2补充剂和1%青霉素-链霉素。
- 准备消化缓冲液（含40单位/ml木瓜蛋白酶、2.4单位/ml中性蛋白酶II和2%青霉素-链霉素的PBS溶液），用于组织消化。
- 包被培养板和盖玻片的准备：
- 配制聚-L-鸟氨酸（PLO；0.01%）和层粘连蛋白（laminin；10 µg/ml，溶于DH2O中）。为包被6孔板（用于单层培养维持SCZ-aNSCs）或18 mm盖玻片（用于免疫染色），将板或盖玻片于4 °C下与PLO孵育过夜，随后用DH2O洗涤3次。最后一次洗涤后让培养板和盖玻片自然干燥。
- 接着，将培养板与层粘连蛋白在4 °C下孵育过夜，然后用DH2O洗涤3次。
注意：切勿使包被有层粘连蛋白的表面干燥，否则会影响细胞贴附。
说明：包被溶液可重复使用3次。
2. 成年SCZ的分离与解离
- 在准备培养前，将脑切片模具和双刃剃刀置于冰上。
注意：切勿将脑切片模具冷冻，以免脑组织粘附其上。 - 通过 CO2 窒息法或颈椎脱位法处死一只小鼠（8周龄）。
- 喷洒70%乙醇后，用锋利的剪刀剪下头部。为固定头部，需紧紧握住头部两侧。沿中线从尾侧向头侧方向剪开皮肤，以利于完整剥离颅骨上的皮肤。
- 先移除颅骨的尾侧部分（λ点后方），然后将镊子插入背侧中线位置的颅骨与脑组织之间。夹住左侧（或右侧）顶骨，小心将其剥离。重复此操作以移除另一侧顶骨。
注意：切断视神经并去除脑膜有助于更顺利地将脑组织从颅骨中分离。 - 将脑组织转移至25 ml冷PBS缓冲液中，清洗两次以去除多余血液。
- 将脑组织放入置于冰上的脑切片模具中，进行冠状面切割，获得厚度为1 mm的脑片。将包含位于脑后部SCZ区域的脑片（1 mm厚）转移至盛有冷PBS的35 mm塑料培养皿中。
警告：为获得平行的冠状切面，必须确保脑裂位于脑切片模具的中线上；这是避免切片出现不必要的变异的关键步骤。
注意：应获取位于前囟后方2–3 mm处的脑片，以便将SCZ与SVZ分离。 - 在低倍解剖显微镜下，使用弯曲的30G针头从皮层和海马的白质区域显微解剖分离SCZ6,9。随后去除SCZ上方的皮层区域。将从脑片中分离出的SCZ组织置于冰上、不含冷PBS的35 mm塑料培养皿中。
注意：若混入含有成熟神经元的其他区域组织，可能会影响aNSCs的存活率及神经球的形成，因为这些成熟细胞在aNSC培养条件下会发生细胞死亡。 - 使用弯曲的30G针头立即把分离的组织切成小块。
注意：若SCZ组织的分离过程需要较长时间，可在切割前将已分离的组织浸入冷PBS中保存。 - 用1 ml消化缓冲液重悬切碎的组织，转移至含有2 ml消化缓冲液的15 ml离心管中，在37 °C水浴中孵育30分钟。
注意：每10分钟轻轻振荡离心管一次，以充分混匀。
3. 扣带回下区来源的成体神经干细胞培养
- 轻轻敲击离心管以解离消化后的组织，然后在145 × g下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL预热的N2培养基重悬消化后的组织，以去除消化液，并使用P1000移液器轻柔吹打样品溶液最多5次。
注意：使用过细的移液枪头过度吹打会降低细胞活力及后续生长能力。 - 在145 × g下离心5分钟。弃去上清液后，用1 mL N2培养基重悬细胞沉淀。
- 在未包被的6孔板中每孔加入1 mL N2培养基，再加入1 mL细胞悬液，使终体积为2 mL。
- 向每孔中加入EGF（20 ng/mL）和bFGF（20 ng/mL）。用手轻轻晃动6孔培养板，使添加的生长因子与接种的细胞充分混匀。将6孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
- 每天向每孔中添加EGF（20 ng/mL）和bFGF（20 ng/mL），持续8天。每三天添加200 µL N2培养基，以维持培养基总体积约2 mL。
4. 神经干细胞神经球的传代及单层培养
- 收集神经球并转移至新的15 ml锥形管中。
注意：单个小鼠脑部SCZ区每孔产生的神经球数量（直径>50 µm）为64.3 ± 7.31，低于SVZ区（190.5 ± 6.33）9。 - 将神经球与0.5 ml解离缓冲液在37 °C水浴中孵育5分钟，使其解离为单细胞。原代神经球可被解离为单细胞，并可在多代传代中以神经球或单层培养形式维持。
注意：以单层培养形式扩增SCZ-aNSCs优于神经球培养，因为SCZ-aNSCs在单层培养体系中可传代>10次，而在神经球培养体系中仅能传代<5次。
注意：SCZ-aNSCs具有强烈的聚集倾向，难以完全解离为单细胞，因此不建议采用神经球培养模式进行常规细胞扩增。 - 使用P1000移液器轻柔吹打样品溶液上下混合不超过5次，然后以145 × g离心5分钟。弃去上清液，并用1 ml N2培养基重悬神经球。
注意：使用窄口移液枪头过度吹打会降低细胞活力及后续生长能力。 - 为进行细胞计数，取10 µl细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1:1比例混合，随后在血细胞计数板上计数活细胞数量。将6孔板用PLO/层粘连蛋白包被后，每孔加入2 ml N2培养基，以2.5 × 105 个细胞/ml的密度接种细胞。
注意：细胞密度的变化可能影响其状态和分化潜能。 - 使用生长因子（2 ml，20 ng/ml）每日处理，持续培养SCZ-aNSCs 5天，随后进行传代。
5. 胼胝体下区来源的成体神经干细胞的分化
- 将SCZ-aNSCs以1 × 105 个细胞/ml的密度接种于经PLO/层粘连蛋白包被的18 mm盖玻片上，每孔加入1 ml含生长因子（20 ng/ml）的N2培养基，用于诱导SCZ-aNSCs分化。
- 次日，当细胞已牢固贴附于盖玻片时，更换培养基为不含生长因子的N2培养基。
- 6天后，用1 ml PBS洗涤已分化的细胞，以去除细胞碎片，并进行固定以用于免疫染色。
注意：BrdU可掺入增殖细胞新合成的DNA中。因此，如需要，可在细胞固定前向活细胞中加入BrdU（10 µg/ml）。
6. 成年神经干细胞及其分化子代细胞的免疫染色
- 进行免疫染色时，用 PBS 洗涤细胞，并在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 20 分钟。
注意：PFA 具有高毒性，避免接触皮肤和眼睛。 - 去除 4% PFA，用 PBS 漂洗固定后的细胞 3 次，然后在 4 °C 下保存，待后续进行免疫染色时使用。
- 将盖玻片上的细胞用封闭液（含 3% 牛血清白蛋白和 0.1% Triton X-100 的 1×PBS 溶液）在室温下孵育至少 30 分钟。
- 将一抗用新鲜的封闭液稀释后，于 4 °C 过夜孵育样品。
- 对 aNSCs 进行免疫染色
- 使用抗 Nestin 和抗 BrdU 抗体对 aNSCs 进行染色。在固定前，向 aNSCs 中加入 20 µg BrdU 并孵育 2 小时。在封闭步骤前，使用 2 N HCl 在 37 °C 下进行变性处理 20 分钟。
- 对分化后的前体细胞进行免疫染色：
- 使用抗 O4、抗 bIII-tubulin 和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体标记分化后的前体细胞。
- 对 aNSCs 进行免疫染色
- 用 PBS 洗涤样品 3 次，然后在封闭液中加入与荧光染料偶联的二抗（1:500 稀释），室温孵育 30 分钟，随后再用 PBS 洗涤 3 次。
注意：二抗应与一抗的宿主相匹配。使用 Hoechst33342（1:2,000）进行细胞核染色。 - 在载玻片上滴加封片液，进行封片操作。使用共聚焦显微镜在多个波长下观察并成像样品：FITC（488 nm）、Cy3（543 nm）、Cy5（647 nm）和 Hoechst33342（405 nm）。
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结果
定义未知神经发生区域aNSCs的培养体系对于理解这些细胞及其在脑修复中的潜在应用至关重要12已知不同发育阶段或不同区域的神经干细胞（NSCs）表现出不同的特性3,4最近有报道称，源自精神分裂症（SCZ）的细胞表现出不同的神经元分化潜能。 体内 和 体外 与SVZ来源的细胞相比7-9因此，为了精确分离每个神经发生区域，使用1 mm脑切片矩阵对包含SCZ的脑组织切片进行解剖图1A）。经过8天的生长因子培养后，源自SCZ的aNSC可形成神经球，这些细胞可在其中进一步维持培养。图1B).
由于神经球中的部分神经干细胞（NSCs）可能自发分化13，单层培养体系也有助于维持SCZ-aNSCs相对均一的细胞群体。生长因子和胰蛋白酶等解离酶难以有效渗透至神经球内部14,...
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讨论
本文详细描述了一种从小鼠成年脊髓中央管区（SCZ）分离神经干细胞（NSCs）并对其进行长期维持以用于多种应用的实验方案。建立该体系有三个关键步骤： 体外 用于纯化和扩增SCZ-NSCs的培养系统。首先，必须确保从其他潜在的神经发生区域中精确分离出SCZ区域。图1B）。使用1 mm间隔的脑组织切片矩阵获取包含SCZ区域的厚而精确的脑片，然后用细针将SCZ从其他皮层区域进行显微解剖分离。图1A）。当邻近组织（如大脑皮层）的非神经干细胞与精神分裂症相关神经干细胞（SCZ-aNSCs）共同培养时，会发生灾难性细胞死亡，从而对SCZ-NSCs的存活率和成球能力产生负面影响16-18,22尾部脊髓室管膜下区（位于前囟后方2-3 mm）被证实是获得 distinct SCZ-aNSCs 的最佳区域。其次，在收获和传代过程中采用适当的酶处理对于获得高产量的细胞至关重要。与胰蛋白酶相比，Dispase II 和木瓜蛋白酶在分离 aNSCs 时效果更佳。使用解离缓冲液而非胰蛋白酶进行细胞传代解离，可提高细胞存活率。19机械解离和...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由韩国科学、信息通信技术与未来规划部资助，通过国家研究基金会（NRF）脑科学研究计划（项目号 NRF-2015M3C7A1028790）支持；并由韩国卫生技术研究开发项目资助。&韩国保健产业振兴院（KHIDI）通过韩国保健福祉部资助的D项目 & 韩国福祉部（HI14C3347）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>培养基成分 | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-谷氨酰胺，+碳酸氢钠 |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 补充剂 | Gibco | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| <强>生长因子 | |||
| bFGF | R&研发 | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| <强>缓冲液 | |||
| PBS（10×） | BIOSOLUTION | BP007a | 1倍稀释 |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| <强>解离缓冲液 | |||
| Dispase II | 罗氏 | 04-942-078-001 | |
| 木瓜蛋白酶 | 沃辛顿 | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| <强>工具 | |||
| 精细镊子 | WPI | 555229F | |
| 剪刀 | Storz | E3321-C | |
| 脑组织切片矩阵（1 毫米） | 真实世界数据 | 68707 | |
| 双面剃须刀片 | DORCO | ST-300 | |
| 30 G 针头 | SUNGSHIM | N1300 | |
| <强>材料 | |||
| 15 ml 离心管 | SPL | 50015 | |
| 50 ml 离心管 | SPL | 50050 | |
| 35 mm 培养皿 | SPL | 10035 | 培养皿 |
| 100 mm 培养皿 | SPL | 10090 | 培养皿 |
| 盖玻片（18 mm） | Deckglaser | 111580 | |
| 12孔板 | SPL | 32012 | 非包被 |
| 6 孔板 | SPL | 32006 | 非包被 |
| <强>包被材料 | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| 层粘连蛋白 | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| <强>一抗 | |||
| Nestin | 默克密理博 | MAB353 | 小鼠（1:1,000） |
| EGFR | Abcam | ab2430 | 兔 (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | 山羊（1:500） |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | 兔 (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | 大鼠（1:1,000） |
| O4 | Millipore | MAB345 | 小鼠（1:500） |
| BrdU | Abcam | ab6326 | 大鼠（1:500） |
| <强>二抗 | |||
| 抗小鼠 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| 抗小鼠 Cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| 抗小鼠 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| 抗兔488 | Alexa | A21206 | |
| 抗兔Cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| 抗山羊488 | Alexa | A11055 | |
| 抗山羊Cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| 抗山羊647 | Invitrogen | A21447 | |
| 抗大鼠 488 | Invitrogen | A21208 | |
| 抗大鼠Cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| 抗大鼠 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| <强>免疫染色材料 | |||
| BSA | 默克密理博 | 82-100-6 | PBS 中含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechst33342 | Life Technology | H3570 | 用于染色细胞核的染料 |
参考文献
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