从小鼠胼胝下区分离和培养成年神经干细胞

摘要

建立成体神经干细胞（aNSCs）的培养体系，有助于研究并应用aNSCs进行治疗。胼胝体下区（SCZ）最近被确认为成年小鼠中一种新的成神经细胞形成区域。本文介绍了SCZ来源的aNSCs的分离、扩增和分化方法。

摘要

成年神经干细胞（aNSCs）可用于受损脑组织的再生。aNSCs具有分化并增殖为三种细胞类型的潜能：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。鉴定aNSC来源的区域并表征其特性，对于aNSCs的潜在应用及其在神经再生中作用的阐明至关重要。胼胝下区（subcallosal zone, SCZ）位于白质与海马之间，近期研究报道该区域含有aNSCs，并能持续产生神经前体细胞。来自SCZ的aNSCs中仅有少量比例分化为神经元，大多数细胞则分化为胶质细胞，如少突胶质细胞和星形胶质细胞。这些细胞被认为在治疗创伤性皮质损伤方面具有潜在应用价值。本方案详细描述了从成年小鼠脑组织中分离获取SCZ-aNSCs的操作流程。使用间隔为1 mm的脑组织切片矩阵，以获得包含SCZ的冠状脑片，并精确地从全脑中解剖出SCZ区域。SCZ组织片段首先进行神经球培养。一个完善成熟的培养体系不仅有助于验证这些细胞的特性，还可促进对NSCs的深入研究。神经球培养系统是评估细胞增殖能力及富集真正NSCs的有效工具。此外，单层培养也是一种 体外 用于检测增殖与分化的系统。值得注意的是，该培养系统为神经干细胞（NSCs）提供的环境比神经球培养系统更为均一。因此，利用特定脑区，这些培养系统将有助于拓展我们对成体神经干细胞（aNSCs）及其治疗应用的认识。

引言

神经干细胞（NSCs）具有自我更新和多向分化潜能的特性。为验证这些特性，神经球培养体系已被广泛应用。该体系建立于20世纪90年代初，现已成为标准的干细胞培养体系。¹根据自我更新能力的不同，神经干细胞（NSCs）在悬浮培养中持续增殖并形成细胞团。细胞数量和神经球的大小通常被认为与NSCs的增殖特性密切相关。单层培养也广泛用于NSCs的维持和分化。与神经球培养相比，单层培养体系能够更均一地维持和扩增NSCs。²这两种成熟的培养体系有助于对aNSCs的特性进行表征 体外.

神经干细胞（NSCs）存在于大脑的不同区域，例如侧脑室的室下区（SVZ）和海马体的颗粒下区（SGZ）。^3-5尾侧皮层下白质中的胼胝下区（SCZ）被认定为一个新的神经发生区域^6-8最近有报道称，精神分裂症患者来源的神经干细胞（SCZ-aNSCs）在治疗创伤性脑损伤方面具有潜在疗效。⁹与其它神经发生区域相比，SCZ 位于皮层下白质区域。在人脑中，皮层下白质所占区域大于小鼠脑中的相应区域。¹⁰因此，利用SCZ-aNSCs的特性进行研究具有重要意义 体外 培养体系对于促进这些细胞在神经再生中的潜在应用至关重要。需要精确分离目标脑区，以排除含有活跃或静止状态神经干细胞的非目标区域可能带来的污染。例如，在非神经发生区域的成体神经干细胞可在脑损伤情况下或....

方案

1. 材料与培养基的准备

1. 解剖和分离SCZ时，用铝箔包裹脑组织切片模具、双刃剃须刀片和镊子，然后通过高压灭菌进行消毒。
2. 准备50 ml冷的PBS缓冲液，用于清洗整个小鼠脑组织。
3. 设置解剖显微镜，并准备好脑组织解剖所需的手术器械（已灭菌的剪刀和镊子）以及SCZ分离所需的工具（1 ml注射器、30 G针头、脑组织切片模具和精细镊子）。
4. N2培养基的配制：
   1. 使用F-12/DMEM（含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠）培养基，添加2% B27、1% N2补充剂和1%青霉素-链霉素。
      注意：生长培养基由N2培养基和生长因子组成（20 ng/mL纯化的表皮生长因子（EGF）和20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF2））。
5. 准备消化缓冲液（含40单位/ml木瓜蛋白酶、2.4单位/ml中性蛋白酶II和2%青霉素-链霉素的PBS溶液），用于组织消化。
6. 包被培养板和盖玻片的准备：
   1. 配制聚-L-鸟氨酸（PLO；0.01%）和层粘连蛋白（laminin；10 µg/ml，溶于DH₂O中）。为包被6孔板（用于单层培养维持SCZ-aNSCs）或18 mm盖玻片（用于免疫染色），将板或盖玻片于4 °C下与PLO孵育过夜，随后用DH₂O洗涤3次。最后一次洗涤后让培养板和盖玻片自然干燥。

结果

定义未知神经发生区域aNSCs的培养体系对于理解这些细胞及其在脑修复中的潜在应用至关重要¹²已知不同发育阶段或不同区域的神经干细胞（NSCs）表现出不同的特性^3,4最近有报道称，源自精神分裂症（SCZ）的细胞表现出不同的神经元分化潜能。 体内 和 体外 与SVZ来源的细胞相比^7-9因此，为了精确分离每个神经发生区域，使用1 mm脑切片矩阵对包含SCZ的脑组织切片进行解剖图1A）。经过8天的生长因子培养后，源自SCZ的aNSC可形成神经球，这些细胞可在其中进一步维持培养。图1B).

由于神经球中的部分神经干细胞（NSCs）可能自发分化¹³，单层培养体系也有助于维持SCZ-aNSCs相对均一的细胞群体。生长因子和胰蛋白酶等解离酶难以有效渗透至神经球内部^14,.......

讨论

本文详细描述了一种从小鼠成年脊髓中央管区（SCZ）分离神经干细胞（NSCs）并对其进行长期维持以用于多种应用的实验方案。建立该体系有三个关键步骤： 体外 用于纯化和扩增SCZ-NSCs的培养系统。首先，必须确保从其他潜在的神经发生区域中精确分离出SCZ区域。图1B）。使用1 mm间隔的脑组织切片矩阵获取包含SCZ区域的厚而精确的脑片，然后用细针将SCZ从其他皮层区域进行显微解剖分离。图1A）。当邻近组织（如大脑皮层）的非神经干细胞与精神分裂症相关神经干细胞（SCZ-aNSCs）共同培养时，会发生灾难性细胞死亡，从而对SCZ-NSCs的存活率和成球能力产生负面影响^16-18,22尾部脊髓室管膜下区（位于前囟后方2-3 mm）被证实是获得 distinct SCZ-aNSCs 的最佳区域。其次，在收获和传代过程中采用适当的酶处理对于获得高产量的细胞至关重要。与胰蛋白酶相比，Dispase II 和木瓜蛋白酶在分离 aNSCs 时效果更佳。使用解离缓冲液而非胰蛋白酶进行细胞传代解离，可提高细胞存活率。¹⁹机械解离和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基成分
DMEM/F12	Gibco	11320-033	+L-谷氨酰胺，+碳酸氢钠
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
N2 补充剂	Gibco	17502-048
B27添加剂	Gibco	17504-044
<强>生长因子
bFGF	R&研发	233-FB
EGF	Gibco	PHG0313
<强>缓冲液
PBS（10×）	BIOSOLUTION	BP007a	1倍稀释
HBSS	Gibco	14175-095
<强>解离缓冲液
Dispase II	罗氏	04-942-078-001
木瓜蛋白酶	沃辛顿	3126
Accutase	ICT	AT-104
<强>工具
精细镊子	WPI	555229F
剪刀	Storz	E3321-C
脑组织切片矩阵（1 毫米）	真实世界数据	68707
双面剃须刀片	DORCO	ST-300
30 G 针头	SUNGSHIM	N1300
<强>材料
15 ml 离心管	SPL	50015
50 ml 离心管	SPL	50050
35 mm 培养皿	SPL	10035	培养皿
100 mm 培养皿	SPL	10090	培养皿
盖玻片（18 mm）	Deckglaser	111580
12孔板	SPL	32012	非包被
6 孔板	SPL	32006	非包被
<强>包被材料
PLO	Sigma	P4957	0.01%
层粘连蛋白	Gibco	23017-015	10 mg/ml
<强>一抗
Nestin	默克密理博	MAB353	小鼠（1:1,000）
EGFR	Abcam	ab2430	兔 (1:1,000)
DCX	Santa Cruz	SC8066	山羊（1:500）
Tuj1	Sigma	T2200	兔 (1:2,000)
GFAP	Invitrogen	13-0300	大鼠（1:1,000）
O4	Millipore	MAB345	小鼠（1:500）
BrdU	Abcam	ab6326	大鼠（1:500）
<强>二抗
抗小鼠 488	Invitrogen	A21202	1:500
抗小鼠 Cy3	Jackson	715-165-151
抗小鼠 647	Jackson	715-606-150
抗兔488	Alexa	A21206
抗兔Cy3	Jackson	711-165-152
anti-rabbit 647	Jackson	711-605-152
抗山羊488	Alexa	A11055
抗山羊Cy3	Jackson	705-165-147
抗山羊647	Invitrogen	A21447
抗大鼠 488	Invitrogen	A21208
抗大鼠Cy3	Jackson	712-166-150
抗大鼠 647	Jackson	712-605-153
<强>免疫染色材料
BSA	默克密理博	82-100-6	PBS 中含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100
Triton X-100	usb	22686
4% PFA	Biosesang	P2031
Hoechst33342	Life Technology	H3570	用于染色细胞核的染料