本方案描述了用于在水中观察金纳米颗粒（AuNPs）纳米尺度动态过程的液体流动样品 holder 在扫描透射电子显微镜中的操作方法。
本文内容
摘要
摘要
利用透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）中装配于样品台内的微流控腔室，可对完全浸没在液体中的样品进行纳米级空间分辨率的研究。该微流控系统由两片支撑着薄氮化硅（SiN）膜窗的硅微芯片组成。本文描述了样品加载和数据采集的基本步骤。最重要的是确保液体腔室正确组装，从而形成一层薄液体并实现真空密封。本实验方案还包括在样品加载过程中必须执行的一系列检测步骤，以确保组装正确。一旦样品装入电子显微镜，需测量液体层的厚度。组装不当可能导致液体过厚，而液体过薄则可能表明液体缺失，例如气泡形成的情况。最后，本方案还说明了如何进行成像以及如何研究动态过程。实验对含有金纳米颗粒（AuNPs）的样品分别在纯水和生理盐水中进行了成像。
引言
传统的扫描透射电子显微镜（STEM）受限于适合分析的样品类型，特别是适用于高真空环境的干燥固体样品。然而，许多科学与技术问题涉及液体环境中纳米尺度的材料与过程。如今，利用一种新型概念，可以对完全浸没在液体中的样品进行STEM研究，该方法通过在透射电子显微镜（TEM）和STEM样品 holder 中组装微流控腔室来实现1。这一新发展的技术正变得日益流行，因为它为多个研究领域的重要过程提供了新的见解，包括纳米颗粒的生长、溶解和聚集过程2,3,4,5,6。不仅可以研究金属材料，还可用于生物矿物7和生物系统的研究8,9,10,11。液相STEM的样品加载与图像采集不同于干燥样品的STEM操作，需要遵循特定的实验流程，并接受专门培训。
微流控系统由两块硅微芯片组成，这些芯片支撑着氮化硅（SiN）薄膜窗，该薄膜窗对能量为200 keV的电子束具有透射性12（见图1A）。有关这些微芯片的尺寸和操作细节可参见其他文献12,13。样品通常包含纳米尺度的物体。本文中我们观察的是金纳米颗粒（AuNPs）。AuNPs固定在上层窗口（相对于向下传播的电子束而言）或悬浮在液体中。STEM中的纳米级空间分辨率是通过将电子束扫描至AuNPs上，并使用环形暗场（ADF）探测器收集透射的散射电子而获得的9。这两块微芯片被放置在液体流动透射电镜样品杆尖端的一个小槽内1（该样品杆既可用于STEM也可用于TEM，但通常称为TEM样品杆）。其中一块微芯片包含一个间隔层，从而在两块微芯片之间形成一个液体腔室。位于两块微芯片两侧的O型圈为液体腔室提供真空密封13（见图1B）。
本文旨在演示样品加载和数据采集的基本步骤，以便感兴趣的用户能够轻松掌握这一新兴技术。虽然使用了某特定公司提供的系统，但本方案同样适用于其他公司的系统。该技术比传统的透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）更为复杂，在使用液体样品台系统时必须考虑多个实际因素13。其中最重要的是确保液体腔室正确组装，从而形成一层薄液并实现真空密封。因此，在液体流动型透射电镜样品台的制备与组装过程中，必须保持操作环境清洁，避免产生灰尘。特别是O型圈和两片硅微芯片必须完全无污染。即使微芯片上存在微小的尘粒，也可能显著增加组装后样品池的厚度，从而导致无法获得有效的空间分辨率。真空密封至关重要，以确保实验结束后不会对电子显微镜造成污染或损坏。本方案详细描述了样品加载流程以及若干必要的测试步骤。电子显微镜的操作本身较为直接，但相比固体样品的显微观察，需要额外执行一些步骤。随着液体厚度的增加，更多电子会被液体吸收和散射，因此测量液体厚度至关重要。最后，本方案还说明了如何进行成像以及如何研究动态过程。
图1：用于扫描透射电子显微镜（STEM）的液体流动池。（A）组装好的液体池示意图。两个带有氮化硅（SiN）薄膜窗口的硅微芯片被置于两个O型圈之间。液体被封闭在SiN薄膜之间，从而与电子显微镜中的真空环境隔离。聚焦的电子束对样品进行扫描，通过散射电子获得衬度。金纳米颗粒（AuNPs）在SiN薄膜表面的液体中被固定，但也可能在液体中移动。（B）两个微芯片与O型圈堆叠结构的示意图侧视截面图。请点击此处查看该图的放大版本。
方案
图 2：Si 微芯片的清洗流程。（A）两个烧杯中分别加入 40–60 mL 丙酮和乙醇。（B）将 Si 微芯片放入盛有丙酮的烧杯中，氮化硅（SiN）膜一侧应朝上。两个微芯片的反射影像清晰显示其背面的凹槽结构。（C）2 分钟后，将 Si 微芯片转移至盛有乙醇的第二个烧杯中。再经过 2 分钟后，将微芯片转移至洁净室擦拭纸上进行干燥。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：液体流动透射电子显微镜（TEM）样品 holder 设备。（A）带有塑料管路和用于液体流动的注射器的液体流动TEM holder。（B）从holder轴上取下的液体流动TEM holder尖端、液体池腔室的盖子、O型圈以及两个硅微芯片。管路从尖端左侧伸出。（C）液体池腔室，显示一个O型圈及用于放置微芯片的插槽。（D）置于无尘表面（铝箔）上的不同类型的镊子。（E）带有两个O型圈的液体池腔室盖子。（F）两个带有SiN膜窗的硅微芯片。左侧：无间隔层的样品微芯片；右侧：带有200 µm间隔层的覆盖微芯片。（G）微流控泵系统。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 微芯片的制备
1. 微芯片的清洗
- 在带有粉尘过滤器的层流罩内准备一个低粉尘水平的工作区域。
- 使用无纤维纸巾和纯乙醇清洁用于放置和转移微芯片的光学显微镜载玻片。将载玻片放置在培养皿内的洁净室纸巾上。
注意：切勿使用工业级乙醇。 - 选择5个基础微芯片（无垫片）用于样品放置，另选5个带有200 nm厚垫片的微芯片。
注意：窗口尺寸为20 × 400 µm2，氮化硅（SiN）膜厚度为50 nm。由于尺寸存在一定公差，建议使用光学显微镜检查实际尺寸。 - 使用碳涂层镊子从储存盒中取出微芯片，并将其放置在载玻片上。应牢固但小心地夹住微芯片的长边。操作时始终确保氮化硅膜面朝上。
注意：避免触碰上方脆弱的氮化硅膜。操作微芯片时需格外小心，防止其锋利边缘破裂，以免产生硅颗粒残留在芯片表面或导致后续泄漏。
注意：可在（廉价的）模拟微芯片上练习从粘性表面取下芯片的操作流程。 - 将微芯片放置在培养皿内的洁净室纸巾上。盖上皿盖，并转移至通风橱内。
注意：涉及丙酮的操作均在通风橱中进行，以确保化学安全。 - 取两个120 mL玻璃烧杯。分别用丙酮和乙醇冲洗烧杯以清洁之。向第一个烧杯中加入40–60 mL丙酮，另一个加入40–60 mL乙醇。
注意：本步骤中也必须使用HPLC级液体。 - 将微芯片转移至盛有丙酮的烧杯中，以去除保护性抗蚀层。用手轻轻晃动烧杯，充分冲洗微芯片，但需注意避免微芯片翻转——见图2。
- 2分钟后，取出微芯片并迅速转移至盛有乙醇的烧杯中。用手轻轻晃动乙醇烧杯持续2分钟，以彻底清除抗蚀层残留物。用铝箔覆盖烧杯，然后转移至层流工作台。
注意：转移过程中切勿让微芯片干燥，以防杂质沉积。 - 从烧杯中取出微芯片，放置于新的洁净室纸巾上。静置数分钟使其干燥，随后将微芯片转移至培养皿中的光学显微镜载玻片上。
注意：湿润的微芯片在释放时容易翻转、倒置或粘附在镊子上。可通过将微芯片轻压在滤纸上，并水平方向移开镊子来避免此问题。 - 盖上培养皿，将微芯片转移至等离子清洗仪。
- 将带有微芯片的载玻片放入等离子清洗仪中。运行5分钟清洗程序，使氮化硅膜表面变为亲水性并去除碳氢化合物。
注意：本实验所用等离子清洗仪的推荐参数为：70 mTorr气压，O2气体流速11.5 sccm，Ar气体流速35.0 sccm，50 W正向射频（RF）功率，5 W RF范围，最大反射RF功率。任何能够诱导表面电荷的等离子体设备均可适用。 - 将带有微芯片的载玻片放回培养皿中，盖上盖子，并转移至光学显微镜。
- 在光学显微镜下检查微芯片是否存在膜破裂或残留颗粒。特别注意窗口区域，检查是否有小斑点提示膜破裂。弃用膜已损坏的微芯片。
- 盖上培养皿，存放于层流工作台中。
2. 微芯片上样品的制备
- 通过混合少量含有30 nm直径、柠檬酸盐稳定的AuNP的储备液（浓度约为3 M），制备水相AuNP溶液（柠檬酸盐稳定）。
- 将微芯片放置于运输盒内的清洁粘性表面上，用于液滴施加/样品沉积。
- 取1–2 µL样品溶液滴加至新近经等离子体清洗的微芯片的SiN膜一侧（使用无间隔层的微芯片），并在层流洁净台中让溶液自然干燥。
注意：可重复此步骤以增加SiN膜上AuNP的浓度。 - 向微芯片上施加1 µL去离子水，以去除盐分和/或表面活性剂。30秒后，用滤纸小心吸除水滴。将微芯片置于层流洁净台中自然晾干。
注意：已有足够数量的AuNP牢固吸附在微芯片表面，不会被水洗脱。 - 制备好的样品微芯片应在4小时内使用，因为SiN膜的亲水性表面特性会随时间减弱，可能导致实验过程中液体行为发生变化。注：详见讨论部分。
- 使用密闭运输盒进行微芯片的储存与转移。
2. 液体流动透射电镜样品台的制备
- 清洁液体流动透射电镜样品杆
- 使用丙酮和乙醇在超声波清洗仪中清洗所有将与真空部件接触的工具（镊子和螺丝刀），然后将其放置在工作台面上铺好的新铝箔所提供的无尘表面上。操作时佩戴手套，以避免污染液体流动型透射电镜样品 holder。
注意：如果能够确保工具洁净，适用于真空部件操作，则无需对工具进行彻底清洁。如果操作人员能够操作设备时避免接触真空部件，则可以不戴手套。 - 将液体流动透射电镜样品 holder 置于双目光学显微镜下，使含有液体腔室的 holder 尖端可见。参见 图3.
- 取下持针器尖端的盖子，并将其放置在无尘表面上。
注意：钛盖对镊子等较硬材料造成的划痕较为敏感。建议对敏感材料使用聚合物涂层镊子。 - 准备至少1-2 mL的纯水（HPLC级）。
注意：如果未使用HPLC级液体，建议检查所用液体是否含有微粒，以免可能导致流路系统堵塞；必要时使用微孔滤膜过滤液体。 - 使用玻璃注射器（1 mL）将0.5 mL纯水注入整个流路系统。建议使用微流控注射泵系统。使用移液器和/或滤纸清除液体池腔室中排出的液体。检测所有管路的液体流动情况。随后使用滤纸和/或移液器干燥支架尖端。
- 使用光学显微镜检查夹持器尖端是否清洁且干燥。如有需要，用水或乙醇清洗夹持器尖端，以去除干燥溶液残留的固体物质。同时清除灰尘颗粒或纤维残留物。使用镊子小心移除这些杂质，避免划伤钛表面。同时检查O形圈凹槽内部，并用一小块洁净室专用纸巾去除液体残留物。
注意：如果采用此步骤后支架仍未清洁，建议将针头从支架上取下，先在丙酮中超声清洗2分钟，再在乙醇中超声清洗2分钟。 - 在光学显微镜下检查提示的所有其他部件（O型圈、盖子和螺丝），并清除灰尘和纤维 等等...
注意：偶尔也需要清除来自螺丝或硅微芯片的小碎片。如有必要，可用HPLC级乙醇短暂清洁真空部件。盖子和螺丝可采用超声清洗，方法与清洗探针头相同。应避免频繁将O型圈置于乙醇中，因其可能随时间推移导致O型圈变脆，从而降低其真空密封性。该系统通常无需使用真空润滑脂，但若出现密封问题，可使用真空润滑脂。 - 将O型圈重新插入支架相应凹槽中，并检查其是否就位且在凹槽任何一侧均无突出。
- 在装载样品前，保持液体流动型透射电镜样品 holder 无尘例如， 用铝箔覆盖。
- 使用丙酮和乙醇在超声波清洗仪中清洗所有将与真空部件接触的工具（镊子和螺丝刀），然后将其放置在工作台面上铺好的新铝箔所提供的无尘表面上。操作时佩戴手套，以避免污染液体流动型透射电镜样品 holder。
- 组装液体流动透射电镜样品台
注意：以下步骤描述了将微芯片以最适合STEM成像的方向装载到样品 holder 中的操作流程。在此配置下，带有样品的基底微芯片在转移至显微镜后将位于上方。参见 图4在透射电子显微镜（TEM）中，相对于向下传播的电子束，液体池底部可获得最高的空间分辨率。因此，微芯片应反向安装。- 使用弯头镊子夹住样品微芯片的长边，将其放入液体流动透射电镜样品杆尖端的槽（口袋）内，确保氮化硅面朝上。利用双目光学显微镜检查微芯片在槽内的位置是否正确。
注意：如果微芯片下方的O形圈未正确安装，微芯片可能会从插槽中突出。 - 放置一滴 0.3 µL 使用微量移液器吸取过滤后液体，用于样品微芯片上的实验。如有必要，可用镊子将微芯片固定到位，因为液滴的毛细作用力可能将微芯片从卡槽中拉出。
- 使用倒置的弯头镊子取第二个微芯片（带间隔层的芯片）。小心地将微芯片倒置，然后将其放入基底微芯片的槽口中。
注意：该步骤需迅速完成，以避免样品微芯片上的液滴干燥。 - 使用双目光学显微镜观察，同时在样品 holder 尖端下方移动一块反光材料，以检查其位置是否正确。两个微芯片必须精确平行对齐，以实现氮化硅窗口的最佳重叠。
注意：如果窗口未重叠，可用镊子尖轻轻推动微芯片一侧进行重新定位，但应避免过度移动微芯片，因为氮化硅（SiN）膜容易损坏。部分微芯片采用交叉构型（一个微芯片的窗口与另一个微芯片的窗口相互垂直），该构型有助于两个微芯片的对齐，但会减小电子显微镜下的视野范围。 - 用镊子夹住样品室盖的正面，将其翻转倒置。在不触碰微芯片的情况下，将盖子的背面放在尖端上。缓慢打开镊子，使盖子仅由镊子的下支支撑。小心地将盖子放下，使其落在两个微芯片上。移除镊子。
- 重新检查两个微芯片窗口的对齐情况。如有必要，取下盖板，调整微芯片的位置，然后重新放置盖板。
- 将螺丝放置并固定在通常位置。检查两个窗口的对齐情况。如有必要，再次卸下螺丝并调整微芯片。
注意：切勿将螺钉拧得过紧，以免造成损坏。当螺钉刚好拧紧时，即可形成真空密封。 - 通过以设定流速启动系统内的液体流动，检查密封性 4 µL/min如果尖端两侧均未观察到泄漏，则表明真空密封性良好。
- 将支架转移至真空泵站，检查真空密封性。真空度应至少达到 10-5 5 分钟抽气后达到 mbar。
注意：建议在使用前先用假支架测试泵站。 - 将 holder 转移至其外壳内的电子显微镜中，以防止其沾染灰尘。
注意：每个商用支架均配有外壳。
- 使用弯头镊子夹住样品微芯片的长边，将其放入液体流动透射电镜样品杆尖端的槽（口袋）内，确保氮化硅面朝上。利用双目光学显微镜检查微芯片在槽内的位置是否正确。
3. 液体中样品的扫描透射电子显微镜观察
- 为扫描透射电子显微镜调整参数
注意：本方案中所述电子显微镜的操作基于用户手册中提供的标准操作流程。本方案描述了针对液体样品数据采集时，超出标准流程所需的详细步骤。- 启动已对准STEM模式的显微镜。在样品 holder 中插入测试样品，该样品为载有金纳米颗粒（AuNPs）的薄碳膜。调整STEM显微镜的参数设置如下：通过选择4C的束斑尺寸和物镜光阑，将探针电流设定为0.18 nA，电子束的会聚半角设定为20 mrad。 30 µm选择8 cm的相机长度。
- 记录荧光屏上显示的电流密度，此时 ADF 探测器已插入。取出样品台。
注意：此电流值后续将用于估算液体的厚度。 - 以纯水开始液体流动。流速不得超过 2 µL/min.
- 将液体流动透射电镜样品杆插入电子显微镜并开始抽真空。检查前级真空室的真空指示以及抽真空持续时间。如果真空度达到标准，且抽气过程的持续时间未超过正常抽真空时间（约1分钟）的两倍，则插入样品杆。
- 当主样品室的真空度达到允许开启的范围时，打开束阀。按下 ADF 按钮，插入 ADF 探测器。
注意：本方案中提到的ADF探测器位于电子显微镜的磷屏上方。 - 将显微镜设置为连续图像采集模式，图像尺寸为 512 x 512 像素，像素驻留时间为 2 µs，放大倍数为20,000。通过在x和y方向上移动样品台，寻找氮化硅窗口。
注意：微芯片会阻挡穿过样品射向检测器的电子；信号仅在氮化硅（SiN）位置可见。参见 图5有时，通过观察荧光屏可以更容易地找到氮化硅窗口。 - 找到窗口后，调节对比度和亮度设置（使用相应的旋钮），使窗口边缘可见。通过按样品台的 x 和 y 平移按钮，将边缘移至视野中央。按下物镜的复位按钮。
注意：由于液体中的强散射效应，与真空样品相比，亮度必须大幅降低。 - 通过调节样品台的垂直位置（z轴平移），对氮化硅窗口边缘的尖锐角进行粗调焦。通过旋转样品台，确认样品位置处于齐焦高度 5° 并将其旋转回原位。在低倍镜下，样品的特征和氮化硅窗口的角落不应发生移动。
注意：若不使用显微镜，请关闭光束阀门，因为长时间在相同位置扫描可能导致样品损伤并产生气泡 - 根据需要调整垂直位置，使窗口边缘再次位于视野区域的中央。使用软件的存储按钮保存载物台的位置。
- 移动到一个位置，使高对比度的微小碎片或其他物体（例如， 通过在 x 和 y 方向上移动载物台，观察是否存在 AuNPs。调节物镜的焦距，使所有物体均清晰聚焦。
- 记录通过操作软件可见的荧光屏上测得的电流密度，该值表示穿过液体样品 holder 以及 ADF 探测器开口的透射电流。使用公式 1 计算液体池的厚度。仅当液体层厚度已确定且未超过 3 µm.
注意：可利用以下公式，通过有无样品时测得的电流密度之比来确定液体池的厚度14
公式 1
与 tSiN 非晶硅氮化物膜的厚度以及 t水 水层的厚度。平均自由程长度达到 lSiN = 0.79 µm SiN、= 和 l水 = 3.0 µm 水对探测器开口半角为35 mrad的情况14. - 在较低放大倍数下仔细观察液体，确保无气泡存在。可通过使用连续的液体流和低于0.5 nA的探针电流来防止气泡产生。
- 在 x 和 y 方向上移动载物台，直至找到包含至少 20 个 AuNPs 的区域。将图像尺寸设置为 1,024 × 1,024 像素，像素驻留时间设置为 19 µs，将放大倍数调至400,000。按下采集按钮，获取附着在SiN膜上的AuNPs图像。
注意：一旦获得的图像中金纳米颗粒（AuNPs）具有明显对比度和清晰边缘（参见 图6），可以确定实验设置正确。若出现意外问题，不得继续实验，必须先查明并解决原因。
- AuNPs溶解的扫描透射电子显微镜观察
- 从显微镜上取下液体流动透射电镜样品 holder，并停止液体流动。
- 在玻璃注射器中配制至少1 mL的0.1 M氯化钠溶液，使用HPLC级水。
- 调节流速系统至某一速度 20 µL/min 用0.3 mL生理盐水冲洗整个流路系统。使用滤纸收集管路另一端排出的液体。随后，重新调节流路系统至 2 µL/min.
- 使用双目光学显微镜检查氮化硅窗的完整性。若未观察到泄漏，将液体流动型透射电镜样品杆重新插入显微镜中。
- 检查预真空室的真空指示及抽真空持续时间。如果真空度达到标准，且抽气过程的持续时间未超过正常抽真空时间（约1分钟）的两倍，则插入支架
- 使用存储的载物台位置，将显微镜载物台移回先前位置。将显微镜设置为连续图像采集模式，图像尺寸为512 x 512像素，像素驻留时间为 2 µs，放大倍数为20,000倍。按照步骤3.1.7-3.1.9所述，调节对比度、亮度、焦距和等中心高度。
- 通过在 x 和 y 方向上移动载物台来找到感兴趣的区域。将图像大小设置为 1,024 × 1,024 像素，像素驻留时间设置为 2 µs，放大倍数设为500,000。在前一幅图像记录完成后，手动按下采集按钮，连续记录一系列STEM图像。
注意：一旦电子束开始扫描样品，金纳米颗粒（AuNPs）即开始溶解。照射区域外的颗粒不受影响，可立即进行观察。时间戳保存在图像头部信息中。也可使用软件将一系列图像自动采集合成为视频。
- 实验后拆卸和清洁透射电子显微镜样品杆
- 当液相透射电镜实验完成后，将样品杆从电子显微镜中撤出，清洗管路、液相腔室及其组件，以去除可能影响后续实验的固体颗粒或残留盐分。
- 稍微松开后部螺丝，使其仍固定在槽内，但可轻松取下盖子。松开前部螺丝，将其取下并置于无尘环境中。
- 取下盖子并将其置于无尘环境中保存。
- 从口袋中取出两枚微芯片。通过将其小心浸入水中或实验剩余溶液中进行分离。将微芯片放置于滤纸上，使氮化硅膜面朝上，在空气中自然干燥，以备后续分析。
- 取下O形圈，并用HPLC级水清洗相应的凹槽。将O形圈存放于无尘环境中。
- 使用玻璃注射器（5 mL）冲洗所有管路（输入和输出管路），每根管路各用5 mL HPLC级水冲洗。在透射电子显微镜样品 holder 尖端下方放置一个小烧杯以收集液体。冲洗完成后，使用移液器和/或滤纸将液体腔室中残留的液体移除。
- 检查透射电镜载网 holder 的尖端，清除硅微芯片的碎边、纤维或灰尘等残留物。如果仍可见盐结晶，需重复清洁步骤。将 O 型圈放回其凹槽中。
- 将透射电镜样品杆及其组件存放在无尘环境中。
- 替代步骤3.2的方案：运动中金纳米颗粒的扫描透射电子显微成像
注意：研究液相中金纳米颗粒（AuNPs）的运动需要采用不同的组装方法。- 省略步骤1.2。在执行步骤2.2、将金纳米颗粒（AuNPs）装入透射电镜样品 holder 前，立即将其加载到硅微芯片上。在整个操作过程中，始终使样品保持在液体层覆盖之下，以避免AuNPs强烈吸附于SiN膜表面。本方案其余步骤保持不变。在步骤3.2.6中获取一系列扫描透射电子显微镜（STEM）图像。
图 4：液体流动透射电镜样品台的组装。（A）液体池腔室，其中已将较小的O形圈放入其凹槽内。插图为顶视图。（B）将基底微芯片插入对应的插槽中。插图为侧视图，角度使得可通过光反射观察到微芯片。（C-D）向微芯片上添加一滴溶液。（E-G）盖片微芯片的放置。（H-I）液体池腔室盖子的安装。（J）用两颗螺丝固定盖子。（K）组装完成的液体流动透射电镜样品台。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：利用扫描透射电子显微图像进行初始定位与聚焦。（A）为定位氮化硅（SiN）窗口，需将样品台移向信号最亮的区域。靠近窗口区域的硅芯片足够薄，允许部分电子穿过。（B）聚焦后的氮化硅窗口边缘，部分金纳米颗粒（AuNPs）在较暗（散射较少）的氮化硅薄膜窗口上呈现明亮影像；而芯片边缘因过度散射而显得明亮。（C）聚焦操作在氮化硅窗口的角落进行。图像依次显示欠焦、最佳焦距和过焦状态。请点击此处查看该图的放大版本。
结果
使用液体流动透射电镜样品台研究了金纳米颗粒（AuNPs）在液体中的行为。在纯水中，AuNPs稳定地固定在氮化硅（SiN）膜上，并利用液相扫描透射电子显微镜（STEM）实现了纳米级分辨率成像（图6）。对于强散射的金材料，获得了优异的对比度。在干燥测试样品上测得荧光屏上的电流密度为20 pA/cm²，而插入液体流动透射电镜样品台后，电流密度降至8 pA/cm²。根据公式1计算，水层厚度twater = 2.4 ± 0.5 µm，远大于基于200 nm间隔层厚度的预期值。尽管如此，该厚度仍足以实现对AuNPs的纳米级空间分辨率成像。液体层厚度超过200 nm的设定值，是由于SiN膜的鼓胀、微芯片表面不平整以及微芯片上存在杂质所致。
对于纯水，金纳米颗粒（AuNPs）在成像过程中能保持其形状16，尽管电子束与水相互作用产生的活性辐射分解产物（e-aq、H•、H+、OH•）可能氧化单个金原子，导致AuNPs形状改变15。然而，在另一项实验中使用液体流动系统引入氯离子后，AuNPs的稳定性发生了变化。氯离子能够以四氯金酸根（AuCl4-）的形式稳定被氧化的金原子。图7显示，在STEM成像的时间序列中，AuNPs逐渐溶解，这与先前报道的结果相似16。在所用的电子剂量率下，溶解30 nm大小的AuNPs约需300秒。
在第三次实验中研究了金纳米颗粒（AuNPs）在水中的运动行为（图8）。实验前，对液体流动透射电镜样品台进行了清洗，以去除任何残留的盐分。与第一次实验不同，本实验采用了一种替代的样品制备方法，以实现AuNPs与氮化硅（SiN）膜之间更弱的结合14。具体操作中，将AuNP溶液滴加到硅微芯片上，并在溶液未完全干燥的情况下将其组装进液体流动透射电镜样品台。通过这种方式，在所使用的电子束剂量率下成像时，AuNPs容易从SiN膜上脱落。部分AuNPs从视野中移出，进入主体溶液；而其余的AuNPs则保留在视野内，靠近SiN窗口区域。观察到这些AuNPs发生了运动，并最终发生团聚。一段时间后，这些团聚体也从SiN膜上脱落，移出视野并进入溶液中。
图6：直径为30 nm的金纳米颗粒（AuNPs）位于纯水层顶部的扫描透射电子显微镜（STEM）显微图像。 所示图像为原始图像的选定区域。图像尺寸为1,024 × 1,024像素，像素驻留时间为19 µs，像素尺寸为0.73 nm，放大倍数为400,000X。因此，电子剂量为7.1 × 104 e-/nm²。在荧光屏上测得的电流密度为8 pA/cm2，据此计算出液体层厚度为2.4 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：盐水中金纳米颗粒（AuNPs）的扫描透射电子显微镜（STEM）时间推移序列图像。 （A-D）从时间推移的STEM图像序列中每隔30 s提取的图像。由于氯离子的存在，AuNPs在液体中逐渐溶解。像素驻留时间为2 µs，时间推移序列的帧时间为1.75 s，像素尺寸为0.44 nm，放大倍数为500,000X。每幅图像的电子剂量为1.2 × 104 e-/nm²。液体厚度为2.4 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：金纳米颗粒在纯水中运动的扫描透射电子显微镜（STEM）显微图像。（A）含金纳米颗粒（AuNPs）的氮化硅（SiN）膜，其中若干颗粒以箭头标出。（B）所选AuNPs的运动轨迹（见图 A）。部分AuNPs在成像期间移出视野。剩余的AuNPs沿SiN膜横向移动并开始聚集。当聚集体达到临界尺寸时，便从膜上脱离并移出视野。像素驻留时间为 1 µs，帧时间为 0.52 s，像素尺寸为 1.8 nm，放大倍数为 120,000X。每幅图像的电子剂量为 3.5 x 102 e-/nm²，液体厚度为 2.4 µm。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
所述方案能够实现液相中金纳米颗粒（AuNPs）的扫描透射电子显微成像（STEM），包括对动态过程的观察。液体流动型透射电镜载网支架的组装是一种易于掌握的技术。然而，在使用液体流动型透射电镜载网支架时，需考虑若干关键因素。例如，硅微芯片的破损边缘或O型圈上的大颗粒可能导致液体池泄漏。另一方面，大颗粒（>200 nm 例如， 硅膜上的灰尘或硅碎屑可能导致液体池厚度增加，从而引起成像对比度降低或空间分辨率下降，甚至可能导致氮化硅窗口破裂。尤为重要的是，盐分或其他化学物质的残留可能以非预期的方式影响实验结果。因此，必须在洁净无尘的环境中仔细进行样品制备和样品台组装的各个步骤。
液体池的厚度决定了可达到的分辨率以及所获图像的对比度17. 该厚度可通过位于两个硅微芯片之一上的间隔物进行调节。根据样品的尺寸，可实现不同厚度的液体池。在研究金纳米颗粒（AuNPs）时，可使用较小的间隔物（200–500 nm），而完整的真核细胞则需要最大达5 µm的较大间隔物。液体池的厚度还受到氮化硅（SiN）薄膜窗因液体池内部与周围真空之间的压差而发生凸起的影响。这种效应在较大的SiN薄膜窗中更为显著。因此，为尽量减小液体池的厚度，建议使用较小的SiN薄膜窗。若难以使两个小窗口完全重叠，可采用不同的基底微芯片将它们以交叉构型组装。其他替代构型可显著抑制凸起现象，其中包括使用一体式（monolithic）微芯片的结构18 或由支柱支撑的膜窗19，但这些方法在样品加载方面存在劣势。当前技术最具挑战性的问题之一是对液体厚度缺乏精确控制。通常，液体厚度远大于所用间隔片尺寸预期的厚度，正如本文所示。一些研究团队采用了封闭式液体池4,20,21,22；这些系统在空间分辨率方面具有一些优势，因为可以通过在液体中引入气泡来减小液层厚度。或者，可使氮化硅窗口破裂，从而形成更薄的液体层。第三，也可采用其他更薄的窗口材料封装样品（例如， 石墨烯23，也会产生比本方案所述系统所能实现的更稀薄的液体。然而，在那些系统中无法实现液体流动。
对于任何高 分辨率显微技术，都必须考虑若干实验因素。其中最重要的因素是电子束与液体或样品之间的相互作用。除了辐射损伤（这会限制许多固体样品所能达到的空间分辨率）24之外，液体样品还会受到电子束诱导产生的辐射分解产物的影响15,25。由于这些产物可能影响实验结果，因此严谨的数据解释和实验设计至关重要26。显微镜参数的设置应根据具体研究目标来选择。对于在较厚液体池中成像高原子序数（Z）的纳米颗粒，ADF STEM 更具优势；而透射电子显微镜（TEM）对低Z材料具有更好的对比度，通常成像速度更快，但需要更薄的液体层3。有时也可使用明场（BF）探测器对液体池进行成像，因为BF STEM在厚层中对低Z材料的成像更具优势27。随着液体池厚度的增加，需要更高的束流。然而，这也会提高辐射分解产物的浓度，并加剧辐射损伤。还应注意，在液体池非常厚的情况下（水层厚度>10 µm），ADF探测器中会出现对比度反转现象。
通过将样品台从显微镜上取下，并更换样品和液体，可在不同实验之间改变液体条件。除了改变盐浓度外，还可以通过引入不同的液体来轻易调节液体的其他性质（例如，可使用缓冲溶液以设定特定的pH值16，或引入有机溶液或其他添加剂）。此外，也可在样品台仍插入显微镜时，通过微流控系统注入液体来更换液体环境。然而，在这种情况下，无法确切知道样品处液体更换完成的具体时间点。值得注意的是，已有支持电极的微芯片可供使用，因此可开展纳米尺度的电化学实验28。
研究对象不仅限于水中的金纳米颗粒（AuNPs），还可利用上述方案研究多种样品，包括二氧化硅、二氧化钛和聚合物等。若颗粒运动过快，导致在采集过程中无法在图像中捕捉到其运动轨迹，可通过使用50%甘油与50%水的混合液，使溶液黏度降低一个数量级。
从上述几点可以看出，液相扫描透射电子显微镜（STEM）具有一系列优势、可能性，同时也存在一些劣势。在进行液相STEM实验时，需要考虑的最重要缺点包括：1）任何实验都会受到电子束与整个样品（包括被观察物体、液体以及氮化硅薄膜）之间动态相互作用的影响；2）样品处理过程繁琐，且由于样品或微芯片中常含有微米级颗粒，通常难以形成均匀的薄液层；3）液体的实际厚度往往与通过间隔层设定的目标厚度存在显著差异；4）空间分辨率和对比度在很大程度上取决于液体厚度，以及被观察物体与液体之间密度变化的差异。
目前，已有多种方法可实现对液体中物体的纳米级空间分辨率显微观察。非晶冰中的电子显微技术是一种强大的方法29，但其实验流程较为精细，且并非所有实验都允许将样品制备在冰中，无法进行时间分辨实验。X射线显微技术30,31原则上可以使用，但其空间分辨率有限，且在实验室中尚未广泛普及。液相中的原子力显微技术虽已建立，但仅适用于表面成像32,33,34,35。光学显微技术则不具备足够的空间分辨率。目前，液相电子显微技术似乎是直接观察液体中纳米尺度物体与过程的最强大技术。
液相透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）目前尚未成为常规的分析技术，仍处于发展阶段。需要考虑的参数数量众多，实验结果往往难以重复。此外，由于所研究的效应与电子束引发的其他过程相互交织，定量数据的获取尤为困难。本文所述的实验方案旨在标准化实验流程，从而涵盖实验中所有相关的基本要素。我们希望该方案能够促进这一新兴领域内实验工作的更好重复性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢E. Arzt通过INM提供的支持。本研究部分得到了2014年莱布尼茨竞赛的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双目光学显微镜 | Leica | M60 CMO | |
| 带球差校正器的扫描透射电子显微镜 | JEOL | ARM200F | |
| 液体流动透射电镜样品 holder | DENS Solutions | Ocean | |
| 微流控注射泵 | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| 等离子清洗仪 | Gatan | Solarus950 | |
| 化学品 | |||
| 丙酮，Rotisolv Plus HPLC级 | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| 水，chromasolv Plus HPLC级 | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| 乙醇，Rotisolv HPLC级 | Carl Roth | P076.2 | |
| 柠檬酸盐稳定的金胶体，直径30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| 材料 | |||
| 基底硅微芯片，含50 nm厚氮化硅薄膜，尺寸为20 µm × 0.40 mm | DENS Solutions | 适用于Ocean系统 | |
| 间隔层硅微芯片，含50 nm厚氮化硅薄膜，尺寸为20 µm × 0.40 mm，间隔层厚度为200 nm | DENS Solutions | 适用于Ocean系统 | |
| 微流控peek管路 | Upchurch Scientific | 1570 | |
| 塑料可更换尖头镊子 | |||
| （抗磁、耐酸不锈钢主体，ESD PVDF (SV) 尖头） | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| 带特氟龙涂层的弯头钢镊（EMS SA，带"PTFE"涂层） | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| 带特氟龙涂层的宽头钢镊（EMS 2A，带"PTFE"涂层） | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton 注射器，1 mL，气密型（型号 1001 TLLX SYR） | Hamilton | 81323 | |
| 洁净室用Sontara Micropure AP擦拭纸（224 × 224 mm） | DuPont | Sontara MicroPure |
参考文献
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
重印与许可
