使用扫描透射电子显微镜研究纳米大小的物体的动态过程中的液体

Summary

这个协议描述一种用于扫描金纳米粒子的透射电子显微镜中的水，如用于纳米动态过程的观察液流试样保持器的操作。

Abstract

完全嵌入在液体样品可在使用中用于透射电子显微镜（TEM）和干样品架组装的微流体腔室的扫描透射电子显微镜（STEM）纳米级的空间分辨率进行研究。微流体系统包括两个硅微芯片支撑薄氮化硅（SiN）膜的窗口。本文介绍样品加载和数据采集的基本步骤。最重要的是要确保液体隔室是否正确组装，从而提供了薄液层和真空密封。该协议还包括若干以确保正确装配样品加载期间执行必要的试验。一旦样品在电子显微镜装载，液体厚度需要被测定。不正确装配可能会导致过厚的液体，而太细的液体可以指示不存在液体，当形成的气泡等。最后，协议解释如何图像并如何动态过程进行研究。含有金纳米粒子样品都在纯水和在盐水中进行成像。

Introduction

常规扫描透射电子显微镜（STEM）是由适合于分析的标本，特别适合于在高真空放置的干燥和固体样品的范围的限制。然而，许多科学和技术问题涉及纳米级材料和在液体环境中的流程。完全嵌入在液体样品现在可以用STEM使用涉及在透射电子显微镜（TEM）和STEM ¹的试样夹持器组装的微流体室中的概念进行了研究。这种新开发的技术已经变得越来越流行，因为它提供了新的认识的各种研究课题重要过程，包括生长，溶解，和纳米颗粒^{2，3，4，5}的聚集方法^，6。不仅金属，也biominerals ⁷和生物系统可以研究^{8，9，10，11。}样品装载和图像获取用于液相干比为干燥样品的干不同并涉及需要专门的培训的协议。

微流体系统包括两个硅微芯片支承氮化硅（SiN）膜的窗户的透明，在200千电子伏的能量¹²的电子束的（ 见图1A）。尺寸和这些芯片的处理细节可以在别处找到^12，13。样品通常含有纳米级物体。在本文中，我们观察到黄金纳米粒子（纳米金）。该金纳米粒子在顶部窗口（相对于向下行进的电子束）固定或浮动在理趣ID。在STEM纳米级的空间分辨率是通过扫描电子束在金纳米颗粒和收集用环形暗场（ADF）的检测器⁹发送的散射电子获得。两个微芯片被放置在一个小槽在液体流动的TEM保持器^1（支架为STEM操作和TEM但作为TEM的保持器被称作）的前端。一项所述的微芯片的包含一个间隔件，以便在微芯片之间形成的液体隔室。在两个微芯片的两侧的O形环提供液体隔室^13（ 见图1B）的真空密封。

本文的目的是展示样和数据采集的基本步骤，让有兴趣的用户可能会发现很容易进入这个新兴的新技术。从特定的公司提供的系统被使用，但该协议也适用于其他公司的系统。该技术是比传统的TEM和STEM和一定数量的实际方面较复杂，必须与流体储存器系统¹³工作时被考虑。最重要的是要确保液体隔室是否正确组装，从而提供了薄液层和真空密封。因此，为了干净地工作，以防止液体流动的TEM支架的制备和组装过程中的粉尘的形成是非常重要的。具体地，O形圈和两个硅微芯片需要从所有污染。灰尘对微芯片的一个甚至小颗粒可能会严重增加组装的电池，其可以防止一个有用的空间分辨率的实现的厚度。真空密封是很重要的，这样没有污染或损坏将在实验后的电子显微镜离开了。本协议描述的加载过程和一些必要的测试。电子显微镜的操作很简单，BUt将其要求相比，固体样品的显微一些额外的步骤。随着液体的厚度，更多的电子被吸收并通过液体散射;液体厚度的测量是必要的。最后，协议说明如何图像并如何动态过程进行研究。

图1:冷却液流量为细胞扫描透射电子显微镜（STEM）。 （A）中组装的液晶单元的示意图。用氮化硅（SiN）膜Windows中两个硅微芯片位于两个O形环之间。由于液体被封闭在SiN膜之间，从而从电子显微镜的真空分开。聚焦电子束扫描过的样本。对比度是由散射电子获得的。金粒子（AuNPs）被固定在所述的SiN膜的液体内，但也可以移动的液体。 2微芯片与O形环的叠层的（B）的示意性侧视图的横截面。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

图2:硅微芯片的清洗程序。 （A）两个烧杯都充满了40-60毫升丙酮和乙醇各。 （B）中的硅微芯片被放置在填充有丙酮的烧杯中。随着原罪膜侧应朝上。使两个Si微芯片的反射清楚地显示在两个微芯片的背面槽。 （℃）2分钟后，将硅芯片被转移到填充有乙醇第二烧杯。再过2分钟后，将硅芯片被转移到洁净室组织进行干燥。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:液体流量透射电子麦克风roscopy（TEM）持有人装备。 （A）和塑料管和用于液体流的注射器的液体流的TEM持有者。 （B）的液体流的TEM保持器从支架轴移除的尖端，所述液体隔室，O型环，并且两个硅微芯片的盖子。油管从尖端的左侧突出。 （C）显示了一O形圈，对于微芯片放置槽的液体细胞室。 （D）在无尘表面（铝箔）不同的镊子。 （E）与它的两个O形圈的液体电池仓盖。 （F）两个硅微芯片与氮化硅薄膜窗。左:无间隔采样芯片;右:封面芯片具有200微米的垫片。 （G）的微流体泵系统。 请点击此处查看该figu的放大版本回覆。

1.微芯片的制备

1.微芯片的清洗

1. 准备工作区在与尘埃粒子过滤器的层流罩低尘的水平。
2. 清洁与安置和微芯片的运输无纤维组织及纯乙醇光镜搏命。放置在培养皿洁净室组织载玻片。
   注:避免使用乙醇技术在任何时候都。
3. 选择样本放置5基芯片（没有隔离物）和5微芯片用200nm厚的隔板。
   注:窗口尺寸为20×400微米²和在SiN厚度为50纳米。由于存在上的尺寸的一些公差，建议检查使用光学显微镜的尺寸。
4. 使用碳包覆镊子从存放盒中取出芯片，并把他们放在载玻片。坚定而认真抓住微芯片上的罗NG两侧。处理微芯片，使得在SiN膜侧总是朝上。
   注:避免在上侧接触易碎的SiN膜。另外要小心处理芯片，以避免开裂他们锋利的边缘，这可能会导致由于驻留在微芯片或以后泄露硅粒子的问题。
   注:程序的培训，从被粘物表面去除微芯片可以在（便宜）的虚拟微芯片来完成。
5. 放置微芯片上在培养皿洁净室的组织。关闭盘，并将其转移到通风橱。
   注:涉及丙酮的步骤在通风橱中进行化学安全执行。
6. 举两个120毫升的玻璃烧杯中。冲洗1烧杯用丙酮和其他用乙醇清洗。填充第一个用40-60毫升丙酮中，而另一个用40-60毫升乙醇。
   注意:要使用HP​​LC级液体也为这一步的协议是非常重要的。
7. 转让微芯片与丙酮的烧杯中，以除去保护抗蚀剂层。轻轻用手移动烧杯中，有效地冲洗芯片，但要注意不要把微芯片颠倒- 见图2。
8. 2分钟后，取出芯片并迅速将它们转移到含乙醇的烧杯中。用手轻轻用乙醇移动至烧杯2分钟以除去抗蚀剂层的任何残基。用铝箔覆盖烧杯，并将其转移到层流工作台中。
   注意:不要让微芯片传送过程中干出来的，以避免碎片的沉积。
9. 从烧杯中取出芯片，并将其放置到一个新的洁净室组织。让他们干几分钟，微芯片转移到在培养皿光学显微镜载玻片。
   注:湿的芯片可以轻松地前后翻页，上下翻转，还是坚持镊子被释放。这可以通过PRES可以避免轻轻唱在滤纸上的微芯片和在水平方向上拉动镊子程。
10. 关闭培养皿和微芯片传送到等离子体清洁器。
11. 放置与微芯片到等离子体清洁器的载玻片。运行5分钟的清洗程序来呈现氮化硅膜的亲水性的表面上，以除去烃。
    注:施加于我们的等离子体清洁器的合适的设置是:70毫乇，11.5标准立方厘米为O ₂和35.0 SCCM为氩气，50瓦向前射频（RF）目标，5瓦的RF范围的气流，和最大反射的RF。能够诱导表面电荷的任何离子是合适的。
12. 把载玻片与微芯片放回陪替氏培养皿，盖上盖子，并转移到在光学显微镜。
13. 检查光学显微镜可能的膜破裂或剩余的灰尘颗粒下的微芯片。要特别注意的窗口区域，并检查是否有小斑点表明AR膜的upture。解雇与受损的细胞膜微芯片。
14. 关闭培养皿并将其存储在所述层流工作台中。

2.对微芯片的样品的制备

1. 通过在〜3 M的浓度少量含有纳米直径30，柠檬酸盐稳定的金纳米粒子的储备溶液混合制备水性金纳米粒子溶液（柠檬酸盐稳定化的）
2. 放置在一个干净，表面发粘的微芯片在液滴应用/样品沉积运输箱。
3. 放置在新鲜等离子体清洗微芯片在SiN膜侧的样品溶液的液滴（1-2微升）（使用无隔板的微芯片），并让在层流气流工作台的溶液干燥。
   注意:此过程可以增加在SiN膜金纳米粒子的浓度进行重复。
4. 适用的去离子水1μL到微芯片用于去除盐和/或表面活性剂。后30秒，小心除去水的液滴用滤纸。让芯片在干燥空气中的层流工作台。
   注:足够大数量的金纳米粒子的将已附着于微芯片并不会再冲走水。
5. 使用所制备的样品的微芯片4小时内，如在SiN随时间失去其亲水性呈现的表面特性，它可以使液体在实验期间表现不同。注:请参阅讨论部分的更多细节。
6. 使用封闭的运输箱为存储和芯片的转移。

2.液体流动TEM支架的研制

1. 清洗液流TEM支架
   1. 清洁所有工具（镊子和螺丝刀），就可以在用丙酮和乙醇超声浴真空部分接触，并将它们通过放置在工作台上的一块新的铝箔设置在无尘表面上。带手套工作避免了液体流动的TEM保持器的污染。
      注:该工具没有被广泛地清洗，如果一个肯定是干净的真空部件的工作。可避免的手套，如果一个能够处理的设备而不触及真空的部件。
   2. 放置双目光学显微镜下的液体流动的TEM支架以这样的方式含有所述液体腔室中的保持器的前端可被观察到。参见图3。
   3. 移除保持器前端部的盖子，将其放置在无尘表面上。
      注:钛盖子是引起的像的镊子较硬的材料划伤敏感。它建议使用聚合物涂覆的镊子敏感材料。
   4. 至少准备1-2毫升纯净水（HPLC级）。
      注意:如果不使用HPLC级液体，则建议检查使用不含有微粒可能可能导致流动系统的堵塞的液体; FILT器根据需要用一个微孔过滤器的液体中。
   5. 使用玻璃注射器（1毫升）与0.5毫升的纯净水冲洗整个流系统。它建议使用的微流体注射器泵系统。使用移液管和/或滤纸以除去在液体中细胞室被喷出的液体。测试所有管材液体的流量。干燥该保持器前端之后使用滤纸和/或吸管。
   6. 使用光学显微镜检查该保持器的尖端是干净和干燥。如果需要的话，洗刀柄的前端与水或乙醇以除去可能已通过干燥溶液留下任何固体残余物。除去灰尘片或纤维的剩余物为好。小心地用镊子去除这些碎片，从而避免刮伤钛表面。同时检查O型圈凹槽内，并用一小块洁净室组织去除液体的剩余物。
      注:如果持有人不执行此过程变得干净，那么建议从保持器取下尖端和清洁的丙酮使用超声波浴2分钟并在乙醇中另外2分钟。
   7. 检查的前端的光学显微镜下的所有进一步份（O型环，盖，和螺钉）和去除灰尘，纤维等 ...
      注:有时候，从螺钉或硅微晶片始发小块必须移除。如果有必要，清洗简单地用HPLC级乙醇真空部件。盖和螺钉可以使用超声波进行清洗，对于尖说明。避免将O型圈频频乙醇，因为它可能使O形圈脆随着时间的推移，削弱了其真空度。该系统是不带真空润滑脂操作，但是，如果出现密封问题，可以使用真空润滑脂。
   8. 重新插入O形环插入支架的相应的凹槽，并检查它们适合和不上槽任意一侧突出。
   9. 保持液体流动TEM持有人无灰尘，直到样品装载（ 如，用铝箔覆盖它）。
2. 组装液流TEM支架
   注:以下步骤介绍与干最佳定向试样固定器微芯片的加载过程。在此配置中，与样品基座微芯片将上部微型芯片一次转移到显微镜。参见图4。用于TEM中，在液体槽的底部相对于一向下行进的电子束获得的最高空间分辨率。因此，该微芯片将被周围安装的其他方式。
   1. 使用弯曲镊子抓住的长边侧的样品微芯片，并将其放置在液体流动的TEM保持器的前端的槽（口袋）的内部。保持氮化硅一面朝上。检查芯片的位置是否正确使用双目光学显微镜的插槽。
      注意:如果芯片下方的O型圈没有正确放置微芯片可突出˚FROM插槽。
   2. 放置过滤后的液体的0.3微升的液滴上使用微量样品微芯片实验。如果需要的话，固定的微芯片中用镊子地方，因为液滴的毛细管力可拉的微芯片其口袋。
   3. 使用倒挂弯曲用镊子取第二个微芯片（一个与隔离层）。小心地将微芯片倒置。放置垫片的微芯片上的插槽中的碱微芯片。
      注意:此过程需要足够快地进行，以避免在样品微液滴的干燥。
   4. 检查用双目光学显微镜而移动所述试样保持器的末端下面一块光反射材料的正确位置。两个微芯片必须准确对准平行于实现在SiN窗口的最佳重叠。
      注意:如果该窗口不重叠，微芯片可以通过在一侧具有的前端推重新定位镊子，但避免移动微晶片太多，因为在SiN膜可以很容易损坏。一些微芯片配有交叉配置（一个微芯片的窗口是垂直于窗口中的其他微芯片）;这种构造有利于在两个微芯片的对准但也减少了图在电子显微镜下的字段。
   5. 拿镊子的样品室盖的前侧，把它倒过来。不接触的微芯片，放置在盖的后侧上的一角。在于，所述盖子仅搁置在镊子的下部分支的方式慢慢打开镊子。小心地放下盖子，直到其位于两个芯片。取出镊子。
   6. 重新检查两个芯片的窗口对齐。如果有必要，打开盖子，调整微芯片的定位，盖子重新定位。
   7. 放置螺丝和自己平时的地方进行修复。检查两个窗口对齐。一世˚F必要，再次拧开螺丝，调整微芯片。
      注意:不要固定螺钉拧得太紧，因为这可能会造成损坏。真空密封实现当螺丝拧紧刚。
   8. 通过使用4微升/分钟的流速开始通过系统的液体流检查密封。如果没有泄漏的上前端的任一侧观察到的，这是在真空密封度的良好指示。
   9. 持有人转移到真空泵站，检查真空度。真空度应在5分钟抽内至少达到10 ^-5毫巴。
      注:建议与之前使用一个虚设保持器来测试泵站。
   10. 保持器传送到电子显微镜在其外壳，以防止它收集灰尘。
       注意:各商业架配备了一个外壳。

3.液体样品的STEM

1. 调整STEM电子显微镜 注意:在这个协议中所描述的电子显微镜的操作是基于可在用户手册中找到的标准程序。该协议描述了所需的细节超出液体样本数据采集的标准程序。
   1. 开始与对齐STEM模式显微镜。在试样保持器中，插入由具有金纳米颗粒的薄碳膜的试验样品。调整STEM显微镜的设置如下:设置探头当前0.18 nA和电子束的通过选择4C的光点尺寸为30微米的物镜孔径的会聚半角到20毫拉德。选择一个8厘米摄像头的长度。
   2. 记在荧光屏测量指示电流密度，而ADF探测器插入。移除试样保持器。
      注意:需要在以后的该电流值来估计该液体的厚度。
   3. 开始用纯水液体流。不要超过2流微升/分钟。
   4. 插入在电子显微镜下的液体流动的TEM保持器，并开始撤离。同时检查预真空室的真空指示和疏散的持续时间。如果真空度是标准的，泵送过程的持续时间不通过两个因素超过正常疏散时间（约1分钟），插入保持器。
   5. 打开光束阀当主样品室的真空处于允许其开口的范围内。按ADF按钮插入ADF探测器。
      注:此协议是指位于该电子显微镜的荧光屏上述一个ADF检测器。
   6. 使用512×512像素的图像尺寸，为2微秒的像素停留时间，和20,000放大倍率设置在连续图像获取模式中的显微镜。通过在x和y方向平移阶段搜索的SiN窗口。
      注:微芯片块，流过试样朝向检测到任何电子要么;信号只在罪恶的位置可见。参见图5。有时，更容易通过观察荧光屏幕查找在SiN窗口。
   7. 一旦窗口已经发现，调节对比度和亮度设置（使用相应的旋钮），使得在窗口的边缘变得可见。按样品台的x和y平移按钮走向的视场的中央边缘。按物镜的复位按钮。
      注:亮度必须相比帐户在液体强散射的真空样品在很大程度上降低。
   8. 通过调整样品载物台的垂直位置（z轴平移）粗聚焦尖角在在SiN窗口的边缘继续进行。验证该样本位置是在eucentric高度由5°旋转台上并旋转回来。样品和在SiN窗角的特征不应该在低倍率移位。
      
   9. 根据需要再次将窗棱在观看区域的中间调整的垂直位置。存储使用该软件的存储按钮台的位置。
   10. 移动到的碎片或高对比度（ 例如，金纳米颗粒）的其他对象的小块存在通过在x和y方向平移阶段的位置上。调整物镜的聚焦，使所有对象出现在聚焦锐利。
   11. 记在经由操作软件荧光屏可见测得的电流密度，这表明通过液体保持器和通过ADF检测器的开口的发射电流。计算使用等式1继续仅当液体厚度已经确定并且不超过3微米的液晶单元的厚度。
       14中的样本来确定
       式（1）
       用叔 _SIN非晶氮化硅膜和叔 _水 ，水层的厚度的厚度。的平均自由程长度数量为L _的SiN = SiN构成0.79微米，=和_升水 = 3.0微米的水用于检测器开口35毫弧度¹⁴的半角度。
   12. 仔细观察在低倍放大的液体，以确保气泡不存在。气泡可以通过使用连续的液体流和探针电流低于0.5 nA的被防止。
   13. 翻译在x和y方向上的阶段，直到至少含有20金纳米粒子公顷小号被发现。设置图像尺寸1024×1024像素，像素停留时间为19微秒，并放大到40万。按收购按钮获取坚持在SiN膜金纳米颗粒的图像。
       注:一旦图像已获得将金纳米粒子与强烈的反差和锐利的边（ 见图6）可见，我们可以肯定的是，实验设置正确。万一出现意外问题，不与实验继续进行，但一定要解决的原因。
2. 金纳米粒子的溶解STEM
   1. 从显微镜除去液体流动的TEM支架和停止液体流动。
   2. 制备至少1毫升的氯化钠的0.1M在HPLC级水在玻璃注射器的溶液。
   3. 调整流动系统为20微升/分钟的速度，并用0.3毫升的盐溶液冲洗整个流系统。使用滤纸收集液体喷出的油管的另一端。此后，流程系统重新调整到2微升/分钟。
   4. 检查的SiN窗口使用的是双目光学显微镜的完整性。如果发现无泄漏，重新插入液体流动TEM架到显微镜。
   5. 检查预真空室的真空指示和疏散的持续时间。如果真空度是标准的，泵送过程的持续时间不通过两个因素超过正常疏散时间（约1分钟），插入保持器
   6. 移回其原来的位置使用存储舞台上的地位显微镜的阶段了。使用512×512像素的图像尺寸，为2微秒的像素停留时间，和20000倍的倍率设定在连续图像获取模式中的显微镜。调整对比度，亮度，焦点和eucentric高度，如在步骤3.1.7-3.1.9所述。
   7. 通过在x和y方向平移阶段发现的感兴趣的位置。设置图像大小1024×1024个像素，像素停留时间为2微秒，并且放大至500,000。通过手动按下按钮收购一旦前面的图像已被录制拍摄一系列STEM图像。
      注:金纳米粒子开始尽快使电子束在样品上扫描的溶解。照射区域以外颗粒没有受影响，并且可以之后立即观察。时间戳被存储在图象标题。另外，也可以使用的软件为一系列图像的自动收集成电影。
3. 拆卸和实验后清洗TEM架
   1. 当液相的TEM实验完成和保持器从电子显微镜缩回，清洗油管，所述液体腔室，和其组件，以除去任何固体粒子或残留的盐可能影响未来的实验。
   2. 轻轻松开后螺钉，使其固定仍然在插槽中，但盖子可以很容易地删除。松开螺丝前，将其删除，并放置在一个无尘的环境中。
   3. 取下盖子，将其放置在用于存储无尘环境。
   4. 从口袋中取出两个芯片。通过浸渍他们认真在水中或在实验的剩余溶液中分离它们。将带有在SiN膜侧上棉纸微芯片向上并让它们在空气中干燥用于进一步分析。
   5. 卸下O型圈和清理用HPLC级水各槽。存放在无尘的环境O形圈。
   6. 使用玻璃注射器（5毫升）冲洗所有管线（输入和输出），每个用5mL HPLC级水。收集用小烧杯放置在TEM支架尖端下面的液体。冲洗后，用移液管和/或滤纸从液体室除去残留的液体。
   7. 检查在TEM保持器的前端，并删除像硅微破碎边缘残芯片，纤维，或灰尘。如果盐仍然可见，重复清洗步骤。返回O型圈他们的凹槽。
   8. 存储在TEM保持架和其在无尘环境的组件。
4. 程序替代3.2:移动金纳米粒子的STEM
   注意:不同的组装过程是必需的，研究在液体金纳米粒子的运动。
   1. 忽略步骤1.2。紧接在步骤2.2将它们插入在TEM的持有人之前装载在硅微芯片的金纳米粒子。保持由在所有时间的液体层覆盖在样品中以避免纳米金来在SiN膜的强附着。协议的其它步骤是相同的​​。在步骤3.2.6获得一系列STEM图像。

图4:装配液体流动TEM持有人。 （A）的液体样品室有个Ë小O形圈放置在其凹槽。插图示出了俯视图。 （B）中的碱微芯片被放置在相应的插座。插图显示在该角度的侧视图的微芯片是从光反射可见光。 （CD）的溶液的微滴被添加到微芯片。盖微芯片（EG）安置。液体电池仓盖的（HI）安置。用两个螺丝盖（J）固定。 （K）组装液体流量TEM持有人。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5:初始定位和利用干聚焦显微照片。 （ 一 ）要查找的SiN窗口，舞台朝亮的签名运动最终。硅微芯片是足够薄一些电子穿过靠近窗口。 （B）显示出现暗（减少散射）的SiN膜窗口亮一些金纳米粒子聚焦的SiN窗口的边缘。微芯片的边缘是光明由于过度散射。 （C）聚焦在氮化硅窗口的角落里完成的。该图像显示欠聚焦，在聚焦，过度集中的情况。 请点击此处查看该图的放大版本。

Results

液体流动的TEM支架被用来研究金纳米粒子在液体中的行为。金纳米粒子被稳定地固定在SiN膜在纯水中，并使用液相STEM（ 图6）与纳米级的分辨率进行成像。在强烈散射黄金获得良好的对比度。用于干试样测得的荧光屏上的电流密度为20 PA /平方厘米，而其量达8 PA /平方厘米与插入的液体流动的TEM持有者。使用公式1， 叔 _水 = 2.4±0.5微米，比基于为200nm的隔离物厚度是预期的大得多。然而，厚度不为金纳米粒子的纳米空间分辨率成像太大。液体厚度由于鼓出的微芯片的氮化硅膜，非平坦的，和碎片驻留在微芯片比由间隔设置的200纳米厚。

16中它们的形状，虽然反应性辐解产物（例如^- _水溶液 ^{，H•，H +，OH•）}从电子束的与交互始发水可能氧化单金原子，导致纳米金¹⁵的形状的变化。然而，当液体流动系统被用来在第二个实验中引入的氯离子，所述金纳米粒子的稳定性发生变化。氯离子能够稳定在tetrachloroaureat的形式氧化金原子，AUCL ₄ ^{- 。} 图7示出，在一个STEM成像时间推移系列缓慢溶解的金纳米粒子，类似的结果报告早期的^16。对于所使用的电子剂量率，花〜300秒以溶解30纳米大小的金纳米粒子。

金纳米粒子的水:运动 R IN第三个实验中（ 图8）进行了研究。之前的实验中，将液体流动的TEM保持器以除去盐的任何痕迹进行清洗。从第一个实验的不同，使用一个替代的样品制备的方法来实现的纳米金来在SiN膜¹⁴的较弱的附着。在该实验中，金纳米粒子溶液置于在硅微芯片，并在液体流动的TEM保持器组装而不让溶液变干。以这种方式，所述金纳米颗粒容易从在SiN膜在成像在所使用的剂量率分离。一些金纳米粒子的移动离开的视图成批量溶液的字段路程，而其余的金纳米粒子在靠近在SiN窗口保持在视野内。观察这些金纳米粒子的运动，最终他们团聚。一段时间后，这些聚集体也从在SiN膜分离并移出的视场并进入溶液中。

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图6:顶部有一个纯净水层的金纳米粒子30纳米直径在扫描透射电子显微镜（STEM）显微图。示出的图像是原始图像的选定区域。图像大小为1,024×1,024像素，像素停留时间为19微秒，像素尺寸为0.73纳米，并且放大倍率为400,000X。电子剂量为7.1因而×10 ⁴ E ^- /纳米2。在荧光屏上测得的电流密度为8 PA /厘米^2，使该液体的厚度经计算为等于2.4微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7:时间推移系列在盐水金纳米粒子STEM显微照片。 （AD）的图片从在30秒的间隔时间推移系列STEM图像的提取。该金纳米粒子在液体逐渐溶解作为氯离子的存在下的结果。的像素停留时间为2微秒，时间经过一系列的帧时间为1.75秒，像素尺寸为0.44纳米，并且放大倍率为500,000。每幅图像的电子剂量为1.2×10 ⁴ E ^- /纳米2。液体厚度为2.4微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8:STEM金纳米粒子在纯净水移动显微照片。 （A）的SiN膜与金纳米粒子，其中一些是用箭头选中。 （ 二 ）运动轨迹所选择的金纳米粒子（见A）。一些金纳米粒子从视野中成像时搬走。剩下的金纳米粒子沿着氮化硅薄膜横向移动，并开始凝聚。在到达临界簇大小，它们从膜调度和从view.The像素停留时间字段搬开为1微秒，则帧时间为0.52秒，像素尺寸为1.8纳米，并且放大倍率为120,000X。每幅图像的电子剂量为3.5×10 ^{2ë -} /纳米2和液体厚度为2.4μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

所描述的协议能够在液体中金纳米粒子的茎，包括动态过程的观察。保持器的组装是容易了解的技术。但是，与液体流的TEM保持器工作时，若干方面必须加以考虑。例如，在O形环的硅微芯片或大颗粒的破碎边缘可能导致液体细胞的泄漏。另一方面，大颗粒（> 200纳米; 例如，灰尘或Si碎屑）上的SiN膜可能会导致液体电池的厚度增加，从而导致低的成像造影或低空间分辨率和甚至可能导致的SiN窗破裂。重要的是，盐或其他化学品的残余物可能会影响以不希望的方式的实验的结果。因此，至关重要的是，样品制备和保持器组件的不同步骤仔细和在一个干净，无尘环境中进行。

液体CE的厚度LL确定可实现的分辨率，以及所获得的图像¹⁷的对比。该厚度可通过位于两个硅微芯片中的一个间隔物来调整。根据样品的尺寸，液体的细胞的不同的厚度就能够实现。对于金纳米粒子的研究，有可能使用小间隔物（200-500纳米），而整个真核细胞中需要较大的可达5微米的隔离物。液晶单元的厚度是通过从液体小区和周边真空之间的压力差造成的的SiN膜的窗户的膨出进一步影响。这种影响变得具有较大的SiN膜的窗口更加明显。因此，为了最大限度地减少液晶单元的厚度，建议使用小的SiN膜的窗户。在情况下，它是很难找到两个小窗口之间的重叠，它们可以在使用不同的碱微芯片的交叉配置进行组装。其他配置LARG伊利防止胀和由被柱子支撑¹⁹单片微型芯片¹⁸或膜窗，但那些表现出劣势就装样的。之一的当前技术中最具挑战性的方面是缺乏在液体厚度精确控制的。通常情况下，该液体是比什么是从所用的间隔物的尺寸预期，如在这里所示厚得多。几个研究小组使用封闭液室^{4，20，21，22;}这些系统具有关于空间分辨率的一些优点，作为液体厚度可通过诱导在液体中气泡减少。可替代地，在SiN窗口可以被迫以折叠，导致较薄的液体层。第三，其他窗户更薄的外壳存在（ 例如，石墨烯^）23，也导致薄得多液体比什么是可能的，在此协议中描述的系统。然而，这是不可能的那些系统中流动的液体。

作为任何高分辨率显微技术，一些实验方面必须加以考虑。最重要的方面是与液体或样品的电子束的相互作用。除了辐射损伤，这限制了对许多固体样品²⁴中的可实现的空间分辨率，所述液体样品也通过电子束产生的辐解产物^15，25的影响。由于这些产品可能会影响实验，细心数据解释和实验设计是必不可少的^26。显微镜设置应根据特定研究的目标来选择。 ADF STEM是在较大的液体单元的厚度高原子序数（Z）的成像纳米颗粒更强大，WHI透射电镜乐给出了低Z材料更好的对比度和通常更快，但需要更薄的液体层^3。代替使用ADF检测器的，则明场（BF）检测器有时被用于图像的液晶单元中，由于高炉干为在厚层²⁷成像低Z材料是有利的。随着液体电池的厚度，则需要更多的电流。然而，这也增加了辐解产物的浓度和增加辐射伤害。还应当指出的是，对比反转在ADF检测器被观察到很厚的液体（> 10微米为水）。

液体条件通过从显微镜移除保持器和交换两样品和液体我们的实验之间改变。除了改变盐的浓度，这是很容易可以通过在不同的液体流动（ 例如，一个可以改变液体的其它性质为了设置一个特定的pH ¹⁶使用缓冲溶液或可能引入的有机溶液或其它添加剂）。另外，也可以改变液体，而保持器在显微镜通过微流体系统流动的液体仍然插入。然而，在这种情况下，它是未知的，此时指向试样的变化的液体中。也值得注意的是，微芯片支承电极是可用的，所以纳米级电化学实验可进行^28。

研究的对象不限于金纳米粒子在水，但可使用上述的协议，包括二氧化硅，氧化钛和聚合物进行研究的各种试样。如果对象的运动太快，收购内的图像中捕捉到，可通过一个数量级，通过使用50％甘油和50％水的混合物中来降低粘度。

从上述的点，具有许多优点，可能性，也存在缺点将变得显而易见。当与液相STEM工作，要考虑的最重要的缺点是:1）任何实验是由与整个试样（被观察物，液体，和在SiN膜）的电子束的动态相互作用的影响; 2）样品处理是繁琐的，并且它往往是难以实现的薄液体层，因为样品或微芯片包含一些微米尺寸的颗粒; 3）液体厚度通常从由间隔设置的预定厚度基本上不同;和4）的空间分辨率和对比度强烈取决于液体厚度和下观察和液体中的对象的变化密度之间的差异。

目前，为对象的液体的显微镜用纳米空间分辨率存在充足的方法。非晶冰电子显微镜是一种强大的技术^29，但所涉及的实验步骤细腻，不是所有的实验允许样品在冰的制备，和时间分辨实验是不可能的。 X射线显微镜^30，31原则上可以使用的，但它有一个有限的空间分辨率，而不是在实验室广泛使用。在液体原子力显微镜已经建立，但是一个表面技术仅^{32，33，34，35。}光学显微镜未显示出足够的空间分辨率。目前，在液体电子显微镜，似乎在液体纳米级物体和过程的直接镜检最强大的技术。

液相TEM和STEM尚未常规分析技术，但仍处于发展阶段。的参数考虑到的数量是相当大的，而且它是ofteÑ难以再现的实验结果。此外，量化数据难以获得，因为所研究的影响与存在的作为电子束的结果进程交织在一起。这里描述的协议的目的是规范实验方案，从而占实验的所有相关方面的基础。我们希望，该协议将导致这一新兴领域的试点工作更好的重复性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
双目光学显微镜	Leica	M60 CMO
带球差校正器的扫描透射电子显微镜	JEOL	ARM200F
液体流动 TEM 样品架	DENS Solutions	海洋
微流控注射泵	Harvard Scientific	PicoPlus
等离子清洗机	Gatan	Solarus950
化学品
Rotisolv Plus 用于 HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
水，用于 HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Plus，Rotisolv HPLC 级	Carl Roth	P076.2
柠檬酸金胶体稳定，直径 30 nm	British-Biocell	EM。GC20<
strong>材料
base 硅微芯片，氮化硅膜厚度为 50 nm，尺寸为 20 μ;m x 0.40 mm	DENS	海洋系统
垫片硅微芯片，氮化硅膜厚度为 50 nm，尺寸为 20 微米;m x 0.40 mm，垫片厚度为 200 nm	DENS 海洋	系统
微流体 peek 管	Upchurch Scientific	1570
塑料可更换尖端 镊子
（防磁抗酸不锈钢主体，带 ESD PVDF （SV） 尖端）	ideal-tek	2ASVR.SA
特氟龙涂层弯曲钢镊子（EMS SA 带"PTFE"涂层）	电子显微镜科学	78322-7Te
特氟龙涂层宽喙钢镊子（EMS 2A"PTFE"涂层）	电子显微镜科学	78322-2ATe
汉密尔顿注射器，1 mL，气密（型号 1001 TLLX SYR）	Hamilton	81323
洁净室组织 Sontara Micropure AP （224 x 224 mm）	杜邦	Sontara MicroPure