轮转跑动与环境复杂性作为FASD动物模型中的一种治疗干预手段

摘要

有氧运动和在复杂环境中给予的刺激性体验对啮齿类动物大脑神经可塑性的多种评估指标具有积极益处。本文将探讨将这些干预措施作为 "超级干预" 结合了跑轮运动和环境复杂性，将解决这些干预措施的局限性。

摘要

有氧运动（例如，在动物研究中广泛使用的转轮跑（WR））对大脑神经可塑潜能的多种指标具有积极影响，例如成年啮齿类动物的神经发生率、血管生成以及神经营养因子的表达。该干预措施还被证明可减轻致畸剂（即，发育期酒精暴露）和与年龄相关的神经退行性变对行为和神经解剖学的负面影响。环境丰富化（EC）已被证实可在皮层及皮层下结构中产生多种神经可塑性益处，并可与转轮跑结合使用，以促进成年海马中新细胞的增殖与存活。这两种干预措施的联合构成了一种强大的"超级干预"（WR-EC），可在多种啮齿类神经系统疾病模型中实施。本文将讨论在模拟人类产前酒精暴露的动物模型大鼠中，如何实施WR/EC及其各组成部分，以作为更有效的治疗性干预手段。我们还将探讨该操作流程中哪些要素是干预所必需的，哪些要素可根据实验者的研究问题或实验条件进行调整。

引言

在不同环境中饲养长期以来已知会导致神经健康各项指标发生变化。许多研究关注从Diamond和Rosenzweig开创性研究开始的复杂环境（EC）饲养对神经健康的有益影响。例如, ^1,2）和格林诺 (例如,^3,4). 已证明EC对大脑突触和细胞变化具有不可否认的积极作用^5,6,7. EC 可影响包括海马在内的多种脑区^8,9 和视觉皮层^10,11腹侧纹状体^12,13，以及全脑范围的神经免疫功能（综述见¹⁴）。当研究证实电休克（EC）可通过树突可塑性提高齿状回成年新生颗粒细胞的存活率后，人们对海马体的研究产生了特别的兴趣 ^9,13这一点引起了广泛关注，因为越来越多的文献表明，心血管运动能够促进健康大脑和受损大脑中的成年神经发生^15,16,17,18跑轮运动（WR）是一种易于实施的自愿性有氧运动形式，已在神经疾病或衰老的啮齿类动物模型中显示出有益作用。 ^17,19,20WR 影响中枢和外周神经系统中生长因子的表达 ^21,22,23.

将 WR 和 EC 组合（随后）为一个 "超级干预" （WR-EC）（即，12天的跑步轮训练（WR）后接30天的丰富环境（EC）可显著增强海马区成年神经发生，并提高新增殖细胞的存活率⁸，这种在FASD动物模型中的效应无法由单个组分实现（见下文）。由于WR-EC的两个组分均作用于脑内多种结构¹³ （WR 在²²，EC 在审阅中²⁴），该干预措施可轻松应用于神经功能损伤的发育期及成年期发病啮齿类动物模型例如，新生儿期酒精暴露，衰老，生命早期应激。

青少年期和成年早期 WR-EC 的整合（即出生后第30至72天）可改善胎儿酒精谱系障碍（FASDs）大鼠模型的部分负面效应⁸已有大量研究表明，出生后第4天至第9天（PD 4–9）暴露于酒精的啮齿类动物在神经解剖学指标上表现出显著缺陷，例如树突复杂性降低²⁵小脑发育^26,27 神经免疫反应性²⁸ 以及学习与记忆障碍的表现^29,30,31。即使在此时间窗口内接触的酒精量有所减少（即，出生后第7至9天）可导致青少年期和成年期大鼠出现学习与记忆功能缺陷³² 而某些结构不再表现出显著的神经解剖学损伤²⁷许多这些缺陷——以及海马依赖性任务中的行为障碍——在经历 WR-EC 范式后均有所缓解^8,33 或仅 WR^25,31尽管限制热量摄入（WR）本身已被广泛用作干预手段，但WR与运动联合（WR-EC）的组合干预在现有文献中尚未得到应用，尽管该组合能够维持WR相对短期的效果。⁸本文将讨论在青春期实施WR-EC干预的方法。尽管该范式最初用于早期产后酒精暴露的研究，但也可应用于多种啮齿类动物模型，以评估脑部疾病模型中大脑的神经可塑性潜能。

方案

伦理声明：以下方案已获得特拉华大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 发育期暴露（或类似 binge 的乙醇暴露模型）

1. 在出生后第3天（PD3），确定每只动物的性别，必要时进行交叉抚养，以确保每窝仔鼠数量（8只）和性别分布（4雄:4雌）保持一致。
   注意：为避免实验干扰因素，应尽可能保持每窝仔鼠数量和性别分布的一致性。尽管本方案采用每窝8只仔鼠（4雄4雌），但可根据实验设计需求调整窝仔数量或性别分布。
2. 在每窝动物的足垫皮下注射少量黑色印度墨水，以进行个体识别。
3. 将窝仔鼠伪随机分配为实验组（包含50%酒精暴露（AE）和50%假插管对照（SI）仔鼠）或哺乳对照组（SC）（在出生后第4至9天期间不进行任何插管、尾部剪切或分离操作，仅进行每日称重和耳标打孔）。
   1. 为保持组间规模一致，实验组的窝数应设为对照组（SC）的两倍。
4. 称重每只动物，然后将其放回其原代笼具中。在插管期间（出生后第4至9天），应每天进行动物称重。
   1. 将整窝幼崽从母鼠身上移开。
   2. 将幼崽置于加热垫上。
   3. 记录每只幼崽的体重。
5. 在第4天，称量每只动物后，根据每只幼鼠的体重（来自步骤1.4）计算所需酒精量，使每只动物的总摄入量为5.25 g/kg/天⁸.
   1. 以11.9%乙醇（体积比）的牛奶替代物给予酒精
6. 从上午9点开始，每次将一窝幼崽从母鼠身边取出。
7. 将乙醇-牛奶混合物给予每只乙醇暴露的幼鼠³⁴.
8. 对每只假手术组仔鼠进行假插管操作⁸.
9. 对每窝实验动物重复执行步骤 1.5 至 1.8。
10. 首次给药2小时后，重复给药步骤（步骤1.5至1.8），给予第二剂酒精。
11. 在第二次酒精给药后一个半小时（即每日血液酒精浓度达到峰值的时间点），采集酒精暴露组（AE）和分离对照组（SI）仔鼠的血液并进行离心处理 通过 用于后续血液酒精浓度分析的尾部取样³⁵.
    1. 采集60 µL血液。
    2. 将血液置于1 mL微量离心管中。以1.5 × g离心25分钟。
    3. 小心收集离心管中的上清液血清，用于后续血液酒精含量分析。
12. 使用牛奶替代乙醇-牛奶混合物重复给药步骤（步骤1.5至1.8），以防止因乙醇暴露导致幼鼠哺乳困难而引发的营养缺乏。
    1. 在出生后第4天（PD 4）进行共计2次补充喂奶，每次间隔2小时。
13. 在出生后第5至9天重复执行步骤1.4至1.12（步骤1.11除外）。
14. 在出生后第9天（PD9）给予最后一次补充牛奶后，对所有幼鼠进行耳缘穿孔，以便在EC笼中识别个体。
    1. 将打孔耳标与窝产数量或标识符的某种测量方式关联例如，同一批次中奇数编号的窝别幼崽将进行左耳打孔，而偶数编号的窝别幼崽将进行右耳打孔。这样可在环境富集笼中更易于识别不同窝别但足纹标记模式相同的动物。

2. 断奶

1. 在出生后第23天（PD 23），将所有动物以每笼2-3只的方式饲养。
   1. 确保同一笼内的所有动物性别相同。
   2. 在条件允许的情况下，每笼包含一只SC、一只SI和一只AE动物。
   3. 尽量减少来自同一窝的动物同笼数量。
   4. 确保所有动物均能自由接触食物和饮水。

3. 跑轮运动

1. 在出生后第30天（PD30），将一半带动物的笼子分配至跑轮组（WR）。将这些动物饲养在配有可自由进入的不锈钢跑轮的笼子中。
   1. 确保跑轮装有计数器，以评估总转数。
2. 在出生后第30天（PD30）和第36天（PD36）称量所有动物的体重。
3. 每天上午9点记录每个跑轮的转数。
4. 让动物在其相应的饲养条件下继续饲养12天。

4. 环境复杂性

1. 在实验动物出生后第42天（PD 42）当天上午9点前准备好丰富环境（EC）笼具。
   1. 准备一个30 " x 18 " x 36 " 的镀锌钢制笼子。
      注：笼具应具有多个层级，能够承受多只大鼠的重量，内含标准垫料，并设有多个可安装饮水瓶和饲料分配器的位置。
   2. 在笼内放置大小、形状各异的新奇彩色物体。
      1. 在EC笼内放置6个大型玩具。确保每个玩具足够大，可供3只或更多大鼠同时互动。
      2. 在EC笼内放置6个中型玩具。确保每个玩具足够大，可供3至4只大鼠同时互动。
      3. 在EC笼内放置大量（至少20个）小型玩具。
      4. 使用颜色、形状、大小等各不相同的玩具。etc. 新颖性对此干预措施至关重要（见讨论部分）。
   3. 在笼子两端相对的位置各放置一个饲料盘。
   4. 在笼子两端相对的位置各放置一个饮水瓶。
2. 在出生后第42天（PD 42）上午9点，称量所有动物的体重，并将WR组动物转移至EC笼具中。每个EC笼具应容纳9至12只动物。
   1. 确保没有两只动物具有相同的足标记和耳孔标记模式。
3. 每天检查所有饲料和饮水情况。
4. 每两天从EC笼具中取出玩具，并按照步骤4.1.2的要求更换新玩具。
5. 每三天清洁一次EC笼具。
   1. 将动物从EC笼具中移出，暂时安置在每笼2至3只动物的临时笼具中。
   2. 清除笼底的所有垫料。
   3. 将原来的玩具放回笼中，除非当天恰逢玩具更换时间（依据步骤4.4）。
   4. 更换全部饲料和饮水。
   5. 将大鼠重新放回EC笼具中。

5. 收集组织

注意：组织采集（例如，用多聚甲醛灌注）和储存（例如，冷冻、石蜡包埋）可通过多种方法进行。以下将说明使用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中含4%多聚甲醛（4% paraformaldehyde in PBS）溶液进行灌注的过程⁸。

注意：多聚甲醛具有致癌性，还可能引起皮肤刺激、过敏性皮肤反应或眼部损伤。请使用适当的眼部/皮肤防护措施。

1. 每次将一只大鼠暴露于异氟烷中，使其轻度麻醉。
2. 向大鼠腹腔注射 2 mL/kg 的氯胺酮/赛拉嗪混合液（1.5 mL 赛拉嗪与 10 mL 氯胺酮混合）。
   注意：氯胺酮和赛拉嗪在配制注射混合液前的储存浓度均为 100 mg/mL。
3. 当大鼠不再有反应时，先用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS；pH = 7.2）灌注动物，随后用含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH = 7.2）进行灌注。
4. 取出脑组织，并在含 4% 多聚甲醛的 PBS 中于 4 °C 下保存 48 小时。
5. 两天后，转移至含有 30% 蔗糖的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液中，于 4 °C 下保存。

结果

为了评估综合干预措施的效果，我们必须分别考察其各个组成部分——跑轮训练（WR）和环境富集（EC）——对所关注指标的影响。图1至图3（如下所示）此前已在使用该范式的一项研究中发表⁸。图4则出自一篇博士论文³⁶。这些数据展示了WR-EC对海马齿状回区成年神经发生的效应。所有图表均显示各组均值，误差线表示均值的一个标准误。图1显示，在干预的跑轮训练阶段后，细胞增殖显著增加，表明WR组分能够有效促进正常发育、早期生活应激以及酒精暴露动物海马齿状回区的细胞增殖。图2显示，EC能够提高在新生儿期曾暴露于应激或酒精的动物齿状回区成年新生细胞的存活率。图3显示，分化为神经元表型的细胞数量增加，表明WR-EC可提高经历新生儿期酒精暴露或插管应激的动物齿状回颗粒细胞的增殖与存活，提示其具有治疗潜力...

讨论

在上述实验方案中，我们展示了一种快速有效的干预措施，可用于挽救新生儿期酒精暴露后出现的神经解剖学缺陷。由于该干预措施的各个组成部分均具有较强的可靠性，因此也可作为其他动物模型中的治疗手段。以转轮运动（WR）形式进行的自主心血管活动已被证明可改善多种行为学结果^38,39，并诱导海马等脑区发生功能性可塑性改变（详见综述⁴⁰）。这部分效应源于啮齿类和人类脑实质中生长因子及其他神经保护机制的表达^21,41。此外，环境富集（EC）可进一步增强这些作用，在啮齿类动物中诱导产生有益的细胞水平^6,11,42,43、结构水...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雌性妊娠期 Long Evans 大鼠	Envigo（原 Harlan, Inc.）		平均每窝产仔数为 8 - 10 只幼鼠
印度墨水（黑色）	Higgins（Chartpak, Inc.）	44201
注射器和注射针头	Becton, Dickinson and Company (BD)	多种规格	用于足标记墨水注射及酒精-牛奶溶液给药
耳标打孔器	Kent Scientific Corporation	INS750076
跑轮	Wahmann Labs		Wahmann 跑轮已停产。每笼配备一个。
EC 笼具	Martin's Cages, Inc.	R-695
小型 EC 玩具	多种来源
中型 EC 玩具	多种来源		应能容纳 1 - 2 只大鼠进入或站立于其内部或顶部
大型 EC 玩具	多种来源		应能容纳 3 只或更多大鼠进入或站立于其内部或顶部