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方法文章

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

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DOI：

10.3791/54971

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2017年1月11日

 , 
1Department of Pharmacology, Center for Mitochondrial Diseases, The Cleveland Center for Membrane and Structural Biology, Case Western Reserve University School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。

摘要

膜蛋白研究 体外 由于跨膜蛋白常含有疏水性跨膜结构域，其研究往往较为复杂。此外，将经去垢剂溶解的膜蛋白重新整合到脂质体中是一个随机过程，无法控制蛋白的拓扑结构，这进一步增加了研究难度。本文提出一种基于脂质体支架的替代方法，以克服上述技术难题。通过删除跨膜结构域增强蛋白的可溶性，并用一段连接基团（如His标签）替代该结构域中的氨基酸序列。该连接基团可与锚定基团（Ni2+ 由氮川三乙酸（NTA(Ni）配位2+）用于带有His标签的蛋白质），从而在脂质体表面形成一致的蛋白质拓扑结构。本文展示了一个应用该支架脂质体方法的研究实例，即通过该方法研究了动力相关蛋白1（Drp1）与一种整合膜蛋白——线粒体分裂因子（Mff）之间的相互作用。本研究中，我们证明了Mff能够高效地将可溶性Drp1招募至脂质体表面，并刺激其GTP酶活性。此外，在特定脂质存在的情况下，Drp1能够在Mff修饰的脂质模板上诱导膜管化。该实例通过结构与功能分析，验证了支架脂质体方法的有效性，并揭示了Mff在调控Drp1活性中的关键作用。

引言

研究膜近端蛋白质-蛋白质相互作用是一项具有挑战性的工作，原因在于难以重建所涉及的整合膜蛋白的天然环境1。这主要是由于需要使用去垢剂进行增溶，以及蛋白质在蛋白脂质体中取向不一致。为避免这些问题，我们采用了一种策略：将整合膜蛋白的可溶性结构域表达为带His标签的融合蛋白，并通过这些可溶性片段与脂质表面NTA(Ni2+)头部基团的相互作用，将其锚定在支架脂质体上。利用此类支架，可在不同脂质和蛋白质组成的条件下研究脂质近端的蛋白质相互作用。

我们已有效应用该方法来研究调控线粒体分裂复合物组装的关键蛋白质-蛋白质相互作用，并分析调节此过程的脂质相互作用2在线粒体分裂过程中，一种称为动力相关蛋白1（Drp1）的保守膜重塑蛋白3，会响应调节能量稳态、凋亡信号传导及其他多种线粒体重要过程的细胞信号，被募集到线粒体外膜（OMM）表面。这种大型胞质GTP酶通过与线粒体外膜整合蛋白的相互作用，被招募至线粒体表面。4-8一种此类蛋白——线粒体分裂因子（Mitochondrial Fission Factor, Mff）——的作用一直难以阐明，因其与Drp1的相互作用明显较弱 体外然而，遗传学研究已明确证实，Mff 对线粒体成功分裂至关重要。7,8本文所述方法通过引入促进Drp1与Mff相互作用的同步脂质结合，克服了以往研究的局限性。总体而言，这一新型检测体系揭示了指导线粒体分裂复合体组装的基本相互作用，为这一重要分子机器的持续性结构与功能研究提供了全新平台。

迄今为止，Drp1 与 Mff 相互作用的研究一直受到 Mff 固有灵活性9、Drp1 多聚体的异质性2,10，以及难以纯化和重构具有完整跨膜结构域的全长 Mff11 等因素的困扰。我们通过使用 NTA(Ni2+) 支架脂质体，重构了缺失跨膜结构域的 His 标签 Mff（MffΔTM-His6），从而克服了这些挑战。该策略具有优势，因为 MffΔTM 在大肠杆菌（E. coli）中过表达时具有极高的可溶性，且该分离蛋白易于在支架脂质体上进行重构。当锚定于这些脂质模板时，Mff 在膜表面呈现一致的、向外朝向的取向。除了这些优势外，还添加了心磷脂等线粒体脂质，以稳定 Mff 的折叠及其与膜的结合11。心磷脂还可与 Drp1 的可变结构域相互作用2,12，可能有助于稳定该无序区域，并促进分裂装置的组装。

该方法稳健可靠，广泛适用于未来旨在评估膜近端蛋白质相互作用的研究。通过引入额外的锚定或亲和相互作用，可进一步提升此类膜重建研究的复杂性，以更真实地模拟细胞膜表面存在的复杂环境。同时，可通过调整脂质组成，更精确地模拟这些大分子复合物所处的天然环境。总之，该方法为研究蛋白质和脂质在关键细胞过程中对膜形态塑造的相对贡献提供了一种有效手段。

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方案

1. 支架脂质体的制备

注意：理想情况下，初始实验应使用一种相对简单且无显著特征的支架（由DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱或PC）和DGS-NTA(Ni2+)（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)）组成）。在这些实验基础上，可依次引入脂质电荷、柔性及曲率作为独立因素，以研究其对膜近端相互作用的潜在影响。这些改变可通过添加特定量的特定脂质成分实现，包括磷脂酰丝氨酸或心磷脂（CL）、磷脂酰乙醇胺（DOPE或PE）以及半乳糖基(β)神经酰胺。

  1. 将溶解在氯仿中的脂质加入洁净的玻璃试管中。在旋转试管的同时用干燥氮气蒸发溶剂，形成一层薄的脂质膜。在37 °C下使用离心蒸发仪去除残留溶剂，持续1小时。
    注意：以下方案中使用了多种脂质体配方：支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni2+) / 96.7 mol% DOPC）、含心磷脂的支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni2+) / 10 mol% 心磷脂 / 86.7 mol% DOPC）、含心磷脂的柔性支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni2+) / 10 mol% 心磷脂 / 35 mol% DOPE / 51.7 mol% DOPC）以及富集型支架脂质体（10 mol% DGS-NTA(Ni2+) / 15 mol% 心磷脂 / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC）。
  2. 加入预热至37 °C的缓冲液A（25 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），150 mM KCl，用KOH调节pH至7.5），使最终脂质浓度为1 - 2 mM。在37 °C孵育30分钟，期间偶尔涡旋振荡，以充分重悬脂质混合物（图1a）。
  3. 转移至塑料试管中，将试管浸入液氮中直至完全冻结（约30秒），然后放入37 °C水浴中直至完全解冻（约1 - 2分钟）。总共重复4次冻融循环（图1b）。
  4. 通过将4个滤膜支撑架和一张聚碳酸酯滤膜浸泡在缓冲液中，并按照制造商说明组装脂质体挤出器。将脂质溶液通过滤膜挤出21次。使用轻柔且恒定的压力，以确保粒径分布均匀（图1c）。
    注意：本方案中所有实验均使用1.0 µm聚碳酸酯滤膜进行挤出。Drp1与带负电荷脂质的相互作用可在直径范围从50 nm到400 nm12甚至更大13的多种脂质体上观察到。因此，选择1 µm滤膜尺寸可同时适用于GTP酶活性实验和电子显微镜观察。若需要其他直径的脂质体，可采用巨大多层囊泡14,15（GUVs）或小单层囊泡16（SUVs）的制备方法。可使用动态光散射技术评估脂质体粒径的均一性13。
  5. 将挤出后的脂质体储存于4 °C，3 - 5天后弃用。

2. 利用支架脂质体进行蛋白质结合分析

  1. 样品制备
    1. 在缓冲液A + BME（25 mM HEPES、150 mM KCl、10 mM β-巯基乙醇（BME），用KOH调节pH至7.5）中，将His标签MffΔTM（终浓度5 µM）与支架脂质体（40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA(Ni2+)；终浓度50 µM）在室温下孵育至少15分钟。作为无Mff的对照组，将脂质体与His标签对照蛋白（如GFP）孵育，以结合并屏蔽暴露的NTA(Ni2+)位点。
      注意：MffΔTM的表达与纯化方法如先前研究所述2。GFP的纯化方法类似，但省略了离子交换步骤。本实验需使用BME，因为Drp1对氧化敏感，氧化可能改变其活性和组装特性。
    2. 加入Drp1（终浓度2 µM），在室温下孵育1小时。
      注意：Drp1的表达与纯化方法如先前研究所述2。与Drp1孵育后，可通过额外孵育1小时（含2 mM MgCl2以及1 mM GTP、1 mM GMP-PCP或缓冲液A + BME）来研究核苷酸结合对膜变形的影响。
  2. 负染透射电子显微镜（EM）分析
    1. 取5 µL样品置于实验室薄膜上，将覆碳铜/铑网格置于样品液滴上。孵育1分钟后，用滤纸吸去多余液体，再将网格转移至一滴2%醋酸铀酰中。染色1分钟后，用滤纸吸去多余染液，最后将网格放入网格盒中。置于真空环境中过夜，以确保完全干燥。
    2. 使用透射电子显微镜在18,500 - 30,000X 放大倍数下观察样品，以检测蛋白质和脂质体形态的超微结构变化17。 
      注意：可使用图像分析软件（如ImageJ13，http://imagej.nih.gov/ij/）对超微结构变化进行定量分析。通过与裸露的脂质模板比较，可评估蛋白质的包被程度。此外，管状结构片段的直径可从组装体最外侧进行测量13。更详细的结构分析可采用冷冻电子显微镜技术17。该方法可在无需重金属染色的情况下，在溶剂中直接观察天然的蛋白-脂质复合物。因此，能够检测并量化负染方法中无法显现的精细结构特征，包括底层脂质形态的变化。

3. 酶学检测中支架脂质体的应用

注意：采用比色法GTP酶检测18来测定GTP水解过程中释放的磷酸盐。也可使用其他GTP酶检测方法19，可根据需要进行选择和实施。

  1. 将His标签MffΔTM（Mff）、Fis1ΔTM（Fis1）或GFP（终浓度均为5 µM）与支架脂质体（终浓度150 µM）在Buffer A + BME中室温孵育15分钟（体积=30 µL）。加入Drp1（终浓度500 nM），继续室温孵育15分钟（体积=80 µL）。
    注意：Fis1 的纯化方法与 Mff 类似2，但省略了离子交换层析步骤。His标签GFP的目的是屏蔽NTA(Ni2+）头部基团，防止与其他蛋白质发生非特异性电荷相互作用。如果在无GFP存在时未观察到任何效应，则可能无需此对照。也可使用其他大小与目标蛋白相当的替代封闭蛋白，但GFP可实现与支架脂质体相互作用的直接可视化。
  2. 将试管转移至预热至 37 °C 的PCR仪中，通过加入 GTP 和 MgCl₂ 启动反应2 （终浓度分别为1 mM和2 mM；体积=120 µL）
  3. 在预定的时间点（即 T = 5、10、20、40、60 分钟时，将 20 µL 反应液转移至含 5 µL 0.5 M EDTA 的微孔板孔中，以螯合 Mg2+ 并终止反应。
  4. 通过稀释KH₂PO₄制备一组磷酸盐标准溶液2PO4 在缓冲液 A + BME 中校准结果。一组有用的标准品浓度为 100、80、60、40、20、10、5 和 0 µM。将每种标准品各 20 µL 加入含有 5 µL 0.5 M EDTA 的孔中。
  5. 向每个孔中加入 150 µL 孔雀石绿试剂（1 mM 孔雀石绿碳醇、10 mM 钼酸铵四水合物和 1 N HCl），读取 OD650 加样后5分钟
    注意：GTP 具有酸不稳定性，在孔雀绿试剂存在下会发生水解。务必保持加入孔雀绿试剂与检测之间的时间恒定，以确保结果的可重复性。
  6. 通过绘制OD值生成标准曲线650 标准品的吸光度与磷酸盐浓度之间的函数关系。采用线性回归法确定吸光度（OD）与磷酸盐浓度之间的关系650 以及样品中的磷酸盐浓度。
  7. 使用线性回归法，将 OD650 将蛋白质反应样品中的磷酸盐浓度测定结果转换为 µM 磷酸盐。通过绘制每种反应混合物中磷酸盐浓度随时间变化的曲线，确定其磷酸盐生成速率，并换算为 k猫 通过将速率除以 Drp1 浓度（0.5 µM）计算。
    注意：应仅使用初始线性速率来确定磷酸盐生成速率，且至少需使用3个数据点。如果反应速率过快，导致前三个数据点不呈线性关系（即 r2 若线性拟合的决定系数小于0.9，则应进行时间点更少但至少包含3个时间点的较短时间过程实验。

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结果

尽管Drp1与Mff之间的相互作用已被证明在线粒体分裂过程中具有重要作用，但该相互作用在体外（in vitro）条件下一直难以重现。我们的目标是更好地模拟Drp1与Mff在细胞内相互作用的环境。为此，通过如上所述的脂质膜再水化方法，制备了含有有限浓度NTA(Ni2+)头部基团的脂质体。初始脂质溶液包含直径不均一的单层和多层囊泡，溶液的浑浊现象可证明这一点（图1a）。通过冻融处理可降低溶液浑浊度（图1b），从而减少多层囊泡的比例。进一步通过聚碳酸酯滤膜挤出使脂质体直径均一化，最终得到澄清的溶液（图1c）。

在先前的研究中，我们发现 Drp1 能够在 Mff 修饰的支架脂质体上组装，当使用柔性膜时可观察到膜管形成2。基于这些发现，我们采用了一种由 PC、PE、Ni 和 CL 组成的新模板（称为富...

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讨论

本方案提供了一种研究涉及整合膜蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用的方法。通过使用模块化脂质体支架，研究人员能够在脂质邻近环境中评估一种或多种蛋白质的活性。先前的研究已证明了针对质膜受体酶的类似方法24-26。我们已将该方法扩展至包含脂质辅因子，并用于探究构成线粒体分裂机制机械酶核心的蛋白质之间的相互作用。

对于上述模型系统，我们发现Mff修饰的SL可增强Drp1的自组装。此外，我们目前结果显示，野生型Drp1能够高效重塑Mff修饰的ESL模板，形成延伸的管状结构。我们还评估了多种线粒体脂质的作用，包括带负电荷的心磷脂和锥形脂质磷脂酰乙醇胺（PE）。心磷脂与Mff协同作用，进一步增强Drp1的自组装；而PE赋予膜的柔韧性和流动性则促进膜管化，但不会进一步增强Mff诱导的激活作用。

为了评估膜形态的超微结构变化，需要进行电镜分析。Drp1 GTP酶活性通过丝状聚合物的聚集和组装而升高，但这些聚合物对脂质体的重塑作用并不显著2。然而，当使用更接近线粒体...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国心脏协会提供的资助（SDG12SDG9130039）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti Polar Lipids850375
磷脂酰乙醇胺（DOPE）Avanti Polar Lipids850725
DGS-NTA(Ni2+)Avanti Polar Lipids790404
牛心心磷脂（CL）Avanti Polar Lipids840012
氯仿Acros Organics268320010
脂质体挤出器Avanti Polar Lipids610023
铜/铑负染网格Ted Pella79712
微量离心管Beckman357448
GTPJena BiosciencesNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
微孔板条Thermo Scientific469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Instant Blue 考马斯亮蓝染料ExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
氯化镁Acros Organics223211000
4 - 20% SDS-PAGE 凝胶Bio Rad456-1096
4x Laemmli 上样缓冲液Bio Rad161-0747
HClFisher ScientificA144S
孔雀石绿卡宾醇Sigma Aldrich229105
四水合钼酸铵Sigma AldrichA7302
实验室封口膜ParafilmPM-996
醋酸铀酰Polysciences21447
Tecnai T12 100 keV 透射电子显微镜FEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 转子Beckman
制冷式 CentriVap 浓缩仪Labconico
Mastercycler Pro 梯度PCR仪Eppendorf
VersaMax 微孔板读板仪Molecular Devices

参考文献

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脂质近端相互作用线粒体分裂因子动力相关蛋白1脂质体挤出透射电子显微镜GTP酶活性检测孔雀石绿试剂His标签锚定
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