利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

摘要

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。

摘要

膜蛋白研究 体外 由于跨膜蛋白常含有疏水性跨膜结构域，其研究往往较为复杂。此外，将经去垢剂溶解的膜蛋白重新整合到脂质体中是一个随机过程，无法控制蛋白的拓扑结构，这进一步增加了研究难度。本文提出一种基于脂质体支架的替代方法，以克服上述技术难题。通过删除跨膜结构域增强蛋白的可溶性，并用一段连接基团（如His标签）替代该结构域中的氨基酸序列。该连接基团可与锚定基团（Ni²⁺ 由氮川三乙酸（NTA(Ni）配位²⁺）用于带有His标签的蛋白质），从而在脂质体表面形成一致的蛋白质拓扑结构。本文展示了一个应用该支架脂质体方法的研究实例，即通过该方法研究了动力相关蛋白1（Drp1）与一种整合膜蛋白——线粒体分裂因子（Mff）之间的相互作用。本研究中，我们证明了Mff能够高效地将可溶性Drp1招募至脂质体表面，并刺激其GTP酶活性。此外，在特定脂质存在的情况下，Drp1能够在Mff修饰的脂质模板上诱导膜管化。该实例通过结构与功能分析，验证了支架脂质体方法的有效性，并揭示了Mff在调控Drp1活性中的关键作用。

引言

研究膜近端蛋白质-蛋白质相互作用是一项具有挑战性的工作，原因在于难以重建所涉及的整合膜蛋白的天然环境¹。这主要是由于需要使用去垢剂进行增溶，以及蛋白质在蛋白脂质体中取向不一致。为避免这些问题，我们采用了一种策略：将整合膜蛋白的可溶性结构域表达为带His标签的融合蛋白，并通过这些可溶性片段与脂质表面NTA(Ni²⁺)头部基团的相互作用，将其锚定在支架脂质体上。利用此类支架，可在不同脂质和蛋白质组成的条件下研究脂质近端的蛋白质相互作用。

我们已有效应用该方法来研究调控线粒体分裂复合物组装的关键蛋白质-蛋白质相互作用，并分析调节此过程的脂质相互作用²在线粒体分裂过程中，一种称为动力相关蛋白1（Drp1）的保守膜重塑蛋白³，会响应调节能量稳态、凋亡信号传导及其他多种线粒体重要过程的细胞信号，被募集到线粒体外膜（OMM）表面。这种大型胞质GTP酶通过与线粒体外膜整合蛋白的相互作用，被招募至线粒体表面。^4-8一种此类蛋白——线粒体分裂因子（Mitochondrial Fission Factor, Mff）——的作用一直难以阐明，因其与Drp1的相互作用明显较弱 体外然而，遗传学研究已明确证实，Mff 对线粒体成功分裂至关重要。^7,8本文所述方法通过引入促进Drp1与Mff相互作用的同步脂质结合，....

方案

1. 支架脂质体的制备

注意：理想情况下，初始实验应使用一种相对简单且无显著特征的支架（由DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱或PC）和DGS-NTA(Ni²⁺)（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)）组成）。在这些实验基础上，可依次引入脂质电荷、柔性及曲率作为独立因素，以研究其对膜近端相互作用的潜在影响。这些改变可通过添加特定量的特定脂质成分实现，包括磷脂酰丝氨酸或心磷脂（CL）、磷脂酰乙醇胺（DOPE或PE）以及半乳糖基(β)神经酰胺。

1. 将溶解在氯仿中的脂质加入洁净的玻璃试管中。在旋转试管的同时用干燥氮气蒸发溶剂，形成一层薄的脂质膜。在37 °C下使用离心蒸发仪去除残留溶剂，持续1小时。
   注意：以下方案中使用了多种脂质体配方：支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni²⁺) / 96.7 mol% DOPC）、含心磷脂的支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni²⁺) / 10 mol% 心磷脂 / 86.7 mol% DOPC）、含心磷脂的柔性支架脂质体（3.3 mol% DGS-NTA(Ni²⁺) / 10 mol% 心磷脂 / 35 mol% DOPE / 51.7 mol% DOPC）以及富集型....

结果

尽管Drp1与Mff之间的相互作用已被证明在线粒体分裂过程中具有重要作用，但该相互作用在体外（in vitro）条件下一直难以重现。我们的目标是更好地模拟Drp1与Mff在细胞内相互作用的环境。为此，通过如上所述的脂质膜再水化方法，制备了含有有限浓度NTA(Ni²⁺)头部基团的脂质体。初始脂质溶液包含直径不均一的单层和多层囊泡，溶液的浑浊现象可证明这一点（图1a）。通过冻融处理可降低溶液浑浊度（图1b），从而减少多层囊泡的比例。进一步通过聚碳酸酯滤膜挤出使脂质体直径均一化，最终得到澄清的溶液（图1c）。

在先前的研究中，我们发现 Drp1 能够在 Mff 修饰的支架脂质体上组装，当使用柔性膜时可观察到膜管形成²。基于这些发现，我们采用了一种由 PC、PE、Ni 和 CL 组成的新模板（称为富.......

讨论

本方案提供了一种研究涉及整合膜蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用的方法。通过使用模块化脂质体支架，研究人员能够在脂质邻近环境中评估一种或多种蛋白质的活性。先前的研究已证明了针对质膜受体酶的类似方法^24-26。我们已将该方法扩展至包含脂质辅因子，并用于探究构成线粒体分裂机制机械酶核心的蛋白质之间的相互作用。

对于上述模型系统，我们发现Mff修饰的SL可增强Drp1的自组装。此外，我们目前结果显示，野生型Drp1能够高效重塑Mff修饰的ESL模板，形成延伸的管状结构。我们还评估了多种线粒体脂质的作用，包括带负电荷的心磷脂和锥形脂质磷脂酰乙醇胺（PE）。心磷脂与Mff协同作用，进一步增强Drp1的自组装；而PE赋予膜的柔韧性和流动性则促进膜管化，但不会进一步增强Mff诱导的激活作用。

为了评估膜形态的超微结构变化，需要进行电镜分析。Drp1 GTP酶活性通过丝状聚合物的聚集和组装而升高，但这些聚合物对脂质体的重塑作用并不显著²。然而，当使用更接近线粒体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷脂酰胆碱（DOPC）	Avanti Polar Lipids	850375
磷脂酰乙醇胺（DOPE）	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
牛心心磷脂（CL）	Avanti Polar Lipids	840012
氯仿	Acros Organics	268320010
脂质体挤出器	Avanti Polar Lipids	610023
铜/铑负染网格	Ted Pella	79712
微量离心管	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
微孔板条	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue 考马斯亮蓝染料	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
氯化镁	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE 凝胶	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli 上样缓冲液	Bio Rad	161-0747
HCl	Fisher Scientific	A144S
孔雀石绿卡宾醇	Sigma Aldrich	229105
四水合钼酸铵	Sigma Aldrich	A7302
实验室封口膜	Parafilm	PM-996
醋酸铀酰	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV 透射电子显微镜	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 转子	Beckman
制冷式 CentriVap 浓缩仪	Labconico
Mastercycler Pro 梯度PCR仪	Eppendorf
VersaMax 微孔板读板仪	Molecular Devices