本文介绍了在实验室中饲养中间型胚发育甲虫——斑拟 beetles（Dermestes maculatus，D. maculatus）的实验方案。同时分享了针对该物种的胚胎期和亲代RNA干扰（RNAi）实验方法，以及用于分析胚胎表型以研究基因功能的技术手段。
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本文内容
摘要
摘要
基因组学的进步使得以前所未有的规模探究生物多样性成为可能。然而，若缺乏研究基因功能的工具，仅靠序列信息将难以提供充分的生物学洞见。因此，开发并共享在实验室中建立新型模式系统的详细实验方案，以及开展功能研究所需的技术工具，对于充分发挥基因组学的潜力至关重要。鞘翅目（Coleoptera，即甲虫）是昆虫中种类最丰富的类群，几乎占据了地球上所有类型的生境。除了为基础研究提供理想模型外，甲虫的研究还可能对害虫防治产生重要影响，因为许多甲虫是家庭、农业和食品工业中的常见害虫。有关甲虫饲养与维持的详细实验方案 D. maculatus 实验室种群的建立及进行dsRNA介导的干扰实验 D. maculatus 展示了胚胎和亲代RNAi实验的完整流程，包括仪器设备的设置、样品制备、显微注射以及注射后的恢复操作。同时介绍了胚胎表型分析的方法，包括存活率检测、孵化幼虫的图式形成缺陷观察，以及未孵化幼虫的体壁制备与分析。这些实验方法，结合 原位 分子标记的杂交与免疫染色，制备 D. maculatus 一个适用于基础与应用研究的易得模型系统。它们还为在其他新兴昆虫模型系统中建立实验流程提供了有用的信息。
引言
1998年，Fire和Mello报道双链RNA（dsRNA）可在Caenorhabditis elegans中诱导基因功能的抑制1。这种由dsRNA引发的反应被称为RNA干扰（RNAi），并且已报道这种RNAi介导的基因沉默在动物、植物和真菌中均具有保守性2-7。在植物和某些动物中，RNAi具有系统性作用，即其效应可扩散至未直接引入dsRNA的其他细胞/组织（综述见8-10）。研究人员已利用这种内源性的细胞RNAi反应，通过设计靶向特定目的基因的dsRNA，从而在不直接操纵基因组的情况下实现基因功能的敲低（综述见11-14）。
RNAi 因具有以下优势，成为功能研究中的强大工具。首先，即使基因序列信息有限，也可利用 RNAi 靶向特定基因。这一点对于缺乏基因组或转录组数据的非模式生物研究尤为重要。其次，在 RNAi 响应具有强系统性的生物中，几乎可在任何发育阶段实现 RNAi 介导的基因敲低。这一特性对于研究具有多效性功能的基因尤为有用。第三，在某些情况下，RNAi 效应可扩散至生殖腺和后代，从而在子代中观察到表型15,16。这种现象被称为亲代 RNAi（pRNAi），对于影响胚胎发育的基因研究特别有利，因为可通过单个注射亲本产生的大量后代进行表型分析，而无需直接操作卵子。基于这些原因，pRNAi 是首选方法。然而，若 pRNAi 无效（例如对于卵子....
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方案
1. D. maculatus 的饲养
注意：作者实验室使用从商业渠道购买的成虫和幼虫建立了D. maculatus的繁殖种群。物种鉴定通过DNA条形码技术完成53。
- 在实验室中设置新饲养笼时，将一层薄薄的木屑铺入中等尺寸的昆虫饲养笼（30.5 x 19 x 20.3 cm3）内。在笼中放入一块约 10 x 6 x 3 cm3 的泡沫塑料，供幼虫在化蛹期间藏匿。加入 20 - 50 只甲虫（成虫或末龄幼虫）。甲虫会隐藏在木屑中。
- 在培养皿或称量舟中加入湿润的猫粮。用网纱覆盖饲养笼，并将笼子置于培养箱中。
- 为在实验室中维持一个繁殖种群，应将温度控制在 25 至 30 °C 之间。D. maculatus 在较高温度下生长更快，但也会促进真菌和螨类的生长。为维持健康的种群，常规保种建议使用 25 - 28 °C，快速扩增种群时可采用 30 °C。其生命周期约为三周至四个月，具体时长取决于环境因素50（图 2）。
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结果
作者的实验室已采用RNAi技术研究调控昆虫体节形成的基因功能演化53,55。尽管所有昆虫都具有体节，但调控该过程的基因在昆虫的辐射演化过程中似乎已发生分化26,38,56-63。在黑腹果蝇（Drosophila）中进行的遗传筛选鉴定出一组九个成对规则（pair-rule）体节基因，这些基因负责促进体节的形成64-70。本文利用其中一基因paired（prd）的直系同源基因，以证明RNAi技术在研究D. maculatus基因功能中的实用性。
eRNAi 和 pRNAi 均可有效用于揭示功能角色 Dmac-prd 在该物种的节段形成过程中。2 - 3 µg/µl 靶向dsRNA的设计 Dmac-prd (图8B、图8D
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讨论
尽管在20世纪后期发展出少数几种复杂的模式生物系统（小鼠、果蝇、线虫），th 21世纪，21st 近一个世纪以来，全球各地的实验室中涌现出一系列新动物模型系统的开发。这些新系统使科学家能够探究仅依靠“标准”模式生物无法回答的比较性与进化性科学问题。新模型的引入迫切需要建立针对新物种的实验室培养、基因鉴定及功能研究方法的快速开发体系。本文介绍了饲养 D. maculatus 在实验室中，本文提供了针对该甲虫的胚胎RNAi、亲代RNAi以及表型分析的逐步实验方案。目标是通过这些描述鼓励更多研究者采用 D. maculatus 在他们自己的实验中，并利用本文介绍的方法开发更多新的模式物种。
尽管 D. maculatus 实验室种群极易维持，但饲养该物种的一个局限性在于，作为甲虫食物来源的湿猫粮会散发难闻的气味。为避免这一问题，研究人员测试了乳清/大豆蛋白粉、奶酪、研磨狗粮以及 奶粉等替代食物，这些食物可添加或不添加湿棉球以调节湿度。 其中，研磨狗粮是最有效的替代食物，可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Alison Heffer 博士和 Yong Lu 博士协助搭建显微注射装置，并分享他们在昆虫 RNA 干扰领域的宝贵知识与经验。本工作由美国国立卫生研究院（R01GM113230，资助对象：L.P.）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dermestes maculatus 活体甲虫 | 本实验室或 Carolina Biological Supply | #144168 | 本实验室菌株经 COI 条形码验证；来自 Carolina 的菌株变异尚不能排除 |
| 湿猫粮 | Fancy Feast | 含肉块和肉汁。可在大多数宠物食品店和杂货店购买 | |
| 干狗粮 | Purina Puppy Chow | 可在大多数宠物食品店和杂货店购买 | |
| 昆虫饲养笼（中号，30.5 × 19 × 20.3 cm） | Exo Terra | PT2260 | 用于种群维持。可根据需要使用更大的饲养笼 |
| 昆虫饲养笼（迷你号，17.8 × 10.2 × 12.7 cm） | Exo Terra | PT2250 | 用于胚胎收集 |
| 培养皿 | VWR | 89038-968 | |
| 棉球 | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 转录试剂盒 | Fisher | AM1334 | 适用于 40 次反应 |
| 气动泵 | WPI | PV830 | |
| 毛细管夹持器 | WPI | ||
| 显微操作仪 | NARISHIGE | MN-151 | |
| 黑色滤纸（90 mm） | VWR | 28342-010 | |
| 食用色素（绿色） | McCormick | ||
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Hilgenberg | 1406119 | |
| 拉针仪（微移液管拉制仪） | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 显微镜载玻片 | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| 封口膜（Parafilm M） | Fisher | 13-374-12 | |
| 801 型注射器（10 µl） | Hamilton | 7642-01 | |
| 针头（32 号） | Hamilton | 7762-05 | |
| 固定液（Pampel's 溶液） | BioQuip Products, Inc. | 1184C | 有毒，需在通风橱中操作 |
| 镊子（DUMONT #5） | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 盖玻片（24 × 50 mm，No. 1.5） | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader 移液吸头 | Fisher | E5242956003 | |
| 用于胚胎显微注射的解剖显微镜 | Leica | M420 | |
| 用于幼虫表型观察的解剖显微镜 | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| 微分干涉相差显微镜（DIC 显微镜） | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
参考文献
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in....
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重印与许可
