需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

中国台湾甲虫 Dermestes maculatus 的饲养及双链RNA介导的基因敲低

10.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54976

⸱

2016年12月28日

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

本文内容

摘要

本文介绍了在实验室中饲养中间型胚发育甲虫——斑拟 beetles（Dermestes maculatus，D. maculatus）的实验方案。同时分享了针对该物种的胚胎期和亲代RNA干扰（RNAi）实验方法，以及用于分析胚胎表型以研究基因功能的技术手段。

摘要

基因组学的进步使得以前所未有的规模探究生物多样性成为可能。然而，若缺乏研究基因功能的工具，仅靠序列信息将难以提供充分的生物学洞见。因此，开发并共享在实验室中建立新型模式系统的详细实验方案，以及开展功能研究所需的技术工具，对于充分发挥基因组学的潜力至关重要。鞘翅目（Coleoptera，即甲虫）是昆虫中种类最丰富的类群，几乎占据了地球上所有类型的生境。除了为基础研究提供理想模型外，甲虫的研究还可能对害虫防治产生重要影响，因为许多甲虫是家庭、农业和食品工业中的常见害虫。有关甲虫饲养与维持的详细实验方案 D. maculatus 实验室种群的建立及进行dsRNA介导的干扰实验 D. maculatus 展示了胚胎和亲代RNAi实验的完整流程，包括仪器设备的设置、样品制备、显微注射以及注射后的恢复操作。同时介绍了胚胎表型分析的方法，包括存活率检测、孵化幼虫的图式形成缺陷观察，以及未孵化幼虫的体壁制备与分析。这些实验方法，结合 原位 分子标记的杂交与免疫染色，制备 D. maculatus 一个适用于基础与应用研究的易得模型系统。它们还为在其他新兴昆虫模型系统中建立实验流程提供了有用的信息。

引言

1998年，Fire和Mello报道双链RNA（dsRNA）可在Caenorhabditis elegans中诱导基因功能的抑制1。这种由dsRNA引发的反应被称为RNA干扰（RNAi），并且已报道这种RNAi介导的基因沉默在动物、植物和真菌中均具有保守性2-7。在植物和某些动物中，RNAi具有系统性作用，即其效应可扩散至未直接引入dsRNA的其他细胞/组织（综述见8-10）。研究人员已利用这种内源性的细胞RNAi反应，通过设计靶向特定目的基因的dsRNA，从而在不直接操纵基因组的情况下实现基因功能的敲低（综述见11-14）。

RNAi 因具有以下优势，成为功能研究中的强大工具。首先，即使基因序列信息有限，也可利用 RNAi 靶向特定基因。这一点对于缺乏基因组或转录组数据的非模式生物研究尤为重要。其次，在 RNAi 响应具有强系统性的生物中，几乎可在任何发育阶段实现 RNAi 介导的基因敲低。这一特性对于研究具有多效性功能的基因尤为有用。第三，在某些情况下，RNAi 效应可扩散至生殖腺和后代，从而在子代中观察到表型15,16。这种现象被称为亲代 RNAi（pRNAi），对于影响胚胎发育的基因研究特别有利，因为可通过单个注射亲本产生的大量后代进行表型分析，而无需直接操作卵子。基于这些原因，pRNAi 是首选方法。然而，若 pRNAi 无效（例如对于卵子发生所必需的基因），则必须采用胚胎 RNAi（eRNAi）。第四，RNAi 可用于模拟等位基因系列的效果，通过在一定范围内调节导入的 dsRNA 量，产生从弱到强不同程度的缺陷表型。当基因参与复杂过程或其完全功能缺失致死时，这种表型梯度有助于理解基因功能。第五，dsRNA 的递送通常简便可行，尤其适用于表现出强系统性 RNAi 响应的动物。dsRNA 可通过显微注射1,5、饲喂/摄食17,18、浸泡19,20以及病毒/细菌介导递送21,22等方式引入。第六，与某些基因靶向或编辑方法不同，使用 RNAi 无需筛选携带突变的个体，也无需进行遗传杂交以获得纯合子。因此，与其他多种基因功能研究技术相比，RNAi 更快速、成本更低，并可用于大规模筛选23-25。

RNAi 的广泛应用为在多种生物体中开展功能研究提供了手段，从而将可用于研究的物种范围扩展到传统模式生物系统之外，这些传统模式生物系统已开发出相应的遗传工具。例如，需要利用非模式系统的研究，通过比较代表不同发育模式或具有显著形态特征物种中的直系同源基因功能，来揭示基因及基因网络的进化规律26-29。此类研究将加深我们对生物多样性的理解，对应用研究和基础研究均具有重要意义。

作为地球上最大的动物类群，昆虫为探索多样性形成机制提供了极佳的研究机会。此外，昆虫通常体型较小，生命周期短，繁殖力高，且易于在实验室中进行培养。在过去二十年中，RNAi 技术已成功应用于多个昆虫目，包括双翅目（真蝇类）5，鳞翅目（蝴蝶和蛾类）30，鞘翅目（甲虫）16,31，膜翅目（叶蜂、黄蜂、蚂蚁和蜜蜂）32，半翅目（蝽类），等翅目（白蚁）34，蜚蠊目（蟑螂）35，直翅目（蟋蟀、蝗虫、蚱蜢和螽斯）36和虱目（虱子）37RNAi 的成功应用为早期胚胎发生（前后轴）模式形成研究提供了功能数据32，背腹轴28，分割26,38），性别决定39,40，几丁质/表皮合成41，蜕皮激素信号传导42，社会行为43，以及其他方面。针对不同昆虫物种开发的RNAi方法可能具有额外优势，因其可能适用于害虫防治（综述见44-46）。只要选择非保守区域作为靶点，RNAi效应将具有基因特异性和物种特异性。对于蜜蜂和家蚕等有益昆虫物种，通过靶向对病毒或寄生虫存活至关重要的基因以控制感染，可能为保护这些物种提供一种新颖的策略47,48.

Dermestes maculatus（D. maculatus），俗称皮蠹，除南极洲外广泛分布于全球。作为一种完全变态昆虫，D. maculatus 的生命周期包括胚胎期、幼虫期、蛹期和成虫期（图1）。由于其以动物组织为食，D. maculatus 常被博物馆用于清理动物尸体以制备骨骼标本，法医昆虫学家也可利用其发育阶段推断死亡时间49,50。D. maculatus 取食多种动物性产品，包括动物尸体、干肉、奶酪以及其他昆虫的蛹或茧，因此会对家庭环境、储存食品以及丝绸、奶酪和肉类产业造成损害51,52。在该 beetle 中应用RNAi技术，可能为减少其经济危害提供一种高效且环境友好的策略。本实验室已将 D. maculatus 作为一种新的模式昆虫用于体节形成的研究53。除易于实验室饲养外，D. maculatus 在基础研究中也具有重要意义，因其属于中等胚带发育类型，是研究短胚带与长胚带发育模式之间过渡机制的有用物种。

昆虫生命周期示意图：卵、幼虫、蛹、成虫阶段及相应尺度测量。
图1：D. maculatus 的生命周期。 图中展示了 D. maculatus 在不同生命阶段的形态。在30 °C条件下，从卵发育至成虫需三周时间，而在较低温度下则需要更长时间。（A, F） 新产的胚胎呈白色至浅黄色，卵圆形，长约1.5 mm。在30 °C时，胚胎发育约需55小时。（B, C 和 G） 幼虫具有深色色素条纹，并被刚毛覆盖。幼虫经历多个龄期，具体数量取决于环境条件，体长可超过1 cm。（D, H） 初期蛹体呈浅黄色。在30 °C时，化蛹过程约持续5–7天。（E, I） 羽化后不久，成虫甲虫体表出现深色色素沉着。成虫可存活数月，一只雌虫在其一生中可产数百枚卵。请点击此处查看该图的高清版本。

此前，我们已证明RNAi在D. maculatus53中可有效敲低基因功能。本文分享了我们在实验室中饲养D. maculatus种群的经验，并提供了胚胎期和亲代RNAi的建立、注射、注射后护理及表型分析的逐步操作方案。此处介绍的dsRNA介导的基因敲低与分析方法，不仅为研究D. maculatus中的科学问题提供了详细的技术支持，也为在其他非模式甲虫/昆虫物种中应用RNAi技术提供了潜在的重要参考。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. D. maculatus 的饲养

注意：作者实验室使用从商业渠道购买的成虫和幼虫建立了D. maculatus的繁殖种群。物种鉴定通过DNA条形码技术完成53。

  1. 在实验室中设置新饲养笼时，将一层薄薄的木屑铺入中等尺寸的昆虫饲养笼（30.5 x 19 x 20.3 cm3）内。在笼中放入一块约 10 x 6 x 3 cm3 的泡沫塑料，供幼虫在化蛹期间藏匿。加入 20 - 50 只甲虫（成虫或末龄幼虫）。甲虫会隐藏在木屑中。
  2. 在培养皿或称量舟中加入湿润的猫粮。用网纱覆盖饲养笼，并将笼子置于培养箱中。
  3. 为在实验室中维持一个繁殖种群，应将温度控制在 25 至 30 °C 之间。D. maculatus 在较高温度下生长更快，但也会促进真菌和螨类的生长。为维持健康的种群，常规保种建议使用 25 - 28 °C，快速扩增种群时可采用 30 °C。其生命周期约为三周至四个月，具体时长取决于环境因素50（图 2）。

昆虫生物降解实验；含聚苯乙烯泡沫、木屑、猫粮的实验装置；生态学研究。
图 2： D. maculatus 实验室种群。 显示一个典型的 D. maculatus 昆虫饲养笼照片。笼内铺有木屑，供甲虫躲藏。在小型培养皿或称量舟中添加猫粮作为食物。笼内放置聚苯乙烯泡沫，为末龄幼虫化蛹提供庇护所。图中所示饲养笼尺寸为 30.5 × 19 × 20.3 cm3，饲养有数百只幼虫、蛹和成虫。请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 将卵留在笼中使其发育成熟。为扩大种群，可使用卵（按第2节所述方法收集）、幼虫或成虫建立新的培养笼。通常情况下，D. maculatus 会在整个笼内产卵，尤其靠近食物来源处。
  2. 每周更换约两次湿猫粮。
    注意：由于湿猫粮具有难闻的气味，也测试了其他替代性食物来源（见讨论部分）。

2. 胚胎收集

  1. 准备收集时，从种群中分离出至少50只雄性和50只雌性成虫。以年轻成虫为佳。将成虫放入小型饲养盒（17.8 x 10.2 x 12.7 cm3）中，盒内不加木屑。在称量舟中加入猫粮。
  2. 开始收集前，仔细检查饲养盒内是否存在胚胎，并将其移除。将一个拉伸过的棉球放入饲养盒中，然后将盒子置于30 °C的培养箱中。经过适当的时间后，棉球即可用于胚胎收集。
  3. 将一张A4大小的黑色卡纸对折以形成折痕，然后展开。
  4. 从饲养盒中取出拉伸过的棉球。将成虫从棉球上移除，并放回饲养盒中。
  5. 轻轻捏住拉伸过的棉球，缓慢将其撕成细棉丝，使卵落入黑色纸张上。
    注意：D. maculatus 胚胎脆弱且在棉纤维中难以观察。若捏棉球过紧，容易压碎胚胎。

3. dsRNA 的制备

  1. dsRNA合成用DNA模板的制备
    1. 运行 4 - 6 50 µl 根据制造商说明书，使用在5'端均含有T7启动子序列的引物进行PCR反应以扩增DNA模板。
    2. 使用商业化的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，具体操作按照制造商说明书进行。DNA模板的理想终浓度应≥ 100 ng/μL。µl.
  2. 注射缓冲液制备
    1. 配制 100 ml 注射缓冲液（0.1 mM NaH2PO4，5 mM KCl）。用 5 M NaOH 调节 pH 至 6.8。
    2. 将分装样品储存于 -20 °C.
  3. dsRNA 合成
    1. 在冰上于0.2 ml PCR管中设置反应，并进行后续操作 体外 使用约 500 ng 模板，按照制造商说明，用 T7 聚合酶进行转录反应。
    2. 将试管在指定条件下孵育 37 °C 过夜。
    3. 按照制造商说明书用DNase消化DNA模板。
    4. 将试管加热至 94 °C 并保持在 94 °C 3 分钟。
    5. 为了退火dsRNA，缓慢冷却离心管 1 °C/分钟，直至达到 45 °C 1 小时后。
      注意：步骤 3.3.2 至 3.3.5 可在 PCR 仪中进行。
    6. 向dsRNA的乙醇沉淀中加入 280 µl 无RNase水 20 µl 调整反应体积至最终体积 300 µl添加 30 µl 3 M NaOAc（pH 5.2）的 650 µl 乙醇。将离心管置于 -20 °C 冰箱过夜。
    7. 在 4 °C 下以 15,682 × g 离心 30 分钟后 4 °C，用70%乙醇洗涤dsRNA沉淀。干燥沉淀后溶于 20 µl 注射缓冲液
    8. 使用分光光度计在 A 处测定 dsRNA 的浓度260. 理想浓度为 3 - 5 µg/µl. 通过运行来检查质量 5 µl 在1%琼脂糖凝胶中以90 V电泳30分钟，检测1:25稀释的dsRNA。可见一条大小符合预期的单一条带。
    9. 将dsRNA储存在-20 °C 或更低的温度。
      注意：每次RNAi敲低实验均需设置对照dsRNA，该dsRNA不应影响所研究的生物学过程。 gfp dsRNA 是大多数实验的理想对照。应将对照 dsRNA 与实验用 dsRNA 同步制备并平行注射。

4. 显微注射仪和显微操作器的组装

注：参见图3。

  1. 将氮气或其他气源连接至气动泵仪器的压力输入端。若无气动泵，可使用连接细管的 50 ml 注射器施加压力。
  2. 将脚踏开关连接至泵的远程控制接口，以控制喷射压力流。
  3. 通过管路将玻璃毛细管夹持器连接至泵的喷射压力出口。
  4. 将毛细管夹持器固定在体视显微镜附近的显微操作仪上。

5. 胚胎RNA干扰

注意：图4展示了D. maculatus胚胎RNA干扰的流程图。

  1. eRNAi 制备
    1. 准备一个用于收集胚胎的培养皿盖（直径 90 mm）。在盖子内侧放置一片黑色滤纸，并将标准显微镜载玻片置于黑色滤纸上。
    2. 用注射缓冲液将 dsRNA 稀释至适当浓度。初次实验建议使用 2 - 3 µg/µl 的浓度。注射前应始终将 dsRNA 置于冰上保存。
    3. 向 dsRNA 溶液中加入食用染料，稀释比例为 1:40，轻轻吹打数次以充分混匀。
  2. 收集用于注射的胚胎
    注意：在 25 °C 条件下，产卵后 6 - 8 小时（AEL）的胚胎细胞核会向卵边缘迁移53。细胞化囊胚在产卵后 8 - 10 小时内形成53。为确保注射时胚胎处于细胞化囊胚阶段之前，建议使用产卵后 0 - 3 小时的胚胎53。若玻璃毛细管状态良好，胚胎收集、准备和注射过程通常可在 2 小时内完成。因此，整个操作可在产卵后 5 小时内完成。
    1. 按照步骤 2.2–2.5 所述方法收集胚胎。
    2. 轻敲黑色卡纸，将胚胎转移至收集用培养皿盖中。
    3. 沿载玻片边缘粘贴双面胶带。
    4. 使用画笔将胚胎沿胶带排列，使其垂直于载玻片边缘，前端或后端位于边缘处。需注意早期胚胎的前后端不易区分，因此平均约有一半胚胎将在后端被注射，这正是理想情况。
  3. 将 dsRNA 装载至玻璃毛细管
    1. 用 20 µl 微量移液器吸头吸取 2 - 4 µl dsRNA 溶液。
    2. 将吸头插入预先拉制好的玻璃毛细管（以下简称针头）中，轻轻吹打将 dsRNA 溶液注入毛细管。使用微电极拉制仪从商用玻璃毛细管制备针头。理想拉制针头的示例如 图 5 所示。针头的长度和锥度可能需要根据注射试验结果进行优化。
    3. 将玻璃毛细管固定于毛细管夹持器中。
    4. 将夹持器安装至显微操作仪上。
  4. 向胚胎注射 dsRNA
    1. 小心地将带有胚胎的载玻片转移至解剖显微镜的载物台上。
    2. 移动载玻片，使一个胚胎位于视野中央，并调节显微镜焦距。
    3. 在观察解剖显微镜的同时，使用显微操作仪调整毛细管尖端位置，使其靠近该排第一个胚胎的末端。
    4. 打开氮气或其他气源。
    5. 将电磁阀输入选择开关设为“真空”模式。
    6. 调节喷射压力调节器至 10 - 15 psi。根据具体设备情况调整压力。
    7. 如有必要，打开毛细管尖端。一旦尖端打开，染色的 dsRNA 溶液将充满尖端。
    8. 向前移动毛细管尖端以刺入胚胎。若压力设置合适，则不会有胚胎液流入毛细管内。
    9. 踩下脚踏开关，将 dsRNA 溶液注入胚胎，直至注入适量溶液为止。图 5 展示了注入适量与过量溶液后胚胎形态的示例。
    10. 保持毛细管尖端在胚胎内约 2 秒，然后将其抽出。
    11. 将毛细管移至下一个胚胎，重复步骤 5.4.8 - 5.4.10，直至所有胚胎均完成注射。若毛细管堵塞或断裂，应及时更换。
  5. 注射后恢复与孵育
    1. 注射完成后，将载玻片放入培养皿中。
    2. 在培养皿中加入一个湿润的棉球。注意棉球不得接触载玻片。
    3. 盖上培养皿并用封口膜密封。在皿上标记 dsRNA 名称、浓度、日期、时间及注射胚胎数量。
    4. 将培养皿置于 30 °C 恒温培养箱中，直至胚胎孵化。

6. 亲代RNA干扰

  1. 用于pRNAi的蛹的分离
    1. 从蜂群中收集蛹。
    2. 在显微镜下区分雄性和雌性蛹（见图6）。将它们分别置于两个不同的培养皿中，并置于30 °C的培养箱内，以确保在注射前不会发生交配。
    3. 每天检查羽化的成虫。在30 °C条件下，蛹期通常持续5 - 7天。
    4. 将已羽化的雄虫和雌虫（见图6）分别转移到两个不同的培养皿中，每隔一天喂食一次猫粮，直至其适合进行注射。
    5. 当获得足够数量且处于合适年龄的雌虫和雄虫时，即可进行注射。最佳注射时机为雌虫羽化后4至8天。典型分析通常使用8 - 12只雌虫，同时需要相同数量的雄虫用于交配54。
  2. 向雌虫腹部注射dsRNA
    1. 将dsRNA置于冰上准备（参见5.1.2和5.1.3）。
    2. 将一根32号针头连接至10 µl注射器上。
    3. 将雌虫置于CO2麻醉台上进行麻醉。
    4. 将dsRNA溶液吸入注射器，避免吸入空气。
    5. 用一只手固定雌虫，使其腹面朝上，另一只手握住注射器。
    6. 用针尖轻轻刺穿第二和第三腹板之间的节间膜（segmacoria）。图7展示了正在进行注射的雌虫。若针头难以刺入组织，可将针头略微向上倾斜并缓慢下压。将针头插入体内约2 mm。
    7. 缓慢推动注射器推杆的同时观察刻度，每只雌虫注射约2 µl。
    8. 注射完成后，将针头在雌虫腹部停留至少5秒后再拔出。
    9. 将注射后的雌虫转移至一个培养皿（直径90 mm）中，并喂食猫粮。
    10. 在培养皿上标注所注射dsRNA的名称、注射量、日期以及雌虫数量。
  3. 注射后恢复与交配
    1. 将培养皿置于30 °C培养箱中培养。
    2. 24小时后，将注射过的雌虫转移至小型笼中。
    3. 向笼中加入相同数量未经注射的年轻雄虫，并对笼子进行标记。
    4. 在笼内放入装有猫粮的称量舟。
    5. 将笼子置于30 °C培养箱中以允许交配。24小时后，雌虫应开始产卵，可每日或按所需时间间隔收集卵和胚胎。

7. RNAi 后的表型分析

注意：在 30 °C 条件下，卵约需 55 小时才能孵化50。

  1. eRNAi 存活率分析
    1. 通过比较孵化幼虫数量与注射胚胎总数来计算孵化率。务必设置阴性对照注射组，因为注射操作本身可能对胚胎造成损伤或致死。典型的孵化率范围为 30% - 60%。注意已孵化的幼虫可能会取食未孵化的卵。
  2. pRNAi 存活率分析
    注意：如果RNAi靶向的基因影响了雌虫的存活率，则注射了特异性dsRNA但未注射阴性对照dsRNA的雌虫将开始死亡。如果卵的产生或产卵行为受到影响，雌虫将表现出部分或完全不育。应评分雌虫存活情况并与阴性对照组比较，或比较实验组与对照组雌虫所产卵的总数（7.2.3）。
    1. 按照步骤 2.2 设置胚胎收集。
    2. 24 小时后，按照步骤 2.4 - 2.5 收集胚胎。
    3. 计数胚胎总数。
    4. 将胚胎转移至一个 90 mm 的培养皿中。在培养皿上标记所靶向的基因、收集日期以及胚胎数量。
    5. 将胚胎置于 30 °C 培养箱中孵育直至孵化。由于已孵化的幼虫会取食未孵化的胚胎，需频繁检查培养皿，并使用镊子将已孵化的幼虫与未孵化的胚胎分离（参见讨论部分）。
    6. 计数已孵化的胚胎数量，并计算孵化率。
  3. 检查已孵化幼虫的表皮缺陷
    1. 将已孵化的幼虫收集至一个 1.5 ml 的微量离心管中。
    2. 在通风橱中，加入 1 ml 固定液。
    3. 将微量离心管置于 4 °C 至少过夜，以使固定液充分渗透幼虫组织。
    4. 为便于观察，尽可能吸除管中的固定液。
    5. 用 PBST 至少清洗幼虫三次。
    6. 使用剪去末端以扩大口径的 P-1000 移液枪头，将幼虫转移至含 PBST 的多孔玻璃板中。
    7. 在解剖显微镜下，使用镊子拉伸幼虫以检查其缺陷。必须将幼虫充分拉伸，因为其身体在固定液中会收缩，影响观察。
  4. 检查未孵化幼虫的表皮缺陷
    注意：本方法适用于早期胚胎表型的观察，尤其适用于未能存活至孵化阶段的胚胎。
    1. 对于 pRNAi，向培养皿（7.2.4）中加入 PBST，并使用剪去末端的 P-1000 移液枪头将未孵化的胚胎转移至 1.5 ml 微量离心管中。对于 eRNAi，向培养皿（5.5.4）中加入 PBST，用刷子将未孵化的胚胎从载玻片上刷下并转移至微量离心管中。
    2. 使用固定液对胚胎进行固定，并按照步骤 7.3.2 - 7.3.6 使用 PBST 清洗，以便观察。
    3. 在解剖显微镜下，于 PBST 中使用镊子将胚胎从卵壳中解剖出来。
    4. 将胚胎重新转移回 1.5 ml 微量离心管中（每管约含 200 µl 胚胎）。
    5. 尽可能吸除所有液体。
    6. 加入 1 ml 90% 乳酸/10% 乙醇。将离心管置于 60 °C 培养箱中至少过夜。
      注意：胚胎可在 60 °C 下放置数天。
    7. 为制片，使用剪去末端的 P-1000 移液枪头将胚胎转移至载玻片上。
    8. 使用镊子手动将胚胎调整至理想方向。
    9. 用盖玻片覆盖胚胎，并在显微镜下使用微分干涉对比（DIC）进行观察。
  5. 检查细胞与分子缺陷
    注意：本方法适用于研究表皮表型或未伴随表皮缺陷的致死现象的潜在原因。
    1. 对于 pRNAi，在适当发育阶段将胚胎从棉球上分离，并转移至胚胎收集篮中。该收集篮可与用于 Drosophila 胚胎收集的装置相同或类似。
      1. 使用一个 25 ml 塑料闪烁瓶制作收集篮，切去瓶底，并在瓶盖上切出一个约 1 cm 直径的圆孔。将一个直径约 2.5 cm 的超细网筛放入瓶盖内，然后将闪烁瓶旋紧并倒置使用。
      2. 由于网筛可轻易取出以便清洗胚胎，可将网筛浸入盛有水的微量离心管中，以回收粘附在网筛上的任何胚胎。
    2. 对于 eRNAi，在适当阶段向培养皿中加入 PBST。将胚胎从载玻片上刷下，并转移至胚胎收集篮中。
      注意：固定、原位 杂交、抗体染色及细胞核染色的实验方案可参见 Xiang et al. 201553。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

作者的实验室已采用RNAi技术研究调控昆虫体节形成的基因功能演化53,55。尽管所有昆虫都具有体节，但调控该过程的基因在昆虫的辐射演化过程中似乎已发生分化26,38,56-63。在Drosophila中进行的遗传筛选鉴定出一组九个成对规则（pair-rule）体节基因，这些基因负责促进体节的形成64-70。本文利用其中一员——paired（prd）基因的直系同源物，以展示RNAi技术在研究D. maculatus基因功能中的应用价值。

eRNAi 和 pRNAi 均能有效揭示相关基因的功能作用 Dmac-prd 在该物种的节段形成过程中。2 - 3 µg/µl 靶向dsRNA的设计 Dmac-prd (图8B，图8D

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

尽管在20世纪后期发展出少数几种复杂的模式生物系统（小鼠、果蝇、线虫），th 21世纪，21st 近一个世纪以来，全球各地的实验室中涌现出一系列新动物模型系统的开发。这些新系统使科学家能够探究仅依靠“标准”模式生物无法回答的比较性与进化性科学问题。新模型的引入迫切需要建立针对新物种的实验室培养、基因鉴定及功能研究方法的快速开发体系。本文介绍了饲养 D. maculatus 在实验室中，本文提供了针对该甲虫的胚胎RNAi、亲代RNAi以及表型分析的逐步实验方案。目标是通过这些描述鼓励更多研究者采用 D. maculatus 在他们自己的实验中，并利用本文介绍的方法开发更多新的模式物种。

尽管 D. maculatus 实验室种群极易维持，但饲养该物种的一个局限性在于，作为甲虫食物来源的湿猫粮会散发难闻的气味。为避免这一问题，研究人员测试了乳清/大豆蛋白粉、奶酪、研磨狗粮以及 奶粉等替代食物，这些食物可添加或不添加湿棉球以调节湿度。 其中，研磨狗粮是最有效的替代食物，可...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Alison Heffer 博士和 Yong Lu 博士协助搭建显微注射装置，并分享他们在昆虫 RNA 干扰领域的宝贵知识与经验。本工作由美国国立卫生研究院（R01GM113230，资助对象：L.P.）提供支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dermestes maculatus 活体甲虫本实验室或 Carolina Biological Supply#144168本实验室菌株经 COI 条形码验证；来自 Carolina 的菌株变异尚不能排除
湿猫粮Fancy Feast含肉块和肉汁。可在大多数宠物食品店和杂货店购买
干狗粮Purina Puppy Chow可在大多数宠物食品店和杂货店购买
昆虫饲养笼（中号，30.5 × 19 × 20.3 cm）Exo TerraPT2260用于种群维持。可根据需要使用更大的饲养笼
昆虫饲养笼（迷你号，17.8 × 10.2 × 12.7 cm）Exo TerraPT2250用于胚胎收集
培养皿VWR89038-968
棉球Fisher22-456-883
Megascript T7 转录试剂盒FisherAM1334适用于 40 次反应
气动泵WPIPV830
毛细管夹持器WPI
显微操作仪NARISHIGEMN-151
黑色滤纸（90 mm）VWR28342-010
食用色素（绿色）McCormick
硼硅酸盐玻璃毛细管Hilgenberg1406119
拉针仪（微移液管拉制仪）Sutter Instrument Co.P-97
显微镜载玻片WorldWide Life Sciences Division41351157
封口膜（Parafilm M）Fisher13-374-12
801 型注射器（10 µl）Hamilton7642-01
针头（32 号） Hamilton7762-05
固定液（Pampel's 溶液）BioQuip Products, Inc.1184C有毒，需在通风橱中操作
镊子（DUMONT #5）Fine Science Tools11252-30
盖玻片（24 × 50 mm，No. 1.5）Globe Scientific1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader 移液吸头FisherE5242956003
用于胚胎显微注射的解剖显微镜LeicaM420
用于幼虫表型观察的解剖显微镜ZeissSteREO Discover. V12
微分干涉相差显微镜（DIC 显微镜）ZeissAXIO Imager. M1

参考文献

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208(2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822(2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674(2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440(2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602(2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32(2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490(2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5(2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

RNA干扰胚胎RNAi亲代RNAi甲虫培养dsRNA注射胚胎注射表型分析体壁制备
中国台湾甲虫 Dermestes maculatus 的饲养及双链RNA介导的基因敲低
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。