在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动eGFP表达的转基因小鼠中分离腹侧中脑神经元进行培养，从培养物中获取单个荧光标记的神经元，并利用RNA测序技术检测其转录组。
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本文内容
摘要
摘要
在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，大脑广泛出现神经元丢失，尤其是黑质致密部（SNc）的多巴胺能神经元显著变性，导致运动迟缓、肌强直和震颤。利用荧光标记物在原代腹侧中脑（Ventral Mesencephalic, VM）培养物中识别活的多巴胺能神经元，为研究这些神经元的选择性易损性提供了一种替代方法，而无需依赖固定细胞的免疫染色。本文中，我们分离、解离并培养小鼠VM神经元达3周，随后利用eGFP荧光（由酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动）在培养物中鉴定多巴胺能神经元。使用玻璃微量移液管将单个神经元收集至微量离心管中。接着对收集的细胞进行裂解，并进行cDNA合成以及转座酶介导的"标签片段化（tagmentation）"，以构建单细胞RNA测序文库1,2,3,4,5。在通过质量控制检测后，对单细胞文库进行测序，并进一步分析以测定基因表达水平。我们报告了从腹侧中脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的转录组结果。结果显示，所有被收集并测序的活TH-eGFP细胞均为多巴胺能神经元。这些技术将在神经科学和分子生物学领域具有广泛的应用前景。
引言
帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一种无法治愈的年龄相关性神经退行性疾病。这种相对常见的疾病的病因至今尚未完全明确。该病在全脑范围内出现广泛的神经元丢失，尤其在黑质（Substantia Nigra, SNc）中的多巴胺能神经元发生显著变性，导致临床上出现运动迟缓、肌强直和震颤等典型症状。
包含黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的原代混合培养物在帕金森病研究中具有重要意义。腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元与奖赏及成瘾行为密切相关。腹侧中脑（VM）原代混合胚胎培养物同时含有SNc和VTA多巴胺能（DA）神经元以及GABA能神经元。VM原代培养物可用于神经保护性检测，并有助于阐明多巴胺能神经元的选择性易损性。目前尚无可靠方法仅通过形态学特征来鉴定培养物中的多巴胺能细胞。本文中，我们建立了一套技术，用于鉴定并分离单个多巴胺能神经元，并构建单细胞、高通量RNA测序文库。
我们报告了从间脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的代表性RNA转录组数据。该方案可用于神经保护、神经退行性变以及药理学检测，以研究各种处理对多巴胺能/GABA能转录组的影响。由于多巴胺能神经元在原代腹侧中脑（VM）培养物表达的神经元中仅占极小比例，能够在活体培养物中可靠地识别这些神经元，将有助于拓展单细胞研究的范围。这些新技术将推动对细胞水平发生机制的理解，并可能在神经科学和分子生物学其他领域具有应用价值。
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方案
注意：所有实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）提供的实验动物护理与使用指南进行，并经加州理工学院机构动物护理与使用委员会批准。
1. 从小鼠胚胎脑组织中分离原代多巴胺能细胞培养物
- 溶液与培养基
- 抗坏血酸储备液的制备
- 称取 352 毫克抗坏血酸。加入无菌H2O至终体积20 mL，置于37 °C 水浴中溶解，经 0.2 μm 滤膜过滤 µm 注射器尖端，并储存于 500 µL 等分试样于 -20 °C.
- 木瓜蛋白酶储备液的制备
- 将木瓜蛋白酶用1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）稀释至15单位/毫升，用移液器上下吹打5次以充分混匀。于解剖当天配制。
- DNase 储存液的制备
- 称取 20 mg DNase。加入无菌 H2O至终体积20 mL。用0.2 μm滤器无菌过滤。 µm 注射器滤器头。于 -20 ℃ 保存 °1 mL 中的 C 等分试样
- 终止液的配制
- 稀释 5 mL 将供体马....
- 抗坏血酸储备液的制备
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结果
本文报道了一种从表达由酪氨酸羟化酶启动子序列驱动的eGFP的小鼠中培养腹侧中脑神经元、从培养物中分离单个荧光神经元，并利用RNA测序（RNA-seq）检测其RNA转录组的实验方案（图1）。数据分析显示，所有经分离并测序的TH-eGFP阳性细胞均为多巴胺能神经元，依据是这些细胞均表达以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本：TH、多巴脱羧酶（DDC）以及多巴胺转运体DAT（slc6a3）。所有TH-eGFP阳性细胞均通过RNA-Seq检测到这三个基因的表达。在每个单细胞RNA-Seq文库中，可检测到6,000至8,000个蛋白编码基因（图2）。这些多巴胺能神经元除表达多巴胺相关转录本外，还强烈表达多种烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚基（表1）。我们观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能神经元；因此，我们根据RNA-seq检测到Gad1转录本的存在，将细胞定义为GABA能神经元。被定义为GABA能神经元的细胞不表达多巴胺相关转录本，但如前所述，表达GABA合成的关键基因.......
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讨论
在此，我们利用荧光标记从异质性细胞群体中分离单个细胞，随后通过单细胞RNA测序对每个细胞进行分析。我们发现，所收获并测序的所有活体TH-eGFP细胞均确实为多巴胺能神经元，这一结论基于以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本的存在：TH、DDC 和 slc6a3。所有TH-eGFP阳性细胞均表达这三种基因，RNA-Seq检测结果证实了这一点。该结果与电生理学研究一致，后者显示每个TH-eGFP阳性细胞均表现出与多巴胺能神经元相关的离子通道特征8, 9。在本实验方案中，我们采用了GENSAT酪氨酸羟化酶-eGFP小鼠品系10作为活体多巴胺能神经元的可靠标记。在野生型（WT）培养物中，目前尚无可靠方法仅依据形态学特征来识别活体多巴胺能神经元。尽管我们在识别和记录多巴胺能神经元方面具有丰富经验，但在野生型培养物中，所收获的十个疑似多巴胺能细胞中仅有三个确为多巴胺能神经元。此外，我们还观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能细胞。我们根据Gad1转录本的存在以及多巴胺相.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（DA017279、AG033954、DA037743）、迈克尔·J·福克斯基金会以及加州理工学院创新计划的资助，后者支持了加州理工学院米勒德和穆里尔·雅各布斯遗传学与基因组学实验室的建设。我们感谢Brian Williams对RNA-Seq文库建库方案的优化及提供的协助。我们感谢Henry Amrhein提供的计算技术培训。我们感谢Barbara J. Wold提供仪器设备和实验室空间。我们感谢Igor Antoshechkin在文库测序及设施管理方面的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 木瓜蛋白酶 | 沃辛顿生化公司 | LS003126 | |
| Hanks平衡盐溶液（HBSS），1× | Gibco | 14175-095 | |
| 供体马血清 | 赛默飞世尔科技 | SH30074.03 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7030-50G | |
| 培养基：Neurobasal培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| 含有稳定形式L-谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）的培养基：GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 终浓度为 0.5 mM。 |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50倍浓缩储备液，终浓度为1倍。 |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma | P4957 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | 储存于 -20 °20℃ µL 等分试样 |
| 脱氧核糖核酸酶 I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| 蓝色移液器吸头 P1000 | 索伦森生物科学 | 有限公司 10130 | |
| 10 mm 浅层培养皿 | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C 水浴 | |||
| 37 °C，5% 湿度培养箱 | |||
| 16% 甲醛（PFA） | 电子显微镜科学公司 | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| 驴血清 | Equitech | SD-0100HI | 100% 储备液，终浓度 1%。 |
| 标准型手术剪 | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| 镊子 - 2x3 齿 | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| 镊子 - 杜蒙特 #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 镊子 - 杜蒙特 #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS，pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）1× | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G针头 | BD PrecisionGlide 针头 | 305167 | 100根针 |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument | model P-87 | |
| 显微操作仪 | Sutter Instrument | MP-285 | |
| 测序试剂盒：SMARTer Ultra Low RNA建库试剂盒（适用于Illumina测序） | Clontech | 634936 | 100 次反应，包含 Advantage2 PCR 试剂盒 |
| 寡核苷酸（12 µM)：SMARTer IIA 寡核苷酸（12 µM | 来自 SMARTer 试剂盒 | ||
| 逆转录酶（100单位） | SMARTcribe 逆转录酶 | 来自 SMARTer 试剂盒 | |
| 引物1 | 3’ CDSIIa 引物 | 来自 SMARTer 试剂盒 | |
| 引物2 | IS PCR 引物 | 来自 SMARTer 试剂盒 | |
| 50x 2 聚合酶混合液 | 50x Advantage 2 聚合酶混合液 | 来自 SMARTer 试剂盒 | |
| 10x PCR缓冲液 | 10x Advantage 2 PCR 缓冲液 | 来自 SMARTer 试剂盒 | |
| RNA spike-in | 赛默飞世尔科技 | 4456740 | |
| PCR冷却架 | IsoFreeze PCR冷却架 | ||
| DNA样本制备试剂盒 | （Illumina/Nextera）Nexter | FC-121-1030 | 24 个样品 |
| PCR预混液 | Nextera PCR主混合液（NPM） | 来自 Nextera 试剂盒 | |
| PCR引物混合物（PPC） | Nextera PCR引物混合液（PPC） | 来自 Nextera 试剂盒 | |
| 荧光计 | Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer试剂盒 | 安捷伦 | 5067-4626 | 110 次反应 |
| 电泳系统 | 安捷伦 2100 生物分析仪 | G2938C | |
| 磁珠：Agencourt AMPure | 贝克曼库尔特 | A63880 | 5 mL |
| RNA酶清除湿巾：RNAse Zap湿巾 | Ambion | AM9786 | 尺寸 100 张 |
| Qubit ds HS 检测试剂盒 | 分子探针 | Q32854 | 500 次检测 |
| 凝胶回收试剂盒：Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| 玻璃毛细管 | （Kimax-51，外径 1.5 - 1.8 mm） | ||
| 显微操作仪 | Narishige（或同等品牌） | ||
| 测序仪 | Illumina HiSeq 仪器 | ||
| GENSAT 酪氨酸羟化酶-eGFP 小鼠品系 | MMRRC 货号：000292-UNC | Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat 转基因小鼠种质资源区域研究中心 |
参考文献
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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