需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54981

⸱

2017年2月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

本文内容

摘要

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动eGFP表达的转基因小鼠中分离腹侧中脑神经元进行培养，从培养物中获取单个荧光标记的神经元，并利用RNA测序技术检测其转录组。

摘要

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，大脑广泛出现神经元丢失，尤其是黑质致密部（SNc）的多巴胺能神经元显著变性，导致运动迟缓、肌强直和震颤。利用荧光标记物在原代腹侧中脑（Ventral Mesencephalic, VM）培养物中识别活的多巴胺能神经元，为研究这些神经元的选择性易损性提供了一种替代方法，而无需依赖固定细胞的免疫染色。本文中，我们分离、解离并培养小鼠VM神经元达3周，随后利用eGFP荧光（由酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子驱动）在培养物中鉴定多巴胺能神经元。使用玻璃微量移液管将单个神经元收集至微量离心管中。接着对收集的细胞进行裂解，并进行cDNA合成以及转座酶介导的"标签片段化（tagmentation）"，以构建单细胞RNA测序文库1,2,3,4,5。在通过质量控制检测后，对单细胞文库进行测序，并进一步分析以测定基因表达水平。我们报告了从腹侧中脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的转录组结果。结果显示，所有被收集并测序的活TH-eGFP细胞均为多巴胺能神经元。这些技术将在神经科学和分子生物学领域具有广泛的应用前景。

引言

帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一种无法治愈的年龄相关性神经退行性疾病。这种相对常见的疾病的病因至今尚未完全明确。该病在全脑范围内出现广泛的神经元丢失，尤其在黑质（Substantia Nigra, SNc）中的多巴胺能神经元发生显著变性，导致临床上出现运动迟缓、肌强直和震颤等典型症状。

包含黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的原代混合培养物在帕金森病研究中具有重要意义。腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元与奖赏及成瘾行为密切相关。腹侧中脑（VM）原代混合胚胎培养物同时含有SNc和VTA多巴胺能（DA）神经元以及GABA能神经元。VM原代培养物可用于神经保护性检测，并有助于阐明多巴胺能神经元的选择性易损性。目前尚无可靠方法仅通过形态学特征来鉴定培养物中的多巴胺能细胞。本文中，我们建立了一套技术，用于鉴定并分离单个多巴胺能神经元，并构建单细胞、高通量RNA测序文库。

我们报告了从间脑培养物中分离的单个多巴胺能神经元和GABA能神经元的代表性RNA转录组数据。该方案可用于神经保护、神经退行性变以及药理学检测，以研究各种处理对多巴胺能/GABA能转录组的影响。由于多巴胺能神经元在原代腹侧中脑（VM）培养物表达的神经元中仅占极小比例，能够在活体培养物中可靠地识别这些神经元，将有助于拓展单细胞研究的范围。这些新技术将推动对细胞水平发生机制的理解，并可能在神经科学和分子生物学其他领域具有应用价值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）提供的实验动物护理与使用指南进行，并经加州理工学院机构动物护理与使用委员会批准。

1. 从小鼠胚胎脑组织中分离原代多巴胺能细胞培养物

  1. 溶液与培养基
    1. 抗坏血酸储备液的制备
      1. 称取 352 毫克抗坏血酸。加入无菌H2O至终体积20 mL，置于37 °C 水浴中溶解，经 0.2 μm 滤膜过滤 µm 注射器尖端，并储存于 500 µL 等分试样于 -20 °C.
    2. 木瓜蛋白酶储备液的制备
      1. 将木瓜蛋白酶用1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）稀释至15单位/毫升，用移液器上下吹打5次以充分混匀。于解剖当天配制。
    3. DNase 储存液的制备
      1. 称取 20 mg DNase。加入无菌 H2O至终体积20 mL。用0.2 μm滤器无菌过滤。 µm 注射器滤器头。于 -20 ℃ 保存 °1 mL 中的 C 等分试样
    4. 终止液的配制
      1. 稀释 5 mL 将供体马血清加入至10%，溶于45 mL 1×HBSS中。使用0.2 μm滤器无菌过滤。 µm 注射器滤器滤头。4℃保存 °C.
    5. 4% 牛血清白蛋白（BSA）储备液的制备
      1. 称取 2 g BSA，加入 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）至终体积为 45 mL。使用 0.2 μm 滤器过滤除菌。 µm 注射器滤器头。4℃保存 °C.
    6. 铺板培养基的制备
      1. 向 494 mL 培养基中加入 1.25 mL 含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-谷氨酰胺的稳定来源）和5 mL的培养基 供体马血清。使用0.2 μm滤器过滤除菌 µm 注射器滤器滤头。4℃保存 °C.
    7. 细胞培养基的制备
      1. 在 196 mL 铺板培养基中加入 4 mL B27 和 200 µL-抗坏血酸。用0.2 μm滤器过滤除菌 µm 滤器。将溶液于 4 ℃ 保存 °C 并在其中使用 周
    8. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液的制备
      注意：使用多聚甲醛时的一般预防措施如下：在通风橱中操作，避免皮肤和眼睛接触，避免吸入蒸气，远离热源或明火。穿戴适当的个人防护装备。多聚甲醛可引起致敏反应和皮炎，因此操作后应彻底清洗双手。
      1. 向30 mL pH 7.4的1×PBS中加入10 mL 16% PFA。
    9. 0.1% Triton X-100 的配制
      1. 移液1 mL Triton X-100 加入 9 mL 1× PBS 中配制成 10% 溶液。缓慢移液，使黏稠溶液充分充满移液 tip。37 ℃ 温育 °C 水浴中溶解。10% 储存液保存于 4 °C.
      2. 将10%的储备液稀释至0.01%（例如，通过进行两步连续的1:10稀释：将1 mL 10%溶液加入9 mL 1×PBS中，配制成1%溶液；再取1 mL 1%溶液加入9 mL 1×PBS中，配制成0.1%溶液。
    10. 10% 和 1% 驴血清的制备
      1. 将1 mL驴血清加入9 mL 1×PBS中，配制成10%溶液。将0.5 mL驴血清加入49.5 mL pH 7.4的1×PBS中，配制成1%溶液。
    11. 1× PBS 的配制
      1. 将10倍浓度的PBS加入450 mL的H₂O中，稀释至1倍浓度2O. 使用 pH 计将溶液的 pH 值调节至 7.4。
  2. 包被培养皿
    1. 多聚-L-鸟氨酸包被
      1. 仅用 120 μL 的溶液涂覆所有 35 mm 培养皿中央直径为 10 mm 的玻璃底区域 µL-多聚赖氨酸（L poly-L-Ornithine）在无菌条件下处理，37 °C孵育1小时 °C. 使用真空抽吸器吸除聚-L-鸟氨酸溶液。用无菌水冲洗培养皿两次。2O.
    2. 层粘连蛋白包被（储存浓度为 1 mg/mL）
      1. 稀释20 µL 用2 mL无菌H2O（终浓度 0.01 mg/mL）。
      2. 仅用120 μL多聚-L-赖氨酸将所有培养皿中央直径为10 mm的玻璃底面进行包被 µ0.01 mg/mL 的层粘连蛋白 L 使用无菌技术操作，并于37℃孵育1小时或过夜 °使用前置于冰上。
  3. 小鼠解剖
    注意：本解剖方法的设计旨在将细胞从胚胎囊转移至培养孵育箱的过程中尽量减少暴露。通过仅取出部分脑组织以分离中脑，可有效维持细胞活力。在无需解剖整个脑部的情况下直接获取中脑区域，可使中脑的分离过程更为迅速。参见 材料表 本研究中使用的小鼠品系。
    1. 使用 CO₂ 处死妊娠第 14 天的孕鼠2.
    2. 用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部。使用带有2×3个齿的镊子夹住下腹部皮肤，用钝头手术剪刀切开腹腔。在两侧分别向侧方和近端做两个切口。用镊子将腹壁折叠翻开，以暴露腹腔。
      注意：此时子宫已暴露。暴露胸膜腔并造成气胸可确保动物不会恢复。
    3. 用剪刀剪断子宫角的两端以分离子宫，放入无菌操作台中的培养皿内。
    4. 用每只手各持一把尖头镊子打开胚胎囊并取出胚胎。用镊子在颈部夹断头部，迅速去头。将镊子牢固地夹在吻部以固定头部，使背侧表面易于操作。
    5. 用另一只手握住镊子，夹住中脑隆起前方的皮肤层和颅骨，沿中线向尾侧剥离皮肤和颅骨。将镊子置于隆起周围，一端尖端插入大脑皮层与中脑之间，另一端置于小脑上方。
    6. 用镊子夹住并取出整个中脑，前端保留前脑，后端保留小脑。将其置于含冷HBSS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。
    7. 对剩余的胚胎重复上述步骤。
    8. 在解剖显微镜下，将脑组织段翻转，使腹侧朝上以便操作。此时可见四个象限。轻轻夹住脑膜并向上提起，远离脑组织，以去除所有脑膜和血管结构。
    9. 使用镊子固定脑段，同时分离中脑。将镊子的一侧尖端插入脑段中心附近的脑室。首先在背侧进行夹取，方向朝向培养皿内部，然后分别在两侧向内侧夹取。通过在两侧进行横向切割，获取下方的两个象限。
      注意：感兴趣的组织位于腹侧下部，外观致密，该区域包含腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNc）。
    10. 修剪并弃去密度较低的组织，包括上丘和下丘。将含有VTA和SNc的解剖后组织置于培养皿的另一区域的新鲜HBSS中。
      注意：在此阶段的小鼠脑发育时期（E14），腹侧中脑目标区域与丘脑下部区域（如未定带及其他下丘脑细胞群）被脑室分隔。发育中胚胎小鼠脑组织更细长的结构使得这些区域得以区分，而在成年小鼠脑中，这些区域的位置更为接近。
    11. 对所有剩余的脑段重复上述操作。
    12. 所有脑段解剖完毕后，使用镊子和11号手术刀将每个中脑部分切成大小大致相等的四块。
  4. 细胞的分离
    1. 细胞的酶处理
      1. 使用宽口P1000移液枪头吸取HBSS中的所有四分之一脑段，并将其转移至15 mL离心管中。待组织块沉降至管底后，吸除随组织块带入的HBSS。
      2. 加入500 µL 将木瓜蛋白酶溶液加入试管中，并置于37 °37°C 水浴 15 分钟。在 7.5 分钟后，轻轻弹击管壁以重悬细胞。
      3. 使用宽口 P1000 吸头，仅将中脑节段移入含有 1 mL 脱氧核糖核酸酶 I（DNase）溶液的离心管中。静置使节段沉降至管底。
      4. 使用宽口 P1000 吸头，仅将中脑节段转移至含有 1 mL 的 15 mL 离心管中 加入冷终止溶液进行冲洗。待组织片段沉降至管底后，重复冲洗一次。
    2. 细胞悬液的机械吹打
      1. 用1 mL新鲜的终止液替换最后一次冲洗液，使用P1000移液枪头上下吹打7次以重悬细胞。注意避免过度吹打，以尽量减少细胞裂解。
      2. 通过缓慢移液将200微升细胞悬液铺于底层 µL 将4% BSA溶液加入管底。小心抽出移液枪头，避免扰动细胞悬液层。在280 × g下离心6分钟后，用P1000吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL中 铺板培养基
  5. 细胞计数与接种
    1. 使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞悬液稀释至1,000个细胞/μL。µL，用铺板培养基。
    2. 使用真空抽吸器，以每次最多三个培养皿的批次，抽去包被培养皿中的层粘连蛋白溶液。接种 120 µL（1.2 × 10）5 细胞/皿（78.5 mm）2将细胞悬液立即分装到培养皿的包被表面，每处理一批后立即吸取并接种。这可以防止培养皿干燥并形成不均匀的表面。
    3. 1小时后，小心加入3 mL 将培养基加入培养皿的未接种区域，以尽量减少对细胞的干扰。
    4. 每3天对细胞培养皿进行一次半量至全量换液，持续3周。

2. 收获培养的多巴胺能神经元用于RNA测序

注意：细胞捕获与单细胞 RNA 测序方案的概述见图 1。

  1. 实验前需执行的步骤
    1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管在100%乙醇中超声清洗15分钟，随后再在蒸馏H2O中超声清洗15分钟。排干毛细管后，在200 °C的烘箱中烘烤过夜，以灭活RNase。
    2. 使用新开封的无RNase吸头，在微量离心管中将测序试剂盒中的19 µL 10x裂解缓冲液与1 µL RNase抑制剂溶液混合，配制10x反应缓冲液（总体积20 µL）。用微量离心机短暂离心混合物，并置于冰上保存。
    3. 将2 µL的10x反应缓冲液加入各个0.2 mL PCR管中（用于收集分离的神经元）。用适当标签标记这些PCR管以标识待收集的神经元，并在4 °C下冷冻保存。
  2. 实验当天需执行的步骤
    1. 收集用移液管的制备。
      1. 使用微电极拉制仪和配备玻璃涂层加热丝的微加工仪，从经烘烤处理的毛细管上拉制大口径尖端的微移液管（2 - 8 µm）。将拉制仪设置为拉出具有长锥度的微移液管。使用配备校准目镜分划板和高倍物镜的微加工仪，将微移液管尖端折断至所需尺寸（10 - 20 µm）。
      2. 将微移液管固定在微加工仪的移液管夹持器中，并将夹持器安装到微加工仪上。使用微加工仪的机械操纵器将微移液管尖端对准玻璃涂层加热丝上方并聚焦，开启加热丝电流使其加热。将移液管尖端接触加热丝，当尖端熔化至合适直径时关闭电流。
        注：关闭电流将导致加热丝突然向下移动并脱离移液管尖端，从而形成具有所需直径的大开口移液管。
      3. 将制备完成的微移液管存放于密闭盒中，待使用时取出。
    2. 神经元的收集。
      注：培养的神经元采用此前发表的方案6的改良版本进行收集。
      1. 使用液体消毒剂和水彻底清洁所有与培养皿及收集管接触的细胞收集室表面，随后用清水冲洗。再用80%乙醇擦拭已消毒的表面，然后使用含RNase抑制剂的擦拭纸进行二次擦拭。
      2. 准备两个隔热容器，分别装入普通冰块和干冰。将先前加入2 μL 10x反应缓冲液的0.2 mL PCR收集管置于普通冰上。
      3. 从培养箱中取出含有神经元的培养皿，倒掉培养基，用2 mL无RNase的Dulbecco's PBS（DPBS）冲洗一次，再加入1 mL DPBS用于后续收集操作。
      4. 使用配备40X相差物镜、汞灯和GFP滤光片组的倒置荧光显微镜，在原代中脑培养物中识别荧光阳性、TH阳性的神经元。
      5. 通过电动或手动显微操作器将移液管置于细胞胞体上方，通过连接在移液管夹持器侧口的塑料管以口吸方式施加轻微负压，将神经元吸入玻璃微移液管中。立即将含有细胞的移液管从灌流液中移出。
      6. 将移液管尖端插入含有反应缓冲液的0.2 mL PCR收集管中，并在管壁靠近底部处折断尖端。将无菌21 G注射针插入移液管后端，施加向外压力，将残余液体（0.5 - 1.5 µL）从断裂的尖端推出。
      7. 使用台式微量离心机对收集管离心5秒，随后在干冰中速冻。将含有单个细胞的收集管储存于-80 °C。通常在室温下1小时内，每皿可收集约5个细胞。

3. 单细胞RNA-Seq文库构建

  1. 第一链 cDNA 的合成
    注意：以下步骤请使用商业测序试剂盒中的试剂。
    1. 将以下试剂置于冰上并移至PCR操作柜中。在PCR操作柜内，于室温下将下列试剂混合，配制含额外10%余量的第一链主混合液：2 µL 5x 第一链缓冲液，0.25 µL DTT（100 mM），1 µL dNTP 混合物（10 mM），1 µL 寡核苷酸（12 µM），0.25 µL RNase 抑制剂，和 1 µL 逆转录酶（100 单位）。此为逆转录酶预混液（5.5 µ每反应总体积为 L。
    2. 从 -80 摄氏度冰箱中取出样品 ̊在干冰上冷却并带至 PCR 操作柜。向单细胞样品中加入以下成分：1 µL 3' 引物 1 和 1 µL 量化 RNA spike。将样品置于预热至 72℃ 的带热盖 PCR 仪的冰块上 °C.
    3. 在热循环仪中将离心管于 72 ℃ 孵育 3 分钟 °C，然后将样品置于PCR冷却架上。加入5.5 µ将 3.1.1 步骤配制的主混合液各 10 μL 加入每根反应管中，轻轻吹打混匀。离心 0.2 µL 管中轻弹混匀，5 秒钟后在热循环仪中孵育，程序如下：42 °C，90 分钟，70 °4°C 下 10 分钟。保持在 4°C °C.
  2. 扩增的第一链cDNA纯化
    注意：通过磁珠固定纯化PCR扩增的cDNA。使用适用于0.2 mL管的磁力分离装置。
    1. 将磁珠分装至1.5 mL离心管中。每次使用前，将分装的磁珠置于室温至少30分钟，并充分混匀以分散。涡旋振荡磁珠直至均匀混合。
    2. 加入25 µ向每个样本中加入 L 磁珠。用移液器将全部液体上下吹打至少 10 次，充分混匀。室温孵育 8 分钟，使 cDNA 与磁珠结合。
  3. PCR预混液的制备
    1. 将所有反应所需的双链cDNA扩增PCR预混液混合，并额外增加10%，其中包含5 µL 10x PCR 缓冲液，2 µL dNTP 混合液（10 mM），2 µL PCR 引物 2（12 µM），2 µL 50x 2 聚合酶混合物，以及 39 µL 无核酸酶水（50 µL 总体积/反应
  4. 第一链扩增
    1. 将样本和磁珠置于磁力分离装置中至少5分钟，直至液体完全澄清且上清液中无残留磁珠。
    2. 将样本保留在分离装置上，用移液器吸弃上清液。短暂离心5秒，使管壁液体汇集至管底。将样本置于磁性分离装置上静置30秒，随后用P10移液器彻底移除残留的上清液。
    3. 加入50 µ将 PCR 混合液各 10 μL 加入含有上一步中与磁珠结合的 DNA 的各个试管中。将试管放入预热的 PCR 仪中（95 °C） °C）并使用加热盖。开始热循环程序：95 °C 1分钟，26个循环的95 °C，15 秒，65 °℃，30 秒，68 °℃ 6 分钟。然后 72 °C 10 分钟。4℃ 保持 °C.
      注意：有关更多详细信息以及优化样本设置，请参阅测序用户手册。
  5. 扩增双链cDNA的纯化
    1. 加入90 µ将 L 磁珠加入每个样本中。用移液器将全部液体上下吹打至少10次，充分混匀。室温孵育8分钟，使cDNA结合到磁珠上。将含磁珠的样本置于磁力分离装置上静置≥5分钟，直至液体完全澄清，上清液中无残留磁珠。
    2. 当样本置于磁力分离装置上时，移除上清液并弃去。保持样本继续置于磁力分离装置上。加入140 µ向每个样本中加入新鲜配制的85%乙醇，注意不要扰动磁珠。静置30秒。用移液器吸除上清液。cDNA在洗涤过程中将保持与磁珠结合。
    3. 再重复乙醇洗涤一次。
    4. 短暂离心样品，使液体从管壁上收集至管底。将样品置于磁分离装置上静置30秒，随后用移液器彻底移除所有残留乙醇。将样品置于室温下放置2至2.5分钟，直至沉淀完全干燥且不再有光泽。即 在裂纹出现之前）。
      注意：仅将沉淀物干燥至刚好干燥即可，此时沉淀物呈无光泽的哑光状。若沉淀未完全干燥，乙醇会残留在样品孔中，从而降低扩增cDNA的回收率和得率。若沉淀过度干燥，沉淀物会出现裂纹，重新水合将需要超过2分钟，且可能降低扩增cDNA的回收率和得率。
    5. 一旦磁珠干燥后，加入 22.5 µ加入洗脱缓冲液至完全覆盖磁珠沉淀。将样品从磁力分离装置中取出，充分混匀以重悬磁珠。室温孵育10分钟以充分水化。
    6. 将样品离心5秒，使液体从管壁收集至管底。将样品重新置于磁力分离装置上静置≥1分钟，直至溶液完全澄清。
      注意：在孵育过程中，少量磁珠可能未被磁力吸附成团。用移液器将未沉淀的磁珠上下吹打重悬于上清液中，然后将其吹向磁力端，使其与已沉淀的磁珠聚集在一起（避免扰动已形成的沉淀）。
    7. 继续孵育直至上清液中无磁珠残留。将每管中含纯化cDNA的澄清上清液转移至无核酸酶、低吸附的离心管中。用样本信息标记各管，并于-20℃保存。 °C. 样品可在 -20℃ 保存 °C 无限期。
  6. DNA 浓度与片段大小的测定
    1. 通过定量检测1进行质量控制检查 µ使用荧光计检测cDNA的等分试样。评估1 µ使用电泳系统检测3 ng的双链cDNA（具体方法如所述1).
  7. DNA片段化
    注意：使用DNA样本制备试剂盒。
    1. 加入 20 µL cDNA（总量 35 ng）加入离心管中。加入 25 µ将 L 型 Tagment DNA（TD）缓冲液加入含有 cDNA 的离心管中。
    2. 加入5 µ将 TDE1（Tagment DNA Enzyme）加入离心管中。轻轻吹打混匀 10 次。每个样本使用新的枪头。在 20 °C 下以 280 × g 离心 °C，1 分钟。
    3. 将样品置于带加热盖的热循环仪中，于55 ℃运行 °C，5.5 分钟。迅速加入 50 µL QG 溶液（凝胶回收试剂盒）。上下吹打 10 次以混匀。直接进行下一步操作。
  8. DNA片段的纯化
    1. 加入170 µL磁珠，上下吹打10次混匀。室温静置10分钟。将离心管置于磁力架上，静置10分钟。在样品置于磁性分离装置期间，用移液器吸弃上清液并弃去。
    2. 将试管留在磁架上，加入200 µ85% 乙醇 L。静置 30 秒，然后去除乙醇。重复乙醇洗涤一次。在室温下以 1,000 x g 离心试管。
    3. 将离心管放回磁力架上。用移液器吸除残留的乙醇。在室温下干燥样品15分钟。
    4. 加入 21 µL 洗脱缓冲液（来自胶回收试剂盒）。将离心管从磁力架上取下，用移液器吹打混匀10次。室温静置 15 分钟
    5. 将试管放回磁力架上静置5分钟。用移液器吸取20 µ将 L 溶液（纯化后的 DNA）转移至新离心管中。
  9. 片段化DNA的标记与PCR扩增
    注意：在此步骤中，通过有限循环的PCR程序对纯化的DNA进行扩增。PCR步骤还会添加索引1（i7）和索引2（i5），以及通用接头（P5和P7）（用于簇生成和测序）。更多细节请参阅DNA样本制备指南。
    1. 在新试管中加入 5 µL 的索引 2 引物（白色盖）。使用新的移液器吸头加入 5 µL 的 index 1 引物（橙色盖）。加入 15 µ将 L 的 PCR 预混液加入每个试管中。
    2. 加入5 µ将20微升PCR引物混合液加入每个试管中。 µ将 L 的纯化 DNA 加入管中。轻柔吹打混匀 3 - 5 次。
    3. 使用PCR仪按照以下程序进行PCR反应：72 °℃ 3分钟，98 °C，30 秒，5 个循环，98 °C，10 秒，63 °C，持续 30 秒，72 °C，保持3分钟。保持在10 °C. 立即进行PCR纯化，或将样品在4℃保存 °C，最长可保存2天。
  10. 扩增DNA片段的纯化
    1. 将磁珠置于室温。配制新鲜的85%乙醇。从PCR仪中取出样品，短暂离心。
    2. 加入30 µ将磁珠悬液加入管中。轻轻吹打混匀10次。室温静置5分钟。将管置于磁力架上5分钟。在管保持于磁力架上的状态下，用移液器吸弃上清液。
    3. 加入 200 µ向每管中加入85%乙醇L。30秒后用移液器吸去乙醇。重复85%乙醇洗涤步骤。30秒后用移液器吸去乙醇。
    4. 将试管保持在磁力架上并打开管盖，室温晾干15分钟。从磁力架上取下试管。
    5. 加入 32.5 µL 洗脱缓冲液。轻轻吹打10次。从磁力架上取下，室温孵育10–15分钟。
    6. 将试管放回磁力架静置 2 分钟，或直至上清液变澄清。小心转移 30 µ将上清液的 L 转移至新管中。
  11. DNA 浓度与片段大小的测定
    1. 通过定量1个样本的DNA浓度进行质量控制检查 µ使用荧光计测定cDNA的L。通过电泳分析DNA的片段大小。评估1 µL（3 ng）的ds-cDNA。
  12. 测序
    1. 将单细胞RNA测序文库送至测序机构。按照先前发表的方案，在测序仪上生成100 bp的测序读长。4.
      注意：每个测序文库产生 >2000万条唯一比对的读段。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文报道了一种从表达由酪氨酸羟化酶启动子序列驱动的eGFP的小鼠中培养腹侧中脑神经元、从培养物中分离单个荧光神经元，并利用RNA测序（RNA-seq）检测其RNA转录组的实验方案（图1）。数据分析显示，所有经分离并测序的TH-eGFP阳性细胞均为多巴胺能神经元，依据是这些细胞均表达以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本：TH、多巴脱羧酶（DDC）以及多巴胺转运蛋白DAT（slc6a3）。所有TH-eGFP阳性细胞均通过RNA-Seq检测到这三种基因的表达。在每个单细胞RNA-Seq文库中，可检测到6,000至8,000个编码蛋白质的基因（图2）。这些多巴胺能神经元除表达多巴胺相关转录本外，还强烈表达多种烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚基（表1）。我们观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能神经元；因此，我们根据RNA-seq检测到Gad1转录本的存在，将细胞定义为GABA能神经元。被定义为GABA能神经元的细胞不表达多巴胺相关转录本，但如前所述，表达GABA合成的关...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在此，我们利用荧光标记从异质性细胞群体中分离单个细胞，随后通过单细胞RNA测序对每个细胞进行分析。我们发现，所收获并测序的所有活体TH-eGFP细胞均确实为多巴胺能神经元，这一结论基于以下三种与多巴胺（DA）相关的基因转录本的存在：TH、DDC 和 slc6a3。所有TH-eGFP阳性细胞均表达这三种基因，RNA-Seq检测结果证实了这一点。该结果与电生理学研究一致，后者显示每个TH-eGFP阳性细胞均表现出与多巴胺能神经元相关的离子通道特征8, 9。在本实验方案中，我们采用了GENSAT酪氨酸羟化酶-eGFP小鼠品系10作为活体多巴胺能神经元的可靠标记。在野生型（WT）培养物中，目前尚无可靠方法仅依据形态学特征来识别活体多巴胺能神经元。尽管我们在识别和记录多巴胺能神经元方面具有丰富经验，但在野生型培养物中，所收获的十个疑似多巴胺能细胞中仅有三个确为多巴胺能神经元。此外，我们还观察到，并非所有TH阴性细胞均为GABA能细胞。我们根据Gad1转录本的存在以及多巴胺相...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（DA017279、AG033954、DA037743）、迈克尔·J·福克斯基金会以及加州理工学院创新计划的资助，后者支持了加州理工学院米勒德和穆里尔·雅各布斯遗传学与基因组学实验室的建设。我们感谢Brian Williams对RNA-Seq文库建库方案的优化及提供的协助。我们感谢Henry Amrhein提供的计算技术培训。我们感谢Barbara J. Wold提供仪器设备和实验室空间。我们感谢Igor Antoshechkin在文库测序及设施管理方面的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
木瓜蛋白酶沃辛顿生化公司 LS003126
Hanks平衡盐溶液（HBSS），1×Gibco 14175-095
供体马血清赛默飞世尔科技 SH30074.03
牛血清白蛋白（BSA）Sigma A7030-50G
培养基：Neurobasal培养基Gibco 21103-049
含有稳定形式L-谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）的培养基：GlutaMAXGibco 35050-061终浓度为 0.5 mM。
L-抗坏血酸Sigma A7506
B27Gibco 17504-04450倍浓缩储备液，终浓度为1倍。
35 mm 玻璃底培养皿MatTek  P35GC-1.5-10-C
聚-L-鸟氨酸Sigma P4957
层粘连蛋白Sigma L2020储存于 -20 °20℃ µL 等分试样
脱氧核糖核酸酶 I (DNase)Sigma DN25
蓝色移液器吸头 P1000索伦森生物科学 有限公司 10130
10 mm 浅层培养皿VWR 25384-324
37 °C 水浴
37 °C，5% 湿度培养箱
16% 甲醛（PFA）电子显微镜科学公司 15710
Triton X-100Sigma X100-500ML
驴血清Equitech SD-0100HI100% 储备液，终浓度 1%。
标准型手术剪Fine Science Tools14000-14
镊子 - 2x3 齿Fine Science Tools11022-14
镊子 - 杜蒙特 #55Fine Science Tools11295-51
镊子 - 杜蒙特 #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS，pH 7.4Gibco 70011-044
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）1×Gibco14190-144500 mL
21 G针头BD PrecisionGlide 针头305167100根针
微移液管拉制仪Sutter Instrumentmodel P-87
显微操作仪 Sutter Instrument MP-285
测序试剂盒：SMARTer Ultra Low RNA建库试剂盒（适用于Illumina测序）Clontech634936100 次反应，包含 Advantage2 PCR 试剂盒
寡核苷酸（12 µM)：SMARTer IIA 寡核苷酸（12 µM来自 SMARTer 试剂盒 
逆转录酶（100单位）SMARTcribe 逆转录酶来自 SMARTer 试剂盒 
引物13’ CDSIIa 引物 来自 SMARTer 试剂盒
引物2IS PCR 引物来自 SMARTer 试剂盒
50x 2 聚合酶混合液50x Advantage 2 聚合酶混合液来自 SMARTer 试剂盒
10x PCR缓冲液10x Advantage 2 PCR 缓冲液来自 SMARTer 试剂盒
RNA spike-in赛默飞世尔科技4456740
PCR冷却架IsoFreeze PCR冷却架
DNA样本制备试剂盒 （Illumina/Nextera）NexterFC-121-103024 个样品
PCR预混液Nextera PCR主混合液（NPM）来自 Nextera 试剂盒 
PCR引物混合物（PPC） Nextera PCR引物混合液（PPC） 来自 Nextera 试剂盒
荧光计Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer试剂盒安捷伦5067-4626110 次反应
电泳系统 安捷伦 2100 生物分析仪G2938C
磁珠：Agencourt AMPure 贝克曼库尔特A638805 mL
RNA酶清除湿巾：RNAse Zap湿巾AmbionAM9786尺寸 100 张
Qubit ds HS 检测试剂盒分子探针 Q32854500 次检测
凝胶回收试剂盒：Qiaquick Gel Extraction KitQiagen 28704
玻璃毛细管（Kimax-51，外径 1.5 - 1.8 mm）
显微操作仪Narishige（或同等品牌） 
测序仪Illumina HiSeq 仪器
GENSAT 酪氨酸羟化酶-eGFP 小鼠品系 MMRRC 货号：000292-UNCTg(Th-EGFP)DJ76Gsat 转基因小鼠种质资源区域研究中心

参考文献

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

单细胞采集腹侧中脑培养细胞分离荧光显微镜cDNA合成基因表达分析
利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。