在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

摘要

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。

摘要

线粒体结构与功能关系的分析对于深入理解线粒体功能调控机制至关重要。荧光显微镜是直接评估活细胞中线粒体结构与功能、研究线粒体结构与功能关系不可或缺的工具，而线粒体结构与功能关系主要受调控线粒体分裂与融合事件的分子所调节。本文描述并演示了在模式生物中研究活体及固定组织中线粒体结构与功能的具体方法 黑腹果蝇首选的组织是 果蝇 卵巢，可被分离并处理以适用于 离体 活细胞共聚焦显微镜观察。此外，本文还描述了如何在遗传水平上操控线粒体分裂蛋白 Drp1 果蝇 卵巢以研究 Drp1 驱动的线粒体分裂在调控线粒体结构与功能关系中的作用。这些方法的广泛应用已在已发表的数据和新数据中得到证实。所述方法可进一步拓展用于理解营养物质和/或生长因子对线粒体特性的直接影响 离体鉴于线粒体功能失调是多种疾病病因的基础，本研究在一种遗传上易于操作的模式生物中开发了所述创新方法，果蝇有望显著促进对线粒体结构与功能关系的机制细节的理解，并推动靶向线粒体的治疗策略的开发。

引言

线粒体通常被称为细胞的“动力工厂”，因为它们是分化细胞中能量生成的主要场所。此外，线粒体在代谢、产热、脂质修饰、钙稳态和氧化还原稳态、细胞信号通路的协调等方面也发挥着关键作用等¹。线粒体还积极参与细胞死亡的诱导²以及细胞周期的调控³。这种多功能性引出了以下两个基本问题：a）线粒体如何同时执行这些多种功能？b）是否存在特定的线粒体亚群或亚区域，专门负责不同的功能？在此背景下，值得注意的是，线粒体在单个细胞内的形态、大小和结构具有动态性，且不同细胞类型的线粒体稳态形态可能存在差异。来自多个实验室数十年的研究表明，线粒体形态、大小和结构的改变（统称为线粒体动力学）对于维持多种线粒体功能至关重要^4,5,6_。 这些发现提示，线粒体可能正是凭借其结构上的动态变化来实现其多功能性的。

目前，人们正在大力研究线粒体结构与功能之间的关系。线粒体结构的动态特性主要依赖于它们相互之间发生分裂与融合的能力。大型线粒体的分裂将其转化为较小的线粒体单元，而两个较小线粒体之间的融合则使它们合并为更大的线粒体单元⁷此外，两个线粒体之间可能发生瞬时融合，以实现其内容物的混合。线粒体内膜和外膜的分裂与融合事件由特定的蛋白质组精确调控。核心分裂机制由动力相关蛋白1（Drp1）构成，该蛋白通过与某些因子相互作用，从细胞质中被招募至线粒体。 真正有效的....

方案

1. 准备 果蝇 （所需工具如图2A所示）

1. 对于所描述的任何实验，收集羽化后 5 天内的 Drosophila （在室温或 25 ºC 下培养），放入含有 5 - 7 mL Drosophila 食物的试管中（参见材料表），每管不超过 25 只果蝇；保持雌:雄比例为 2:1。
2. 撒入少量颗粒状酵母以促进 Drosophila 产卵。在 2 - 4 天内进行实验操作。

2. Drosophila 卵巢的解剖（所需工具如图 2A 所示）

1. 温热的昆虫解剖培养基（参见 材料表)至室温，25 °C. 在八孔玻璃解剖皿中，向三个孔内各加入 200 µ每孔加入 L 培养基。
2. 麻醉 果蝇 与 CO₂ 通过将吹枪的针头置于小瓶塞下方吹气。将果蝇放在果蝇垫上。使用解剖显微镜，挑选出5只雌蝇，放入解剖皿的第一个孔中。每次操作一只 果蝇 进行活细胞显微观察时
3. 通过解剖显微镜的目镜观察，使用两把镊子将胸部与腹部分离。用镊子小心地将腹部转移至培养皿的第二个孔中。
4. 用一对镊子夹住腹部后端，用另一对镊子缓慢将卵巢（连同其他腹部内容物）推出....

结果

所述方法可用于研究活体或固定后的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中线粒体的结构与功能（图2B）。以下提供了一些使用所述方法可预期获得的结果示例。

解剖 果蝇 卵巢：进一步解剖切断的腹部（图3B）从整个 果蝇 (图 3A应释放腹腔内容物，包括每个个体的2个卵巢 果蝇完整的卵巢呈卵圆形、白色结构（图中箭头所示） 图3C 和 D）理想情况下应通过输卵管柄保持相互连接。每侧卵巢中的卵巢管应由纤维鞘（放大图中的#）维持在一起。 图3C），通过仔细剥离去除（图中粗箭头所示 图3D；* 表示卵巢组织撕裂严重且卵巢管脱落）以暴露卵巢管，用于染色和.......

讨论

方案中的关键步骤

光漂白：为实现高效的共聚焦显微镜成像，必须严格防止荧光样品发生过度光漂白。因此，应尽量缩短通过目镜定位样品或通过实时扫描模式设置图像采集参数的时间，以最大限度减少光漂白的发生。

组织损伤：由于线粒体被认为是细胞健康的感应器，因此确保使用所述方法获得的数据具有生理相关性至关重要，这些数据不应反映因解剖Drosophila卵巢操作不当所造成的损伤。解剖过程应尽可能迅速，同时必须极度谨慎以最大限度减少组织损伤。在我们操作下，解剖并分离5个Drosophila卵巢的平均时间为5至7分钟。必须努力识别出显示组织损伤的卵室，并将其排除在分析之外。解剖引起的组织损伤可能包括异常的间隙（*见图9A，表现为信号缺失）、切口或撕裂（*见图9B，表现为信号缺失）或卵室的形变（*见图9C）。然而，由实验操作引起的任何显著卵室形变都应仔细评估。尽管在本.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Grace's 培养基（昆虫解剖培养基）	Fisher Scientific	30611031-2
41 甲醛水溶液	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green（线粒体总体染色剂）	Life Technologies	m7514	重悬并分装
四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐	Sigma Aldrich	87917-25MG	重悬并分装
MitoSox（Mito-Ros 染色剂）	Life Technologies	m36008	重悬并分装
多聚赖氨酸	MP Biomedicals	ICN15017625
果蝇培养管	Fisher Scientific	AS-515
果蝇锥形管	Fisher Scientific	AS-355
果蝇培养管塞	Fisher Scientific	AS273
果蝇锥形管塞	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix 果蝇饲料（Drosophila 饲料）	Fisher Scientific	AS153
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E 抗体（d-300）	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB 抗体 [3D5] - 线粒体标记物	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select 显微镜载玻片	Fisher Scientific	22-026-252
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp 玻璃底细胞培养皿	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
活性干酵母	Fisher Scientific	ICN10140001
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 镊子	Fine Science Technologies	11251-20
Moria 镍镀针夹	Fine Science Technologies	26016-12
微型细针	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP（w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3）	Bloomington Stock Center	7194
果蝇操作垫	Fly stuff	59-118
吹管	Fly stuff	54-104
吹管针头	Flystuff	54-119
解剖显微镜	Carl Zeiss	Stemi 2000
分析软件	Carl Zeiss	Zen
分析软件	开源	Image J
研究用宏变焦显微镜	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 冷却型数字相机，12 位，单色	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging