饮用水源中蓝藻毒素的存在是供水管理机构关注的主要问题。为评估水体污染风险，本文介绍了一种利用抗体微阵列芯片在现场检测液体和固体样品中蓝藻菌株的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
全球变暖和富营养化使一些水生生态系统成为真正的生物反应器，引发蓝藻的快速且大规模增殖；这带来了显著的健康和经济影响。许多蓝藻菌株可产生毒素，仅需少量细胞即可对环境造成不可逆的损害。因此，水体管理机构和行政部门需要快速高效的早期预警系统，以获得可靠数据，支持其预防性或治理性决策。本文报告了一种利用含有17种具有分类学分辨能力抗体（Abs）的抗体微阵列芯片（CYANOCHIP）在野外检测产毒蓝藻菌株的实验方案。文中描述了一种多重荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI），可同时监测在淡水生态系统中频繁形成水华的17种蓝藻菌株，其中部分为产毒菌株。在同一张显微镜载玻片上打印了多个完全相同的CYANOCHIP微阵列（最多达24个重复），以实现对相似数量样本的同步检测。液体样本可直接与抗体（Abs）孵育，或先通过1至3 μm滤膜过滤浓缩细胞后再进行检测。固体样本（如沉积物和研磨岩石）则首先在孵育缓冲液中使用手持式超声波破碎仪进行均质化和分散处理，随后经5–20 μm滤膜过滤以去除粗颗粒，滤液再与抗体进行孵育。免疫反应通过最终与17种荧光标记抗体的混合物孵育而显色，并由便携式荧光检测仪读取结果。整个过程约需3小时，其中大部分时间为两次各1小时的孵育阶段。输出结果为一幅图像，其中亮斑代表蓝藻标志物的阳性检出。
引言
在包括生物医学、环境生态学和天体生物学在内的许多领域中，对复杂天然微生物群落中微生物的检测与监测至关重要。Cyanobacteria 是一类原核微生物，以其在淡水中形成水华（细胞过度增殖）的能力而广为人知。它们分布广泛，许多种类能够产生毒素，不仅对人类健康构成潜在威胁，还会造成生态影响。因此，开发快速且灵敏的方法，用于早期检测土壤和水体中的cyanobacteria和/或其毒素，显得尤为必要。为此，已开发出一种多重荧光夹心微阵列免疫分析法（FSMI），作为供水管理者决策的辅助工具，从而有助于实施恰当的水资源管理方案。
已开发出多种方法用于检测和鉴定土壤与水体中的蓝藻细胞及蓝藻毒素，包括光学显微镜技术、分子生物学技术和免疫学技术。这些方法在所提供信息的类型上可能存在显著差异。显微镜技术基于细胞形态以及色素的检测 体内 来自蓝藻色素（如藻蓝蛋白或叶绿素a）的荧光1尽管这些方法快速且成本低廉，可用于实时和频繁监测，能够提供有关类型和数量的信息 蓝细菌 存在于样本中时，它们无法提供有关潜在毒性的信息。此外，这些方法需要一定的专业知识，因为区分亲缘关系相近的物种通常非常困难2为了克服这些局限性，必须结合生物学和生物化学筛选实验以及物理化学方法，对微囊藻毒素进行鉴定和定量，同时辅以光学显微镜检测。
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方案
1. 免疫原的制备
- 在表1所述条件下，于相应的培养基中培养每种蓝藻菌株。
注意：每种蓝藻菌株的培养基和培养条件列于表1中。除K17外，所有蓝藻菌株均来自西班牙马德里自治大学Antonio Quesada研究组。抗Planktothrix rubescens的抗体由西班牙北部Vilasouto水库中该蓝藻形成的单一种类水华自然样本制备获得。 - 使用血细胞计数板在光学显微镜下对细胞数量进行定量，获得对数生长后期或稳定期培养物中约108 个细胞/mL的浓度。
- 取5 mL培养液，以2,000 × g离心5分钟，收集细胞。
- 弃去上清液，将细胞重悬于10 mL离心管中的5 mL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，使细胞浓度约为108 个细胞/mL。
- 使用便携式手持超声处理器，对悬浮液进行超声处理，共5个循环，每个循环30秒，每次循环间在冰上暂停30至60秒；或以最大振幅（30 kHz）将离心管浸入细胞破碎仪的水浴中进行处理，以实现细胞的均质化和裂解。
- 对每种蓝藻菌株重复步骤1.3–1.5。
注意：超声处理可导致细胞破裂并释放细胞内含物。蛋白质和多糖是良好的免疫原，而某些特定分子（如脂质和核酸）本身不能引发体液免疫应答，因此必须与多糖或蛋白质等载体结....
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结果
本研究描述了一种多重免疫测定法，用于同时鉴定最重要的淡水蓝藻物种（表1），该方法基于CYANOCHIP抗体微阵列。微阵列可采用打印在显微镜载玻片上的3 × 8格式。每个微阵列包含一组17种抗体，以三重复点样模式打印，同时包括相应的前免疫抗体和牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照。微阵列还包含一个荧光边框，通过使用荧光标记的前免疫抗体，便于定位微阵列的图案22（图1）。
该微阵列在实地进行了测试 原位 对采自为马德里市供水的淡水洛索亚水库（Lozoya Reservoir）岸边的水样进行分析。样品处理方法如上所述，主要的阳性免疫反应对应于针对浮游生物的抗体 蓝细菌，例如 微囊藻 spp.（K4 和 K5），以及底栖的颤藻目（Oscillatoriales），例如 Leptolyng.......
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讨论
本文介绍了一种使用CYANOCHIP的多重荧光夹心免疫测定法，CYANOCHIP是一种包含17种抗体的微阵列，可用于检测和鉴定多种蓝藻属22。这些cyanobacteria代表了淡水生境中最常见的底栖和浮游蓝藻属，其中一些种类能够产生毒素。近年来，荧光夹心免疫测定技术已被用于环境领域中微生物和/或生物分析物的鉴定26,27,28。该方法主要基于两个步骤：（i）将捕获抗体固定于芯片上，以特异性结合测试样品中的分析物；（ii）使用荧光标记的抗体（示踪或检测抗体）对分析物-抗体复合物进行检测。由于夹心免疫测定要求分析物上至少存在两个可接近的抗体结合位点（即表位）才能发生反应，因此任何阳性荧光信号均表明样品中存在相对较大且结构复杂、寡聚或多聚形式的分析物，这些分析物与用于制备捕获抗体的抗原相同或高度相似。
尽管该方法所需样品体积小、样品前处.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢马德里自治大学的 Antonio Quesada 博士提供蓝细菌菌株。本工作由以下机构资助： 研究项目总司副司长办公室 西班牙的 经济与竞争力部 （西班牙经济与竞争力部，项目编号：AYA2011-24803 和 ESP2014-58494-R）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 mm 孔径滤器 | Millipore | GSWP04700 | 用于免疫原的制备 |
| Eppendorf 5424R 微型离心机 | Fisher Scientific | 用于免疫原的制备 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM 磷酸钾，150 mM NaCl，pH 7.4 |
| 超声波处理器 UP50H | Hielscher | 用于免疫原的制备 | |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5881 | 免疫增强剂 |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5506 | 用于加强免疫注射 |
| Protein A 抗体纯化试剂盒 | Sigma-Aldrich | PURE1A | 用于 IgG 的分离 |
| 截留分子量<100 kDa 的离心过滤装置 | Millipore | UFC510096-96K | 用于 IgG 的分离 |
| 苯甲酰化透析管 | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | 用于 IgG 的分离 |
| Illustra Microspin G-50 柱 | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | 用于 IgG 的分离 |
| Bradford 试剂 | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | 用于定量抗体浓度 |
| MicroBCA 蛋白定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23235 | 用于定量抗体浓度 |
| 2x 蛋白点样缓冲液 | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | 打印缓冲液；含 0.01% Tween 20 的 1x PBS 中含 30–40% 甘油 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 非离子型去垢剂 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | 打印对照 ；封闭试剂 |
| 384 孔微孔板 | Genetix | X6004 | 用于抗体点样 |
| 多片载玻片机器人点样仪 | Digilab MicroGrid II TAS 点样仪 | 用于抗体点样 | |
| 环氧基底玻璃载玻片 | Arrayit 公司 | VEPO25C | 抗体点样的固体支持物 |
| Alexa Fluor-647 琥珀酰亚胺酯 | Molecular probes | A20006 | 荧光染料 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 荧光染料溶剂 |
| Heidolph Titramax 振荡平台摇床 | Fisher Scientific | 用于抗体标记 | |
| Illustra Microspin G-50 柱 | Healthcare | 27-5330-01 | 用于纯化标记抗体 |
| 棕色安全密封 0.5 mL 管 | Sarstedt | 72,704,001 | 用于储存标记抗体 |
| Nanodrop 1000 分光光度计 | Thermo Scientific | 用于定量抗体浓度和标记效率 | |
| 3 µm 孔径、47 mm 直径聚碳酸酯滤膜 | Millipore | TMTP04700 | 用于细胞浓缩 |
| 1 M Trizma 盐酸溶液 pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | 用于 TBSTRR 的制备；封闭载玻片 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | 用于 TBSTRR 的制备 |
| 20 µm 尼龙滤膜 | Millipore | NY2004700 | 用于环境提取物的制备 |
| 10–12 mm 滤器支架 | Millipore | SX0001300 | 用于环境提取物的制备 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | 用于环境提取物的储存 |
| 1 M Trizma 盐酸溶液 pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | 用于封闭载玻片 |
| Heidolph Duomax 1030 摇床 | VWR | 用于封闭载玻片；孵育过程 | |
| VWR Galaxy miniarray 微型离心机 | VWR | C1403-VWR | 用于干燥载玻片 |
| 多孔微阵列杂交盒 | Arrayit 公司 | AHC1X24 | 每张载玻片可进行 24 个检测的盒式装置 |
| GenePix 4100A 微阵列扫描仪 | Molecular Devices | 荧光扫描仪 | |
| GenePix Pro 软件 | Molecular Devices | 用于图像分析和定量的软件 |
参考文献
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Env....
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重印与许可
