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方法文章

体内研究利用生物发光成像技术评估抗菌蓝光疗法对多重耐药鲍曼不动杆菌烧伤感染的治疗效果

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DOI：

10.3791/54997

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2017年4月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

本文内容

摘要

由多重耐药（MDR）细菌菌株引起的感染已成为公共卫生的重大威胁，迫切需要开发替代性治疗方法。本文介绍了一种利用生物发光成像技术评估抗菌蓝光（aBL）疗法在小鼠烧伤模型中对抗多重耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）感染效果的实验方案。

摘要

烧伤感染仍然是导致发病和死亡的重要原因。多重耐药菌（MDR）的不断出现，导致传统抗生素治疗经常失败。迫切需要替代性治疗方法来应对多重耐药菌。

一种创新的非抗生素方法——抗菌蓝光（aBL）——在对抗多重耐药菌（MDR）感染方面已显示出良好的应用前景。目前，aBL的作用机制尚不完全明确。通常认为，其作用机制与细菌内源性天然存在的光敏性发色团有关（例如，无铁卟啉、黄素， 等等。) 被 aBL 激发后，通过光化学过程产生具有细胞毒性的活性氧（ROS）。

与另一种基于光的抗菌方法——抗菌光动力疗法（aPDT）不同，aBL疗法不需要外源性光敏剂的参与。它仅需蓝光照射即可发挥作用，因此操作简便且成本低廉。aBL的作用靶点是细菌内源性的细胞光敏物质，而非DNA。因此，与直接导致宿主细胞DNA损伤的紫外C（UVC）照射相比，aBL被认为对宿主细胞的遗传毒性要低得多。

本文介绍了一种在烧伤小鼠模型中评估aBL疗法对多重耐药Acinetobacter baumannii感染疗效的实验方案。通过使用基因工程改造的生物发光菌株，我们能够对活体动物中的感染程度进行无创的实时监测。该技术还可有效用于监测动物体内感染的空间分布情况。

引言

烧伤感染因皮肤热损伤而频繁发生，仍是导致发病和死亡的重要原因1烧伤感染的治疗因多重耐药（MDR）细菌菌株的不断出现而进一步受到阻碍。2 由于抗生素的大量使用。一种重要的多重耐药革兰氏阴性菌是 鲍曼不动杆菌，已知与近期战伤相关，且对几乎所有现有抗生素具有耐药性3损伤部位存在生物膜已有报道4,5 并且被认为会加剧对抗生素和宿主防御的耐受性6,7，导致持续性感染8,9因此，迫切需要开发替代疗法。在最近公布的 国家应对抗生素耐药性细菌战略，美国政府已将开发抗生素的替代疗法列为一项重要举措10.

基于光的抗菌方法顾名思义需要光照，可单独使用或联合其他试剂。这些方法包括抗菌光动力疗法（aPDT）、紫外-C（UVC）照射以及抗菌蓝光（aBL）。在以往的研究中，这些方法在杀灭多重耐药菌株方面已显示出良好的效果11,12,13。在上述三种基于光的方法中，aBL因其无需使用光敏剂即可发挥固有抗菌作用，近年来受到越来越多关注14。与aPDT相比，aBL仅需使用光，而aPDT则需要光与光敏剂的联合应用，因此aBL操作更简便且成本较低14。与UVC相比，aBL被认为对宿主细胞的细胞毒性和基因毒性显著更低15。

本实验方案旨在研究非热等离子体（aBL）治疗由多重耐药鲍曼不动杆菌（A. baumannii）引起的烧伤感染在小鼠模型中的有效性。我们利用生物发光的致病菌建立新型小鼠烧伤感染模型，从而实现对细菌负荷的无创实时监测。与传统的体液/组织取样、平板培养及菌落计数方法16相比，该技术可提供更为准确的结果。组织取样过程可能引入额外的实验误差。由于细菌发光强度与相应的菌落形成单位（CFU）呈线性正比关系17，因此我们可直接测定特定剂量光照后细菌的存活情况。通过实时监测接受光照治疗的活体动物体内细菌负荷的变化，可在显著减少实验小鼠使用数量的情况下，准确表征细菌杀灭的动力学过程。

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方案

1. 细菌培养物的制备

  1. 向50 mL离心管中加入7.5 mL脑心浸液（BHI）培养基。将鲍曼不动杆菌（A. baumannii）细胞接种至BHI培养基中，然后将A. baumannii培养物置于摇床培养箱中（37 °C）培养18小时。
  2. 在3,500 × g条件下离心培养物5分钟，弃去上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀。
  3. 将细菌沉淀重悬于新鲜PBS中，并充分吹打混匀。
  4. 取100 µL细菌悬液，用新鲜PBS进行1:10稀释。
  5. 将稀释后的悬液转移至1.5 mL半微量比色皿中，在600 nm波长下测定其光密度（OD）（OD600-nm）。
  6. 根据稀释液测得的OD600 nm值及稀释倍数（10），计算原始（未稀释）PBS悬液的OD600-nm 值。
  7. 将原始PBS悬液调节至OD600-nm = 0.6（相当于细胞密度为108 CFU/mL）。

2. 由发光性A. baumannii引起的小鼠烧伤感染模型

  1. 使用7-8周龄、体重17-19 g的成年雌性BALB/c小鼠。实验开始前，让小鼠在实验室条件下适应至少3天。将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环环境中，室温保持在21 ℃，并自由供应食物和水 随意摄取.
  2. 用氯胺酮-赛拉嗪混合物（100 mg/kg - 20 mg/kg）进行腹腔注射，使小鼠麻醉。用棉签轻轻触碰每只小鼠的眼睑；若眼睑反射消失，提示麻醉深度适当。 用兽医用眼膏覆盖小鼠眼睛，以防止麻醉期间眼睛干涩。
  3. 使用50号刀头的电推剪剃除小鼠背部毛发，以暴露尽可能多的皮肤。
  4. 将35 mm培养皿的皿盖置于小鼠腹部下方，以保持其背部处于相对水平的位置。
  5. 在250 mL烧杯（装至80%满）中加热水至沸腾，使用10" ×10"220 VAC 电热板。将一块黄铜块（横截面为 1 cm × 1 cm）浸入烧杯中，直至其与水达到热平衡。热平衡通常需要 <5 分钟，以烧杯中的水重新沸腾为标志。
  6. 在造成烧伤损伤之前，给予预先镇痛药物（皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡）以缓解疼痛。
  7. 在给予镇痛药10分钟后，将加热的黄铜块轻轻按压在小鼠背部已剃毛区域7秒，以造成烫伤创面。
    注意：为避免操作人员受到热损伤，在进行燃烧操作时应佩戴耐热手套。
  8. 通过皮下注射0.5 mL无菌生理盐水，以预防脱水。
  9. 热损伤诱导后5分钟，接种50 µL含有5 x 10⁶6 用移液管将PBS中的菌落形成单位（CFU）接种至小鼠烧伤创面。使用无菌棉签在皮肤上以Z字形移动，将菌液均匀涂布于烧伤区域，使细菌细胞尽可能均匀分布。
  10. 细菌接种后立即按照第4节所述方法对感染性烧伤进行生物发光成像。
  11. 将小鼠置于加热垫（37 °C，恢复区）上，直至其完全从麻醉状态中恢复。 将小鼠饲养在生物安全二级动物房中，每笼最多5只。
  12. 烧伤后前三天内，每天两次给予镇痛药（皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺）。

3. 蓝光抗菌疗法治疗小鼠 A. baumannii 感染

  1. 在细菌接种后24小时开始aBL治疗。
  2. 使用峰值发射波长为415 nm的发光二极管（LED）进行aBL照射。将LED安装在散热片上，以防止对小鼠照射区域产生热效应18使用夹具连接器将LED固定在光学支撑杆上，以便LED可上下移动。
  3. 打开功率/能量计，按下波长按钮选择415 nm。重置功率/能量计以扣除背景（环境光）值。
  4. 将功率/能量计置于LED正下方。佩戴防蓝光护目镜。打开LED光源，调节LED出光口（用于汇聚LED发出的光线的透镜）与功率/能量计的光传感器（直径为2 cm）之间的距离，使光斑完全覆盖光传感器的整个表面。
  5. 仔细调节LED驱动器，并记录功率/能量计的读数。根据读数计算辐照度：辐照度 = 读数（W）/面积（cm²）2调节LED驱动器，将LED的辐照度调整至100 mW/cm²。
  6. 关闭LED。测量LED孔径与功率/能量计的光传感器之间的距离。
  7. 通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（100 mg/kg - 20 mg/kg）对小鼠进行麻醉。眼睑反射消失提示麻醉深度适当。
  8. 随机将小鼠分为aBL处理组（n = 10）以及一个未经处理的对照组（n = 10).
  9. 对于aBL处理组，用铝箔覆盖小鼠的眼睛以避免光线过度暴露。将小鼠直接置于LED灯下方，其腹部下方垫有35 mm培养皿的盖子，以保持背部处于水平位置。
  10. 将步骤3.5中提到的功率/能量计替换为放置在方形培养皿上的小鼠。调整小鼠的高度，使其烧伤表面与LED出光口之间的距离等于步骤3.5中LED出光口与功率/能量计光传感器表面之间的距离。
  11. 以 100 mW/cm² 的辐照度照射感染的烧伤部位2以72 J/cm²的剂量递送aBL2 直至总剂量达到 360 J/cm2 达到（例如0、72、144、216、288 和 360 J/cm2每次光照剂量后，按照第4节所述对小鼠进行生物发光成像。
  12. 对于未处理对照组，按照第4节所述方法，采用与aBL处理组相同的时间间隔，对小鼠烧伤部位进行生物发光成像。
  13. 在小鼠苏醒前，将其置于加热水暖手术床上，以防止热量散失和低体温。观察小鼠的活动情况及眼睑反射，直至其完全恢复。小鼠恢复后，每笼饲养2-3只。
  14. aBL 治疗后，按照第 4 节所述方法，对小鼠进行生物发光成像，前 3 天每日一次，之后隔日一次，以监测感染随时间变化的生物负荷。

4. 小鼠感染的生物发光成像

  1. 使用包含增强型电荷耦合器件相机、相机控制器、样品室和图像处理器的低光照成像系统对小鼠进行成像19。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（100 mg/kg - 20 mg/kg）对小鼠进行麻醉。用棉签轻轻触碰小鼠眼睑；若眨眼反射消失，提示麻醉深度适当。
  3. 启动活体成像软件。在出现的控制面板中，点击“Initialize”（初始化）。等待“Temperature”（温度）框颜色变为绿色，表明样品室载物台的温度已达到 37 °C。
  4. 将小鼠放置于成像系统样品室内的载物台上（37 °C），使感染的烧伤部位正对相机。
    注意：当烧伤部位变干时，细菌的生物发光信号可能减弱。因此，建议在成像前用 PBS 润湿小鼠的烧伤部位。
  5. 在控制面板中，勾选 "Luminescence" 选项。选择 "Auto exposure"，以便活体成像软件根据生物发光强度自动优化成像曝光时间。
  6. 从 "Field of View" 下拉菜单中选择 "C"。选择 "Scan mid range" 选项，使软件自动确定焦距。勾选“Overlay”（叠加）选项。
  7. 点击 "Acquire" 以采集图像。在弹出的 "Edit Image Label" 对话框中点击 "OK"；随后将出现 "Image Window" 和 "Toll Palette" 窗口。
  8. 设置自动选区（Auto ROI）参数以实现自动选择。
  9. 将生物发光强度量化为相对发光单位（RLUs），并以伪彩标度显示生物发光信号，颜色范围从粉红色（最强）到蓝色（最弱）19,20。
  10. 根据生物发光强度分析，计算不同时间点小鼠烧伤部位中细菌的存活分数。特定时间点的细菌存活分数 = 该时间点测得的生物发光强度 / aBL 照射前立即测得的生物发光强度17。

5. 小鼠的安乐死

  1. 实验的终点如下：（a）感染消退，表现为成像检测到的生物发光信号消失；（b）出现系统性感染，表现为生物发光信号扩散至烧伤区域以外；（c）与正常同龄小鼠相比，体重减轻≥15%，或出现疼痛与痛苦症状，表现为对人工刺激无反应、活动减少、无法进食或饮水。在研究过程中，若遇到无法确定小鼠是否已完全达到本定义所述濒死状态，和/或无法判断是否需要实施安乐死的情况，将联系比较医学中心（CCM）兽医人员以确定后续处理方案；（d）若未提前达到上述终点，所有小鼠将在研究开始后第30天实施安乐死。 
  2. 将小鼠转移至专用于安乐死的封闭笼具中，并通过输入二氧化碳（CO₂）对小鼠实施安乐死。2) 将压缩气体注入笼中。 
    1. 打开 CO2 使用气罐或阀门调节器启动气体流动。根据设备上标注的说明，确认调节器显示的压强（psi，磅每平方英寸）正确，并根据需要将调节器调整至正确的 psi 值，通常不超过 5 psi。
    2. 缓慢填充。流速应不超过每分钟置换30%的箱/笼体积（对于典型的小鼠笼，约为2 L/min；对于大鼠笼，约为7.5 L/min）。
    3. 等待动物约 3-5 分钟，直至其停止活动或呼吸；此时眼睛应固定且瞳孔散大。关闭 CO2 关闭气罐或调节阀以停止二氧化碳气流2.
    4. 用拇指和食指触摸胸部，确认心脏已停止跳动。通过触碰眼球确认无眨眼反射。
      1. 如果仍有心跳或眨眼反射，需重复安乐死操作，或使用剪刀打开胸腔以造成气胸（在实施此操作前，动物必须对脚趾挤压无反应）。

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结果

我们所使用的 A. baumannii 菌株是一种多重耐药（MDR）临床分离株，此前已有报道12,17。该细菌菌株通过转染 luxCDABE 操纵子而具备生物发光能力11。图1A 显示了一只代表性小鼠烧伤模型在感染 5 × 106 A. baumannii 后，于接种细菌24小时时接受一次aBL照射，其后连续拍摄的细菌发光图像。对代表性小鼠皮肤烧伤组织切片（接种后24小时采集）进行革兰氏染色，结果显示感染烧伤表面存在 A. baumannii 生物膜（图1B）。如 图1A 所示，当给予 360 J/cm2 的aBL照射（以 100 mW/cm2 的辐照度照射60分钟）后，细...

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讨论

aBL 是一种治疗感染的新型方法。由于其作用机制与化学疗法完全不同，因此更接近于物理治疗。介导抗菌效应的因子是蓝光照射（400-470 nm）。随着蓝光LED的发展，我们获得了一种针对多重耐药菌感染的有效且简便的光基抗菌方法。

在本实验方案中，我们描述了一种由多重耐药的发光杆菌株A. baumannii引起烧伤感染的小鼠模型的建立方法。通过使用生物发光细菌，可在活体动物中利用生物发光成像技术无创、实时地监测感染的范围。借助基因工程改造的生物发光菌株及低光照成像技术，该方法为抗菌治疗过程中感染状况的实时监测提供了一种高效手段。该方法还可用于研究由其他微生物种类引起并发生于其他部位的感染。除了可用于评估抗菌策略的有效性外，该方法还可用于追踪感染进展过程。

通过使用该小鼠模型，我们证明了415 nm的aBL能够成功灭活已建立感染中的细菌（图1A 和 C）。在aBL治疗前，可在已建立的感染中观察到细菌聚集（图1B），...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作部分得到了美国陆军医学研究采购机构合作协定下医学与创新技术整合中心（CIMIT）（CIMIT 编号：14-1894，授予 TD）以及美国国立卫生研究院（1R21AI109172，授予 TD）的支持。YW 获得了美国激光医学与外科学会（ASLMS）学生研究基金（BS.S02.15）的支持。我们感谢Wellman中心的Tayyaba Hasan博士对YW的共同指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IVIS PerkinElmer Inc, Waltham, MAIVIS Lumina Series III临床前 in vivo 成像
发光二极管（LED）VieLight Inc, Toronto, Canada 415 nm照明光源
功率/能量计Thorlabs, Inc., Newton, NJPM100D光辐照度检测器
小鼠 Charles River Laboratories, Wilmington, MABALB/c7–8 周龄，体重 17–19 g
Acinetobacter baumannii Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX临床分离株基因工程发光菌株
胰岛素注射器Fisher Scientific14-826-79BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器，用于注射
氯化钠Fisher Scientific7210160.9% 氯化钠
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP24384 多种生物分子实验中常用的标准磷酸盐缓冲液
脑心浸出液培养基（BHI）Fisher ScientificB11059细菌培养基
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-959-70C用于细菌悬液离心
台式恒温振荡摇床Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH Incu-Shaker Mini用于细菌培养
接种环Fisher Scientific22-363-605  用于将细菌接种物涂抹于小鼠烧伤创面
Fisher Scientific Redi-Tip 移液器吸头，1–200 µLFisher Scientific02-707-502移液器吸头
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 离心机Fisher Scientific75-004-220用于细菌悬液分离
黄铜块Small Parts, Inc., Miami, FL10 mm × 10 mm 用于在小鼠身上制造烧伤
Extreme Dragon PBI/Kevlar 耐高温手套Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NYPBI83514 耐热手套
Greiner 培养皿Sigma-Aldrich Co. LLCP5112-740EA35 mm ×10 mm
Corning 数字加热板Cole-Parmer Instrument Company, LLCUX-84301-6510" × 10"，220 VAC，用于加热水 
小鼠/大鼠细线式水循环加热手术台E-Z SystemsEZ-211防止手术过程中热量流失和低体温
兽用眼膏S&K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%, Augensalbe眼科用眼膏，防止眼睛干燥

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