体内研究利用生物发光成像技术评估抗菌蓝光疗法对多重耐药鲍曼不动杆菌烧伤感染的治疗效果

摘要

由多重耐药（MDR）细菌菌株引起的感染已成为公共卫生的重大威胁，迫切需要开发替代性治疗方法。本文介绍了一种利用生物发光成像技术评估抗菌蓝光（aBL）疗法在小鼠烧伤模型中对抗多重耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）感染效果的实验方案。

摘要

烧伤感染仍然是导致发病和死亡的重要原因。多重耐药菌（MDR）的不断出现，导致传统抗生素治疗经常失败。迫切需要替代性治疗方法来应对多重耐药菌。

一种创新的非抗生素方法——抗菌蓝光（aBL）——在对抗多重耐药菌（MDR）感染方面已显示出良好的应用前景。目前，aBL的作用机制尚不完全明确。通常认为，其作用机制与细菌内源性天然存在的光敏性发色团有关（例如，无铁卟啉、黄素， 等等。) 被 aBL 激发后，通过光化学过程产生具有细胞毒性的活性氧（ROS）。

与另一种基于光的抗菌方法——抗菌光动力疗法（aPDT）不同，aBL疗法不需要外源性光敏剂的参与。它仅需蓝光照射即可发挥作用，因此操作简便且成本低廉。aBL的作用靶点是细菌内源性的细胞光敏物质，而非DNA。因此，与直接导致宿主细胞DNA损伤的紫外C（UVC）照射相比，aBL被认为对宿主细胞的遗传毒性要低得多。

本文介绍了一种在烧伤小鼠模型中评估aBL疗法对多重耐药Acinetobacter baumannii感染疗效的实验方案。通过使用基因工程改造的生物发光菌株，我们能够对活体动物中的感染程度进行无创的实时监测。该技术还可有效用于监测动物体内感染的空间分布情况。

引言

烧伤感染因皮肤热损伤而频繁发生，仍是导致发病和死亡的重要原因¹烧伤感染的治疗因多重耐药（MDR）细菌菌株的不断出现而进一步受到阻碍。² 由于抗生素的大量使用。一种重要的多重耐药革兰氏阴性菌是 鲍曼不动杆菌，已知与近期战伤相关，且对几乎所有现有抗生素具有耐药性³损伤部位存在生物膜已有报道^4,5 并且被认为会加剧对抗生素和宿主防御的耐受性^6,7，导致持续性感染^8,9因此，迫切需要开发替代疗法。在最近公布的 国家应对抗生素耐药性细菌战略，美国政府已将开发抗生素的替代疗法列为一项重要举措¹⁰.

基于光的抗菌方法顾名思义需要光照，可单独使用或联合其他试剂。这些方法包括抗菌光动力疗法（aPDT）、紫外-C（UVC）照射以及抗菌蓝光（aBL）。在以往的研究中，这些方法在杀灭多重耐药菌株方面已显示出良好的效果

方案

1. 细菌培养物的制备

1. 向50 mL离心管中加入7.5 mL脑心浸液（BHI）培养基。将鲍曼不动杆菌（A. baumannii）细胞接种至BHI培养基中，然后将A. baumannii培养物置于摇床培养箱中（37 °C）培养18小时。
2. 在3,500 × g条件下离心培养物5分钟，弃去上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀。
3. 将细菌沉淀重悬于新鲜PBS中，并充分吹打混匀。
4. 取100 µL细菌悬液，用新鲜PBS进行1:10稀释。
5. 将稀释后的悬液转移至1.5 mL半微量比色皿中，在600 nm波长下测定其光密度（OD）（OD_600-nm）。
6. 根据稀释液测得的OD_{600 nm}值及稀释倍数（10），计算原始（未稀释）PBS悬液的OD_600-nm 值。
7. 将原始PBS悬液调节至OD_600-nm = 0.6（相当于细胞密度为10⁸ CFU/mL）。

2. 由发光性A. baumannii引起的小鼠烧伤感染模型

1. 使用7-8周龄、体重17-19 g的成年雌性BALB/c小鼠。实验开始前，让小鼠在实验室条件下适应至少3天。将小鼠饲养在....

结果

我们所使用的 A. baumannii 菌株是一种多重耐药（MDR）临床分离株，此前已有报道^12,17。该细菌菌株通过转染 luxCDABE 操纵子而具备生物发光能力¹¹。图1A 显示了一只代表性小鼠烧伤模型在感染 5 × 10⁶ A. baumannii 后，于接种细菌24小时时接受一次aBL照射，其后连续拍摄的细菌发光图像。对代表性小鼠皮肤烧伤组织切片（接种后24小时采集）进行革兰氏染色，结果显示感染烧伤表面存在 A. baumannii 生物膜（图1B）。如 图1A 所示，当给予 360 J/cm² 的aBL照射（以 100 mW/cm² 的辐照度照射60分钟）后，细.......

讨论

aBL 是一种治疗感染的新型方法。由于其作用机制与化学疗法完全不同，因此更接近于物理治疗。介导抗菌效应的因子是蓝光照射（400-470 nm）。随着蓝光LED的发展，我们获得了一种针对多重耐药菌感染的有效且简便的光基抗菌方法。

在本实验方案中，我们描述了一种由多重耐药的发光杆菌株A. baumannii引起烧伤感染的小鼠模型的建立方法。通过使用生物发光细菌，可在活体动物中利用生物发光成像技术无创、实时地监测感染的范围。借助基因工程改造的生物发光菌株及低光照成像技术，该方法为抗菌治疗过程中感染状况的实时监测提供了一种高效手段。该方法还可用于研究由其他微生物种类引起并发生于其他部位的感染。除了可用于评估抗菌策略的有效性外，该方法还可用于追踪感染进展过程。

通过使用该小鼠模型，我们证明了415 nm的aBL能够成功灭活已建立感染中的细菌（图1A 和 C）。在aBL治疗前，可在已建立的感染中观察到细菌聚集（图1B），.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Series III	临床前 in vivo 成像
发光二极管（LED）	VieLight Inc, Toronto, Canada	415 nm	照明光源
功率/能量计	Thorlabs, Inc., Newton, NJ	PM100D	光辐照度检测器
小鼠	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7–8 周龄，体重 17–19 g
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	临床分离株	基因工程发光菌株
胰岛素注射器	Fisher Scientific	14-826-79	BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器，用于注射
氯化钠	Fisher Scientific	721016	0.9% 氯化钠
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP24384	多种生物分子实验中常用的标准磷酸盐缓冲液
脑心浸出液培养基（BHI）	Fisher Scientific	B11059	细菌培养基
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C	用于细菌悬液离心
台式恒温振荡摇床	Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH	Incu-Shaker Mini	用于细菌培养
接种环	Fisher Scientific	22-363-605	用于将细菌接种物涂抹于小鼠烧伤创面
Fisher Scientific Redi-Tip 移液器吸头，1–200 µL	Fisher Scientific	02-707-502	移液器吸头
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 离心机	Fisher Scientific	75-004-220	用于细菌悬液分离
黄铜块	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm × 10 mm	用于在小鼠身上制造烧伤
Extreme Dragon PBI/Kevlar 耐高温手套	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	耐热手套
Greiner 培养皿	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Corning 数字加热板	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" × 10"，220 VAC，用于加热水
小鼠/大鼠细线式水循环加热手术台	E-Z Systems	EZ-211	防止手术过程中热量流失和低体温
兽用眼膏	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	眼科用眼膏，防止眼睛干燥