用于鉴定内在无序蛋白多重磷酸化的核磁共振波谱法

摘要

本文介绍了一种利用核磁共振波谱法（NMR）鉴定内在无序蛋白多位点磷酸化的方法，并以Tau蛋白为例进行说明。重组Tau蛋白经同位素标记并修饰 体外 在数据采集和分析之前由激酶进行磷酸化。

摘要

阿尔茨海默病患者神经元内存在 Tau 蛋白的聚集物。该疾病的发展伴随着 Tau 蛋白异常磷酸化的增加。在对 Tau 蛋白在疾病中功能与功能障碍的分子研究过程中，核磁共振（NMR）波谱技术被用于鉴定 Tau 蛋白的多种磷酸化修饰。本文提供了在细菌中重组表达 Tau 蛋白并进行同位素标记以用于 NMR 研究的详细方案。描述了利用 Tau 蛋白耐热性高和等电点高的特性进行纯化的步骤。体外使用重组活化 ERK2 激酶对 Tau 蛋白进行磷酸化的方案可实现多重磷酸化修饰的生成。经过上述步骤后，蛋白样品即可用于数据采集。接下来讨论了在波谱仪上启动信号记录的参数设置。最后，阐述了基于 NMR 数据鉴定修饰后 Tau 蛋白磷酸化位点的策略。本文还讨论了该方法相较于其他鉴定磷酸化位点技术（如免疫检测或质谱分析（MS））的优势。

引言

21世纪医疗保健的主要挑战之一^st 21世纪最主要的神经退行性疾病之一是阿尔茨海默病（AD）。Tau是一种微管相关蛋白，可促进微管（MT）的形成。Tau同样参与多种被称为tau蛋白病的神经退行性疾病，其中最广为人知的是AD。在这些疾病中，Tau蛋白会自聚集形成成对的螺旋丝（PHFs），并经由磷酸化等翻译后修饰（PTMs）在多个残基上发生修饰。¹Tau蛋白的磷酸化既参与调控其稳定微管的生理功能，也与阿尔茨海默病神经元中该功能的病理性丧失有关。

此外，Tau蛋白在病变神经元中整合到成对螺旋纤维（PHFs）时， invariably 处于过度磷酸化状态²。与含有2-3个磷酸基团的正常Tau蛋白不同，PHFs中的过度磷酸化Tau蛋白含有5至9个磷酸基团³。Tau蛋白的过度磷酸化既表现为某些位点磷酸化化学计量比的增加，也表现为额外位点的磷酸化，这些额外位点被称为病理磷酸化位点。然而，尽管磷酸化水平存在定量差异，阿尔茨海默病（AD）与正常成人Tau蛋白的磷酸化模式之间仍存在部分重叠⁴。特定的磷酸化事件如何影响Tau蛋白的功能与功能障碍，目前仍 largely 不清楚。我们的目标是在分子水平上解析PTMs对Tau蛋白的调控机制。

为了深入理解 Tau 蛋白的分子特性，我们必须应对若干技术挑战。首先，Tau 在溶液中是一种内在无序蛋白（IDP），这类蛋白在生理条件下缺乏明确的三维结构，需要特殊的生物物理方法来研究其功能和结构特性。Tau 是日益受到关注的 IDP 类蛋白的典型代表，这类蛋白常与神经退行性疾病等病理过程相关，因而促使人们更加关注揭示其功能背后的分子参数。其次，Tau 磷酸化的表征面临分析上的挑战，其最长的 441 个氨基酸 Tau 亚型序列上存在多达 80 个潜在的磷酸化位点。目前已开发出多种针对 Tau 磷酸化表位的抗体，用于在神经元或脑组织中检测病理状态下的 Tau 蛋白。磷酸化事件可发生在至少 20 个由脯氨酸导向激酶作用的位点上，其中大多数位点位于富含脯氨酸区域的邻近位置。即使采用最新的质谱技术，对这些位点的定性（哪些位点？）和定量（磷酸化程度如何？）表征仍然十分困难⁵。

核磁共振波谱可用于研究构象无序的蛋白质，这类蛋白质是高度动态的体系，由多种构象体集合构成。高分辨率核磁共振波谱被用于研究Tau蛋白的结构与功能。此外，Tau蛋白磷酸化谱的复杂性促使研究人员开发了分子工具，并利用核磁共振技术建立了新的分析方法，以鉴定其磷酸化位点^6-8核磁共振（NMR）作为一种分析方法，能够全局性地鉴定Tau蛋白的磷酸化位点，在单次实验中可视化所有单一位点的修饰，并定量磷酸基团的掺入程度。这一点至关重要，因为尽管文献中关于Tau蛋白磷酸化的研究众多，但大多数研究依赖抗体进行检测，导致对磷酸化整体谱型仍存在较大不确定性，从而难以准确评估各个磷酸化事件的真实影响。可制备具有Tau磷酸化活性的重组激酶，包括蛋白激酶A（PKA）、糖原合酶激酶3β（Gsk3β）、周期蛋白依赖性激酶2/周期蛋白A（CDK2/CycA）、周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）/p25激活蛋白、细胞外信号调节激酶2（ERK2）以及微管亲和性调节激酶（MARK），并使其保持活性状态。此外，通过构建特定的Tau突变体，可生成具有明确磷酸化模式的Tau蛋白亚型，以解析Tau蛋白的磷酸化编码机制。随后利用核磁共振波谱技术对酶促修饰后的Tau样品进行表征。^6-8。尽管 体外 Tau蛋白的磷酸化比通过将特定丝氨酸/苏氨酸突变为谷氨酸（Glu）残基来模拟磷酸化的伪磷酸化方法更具挑战性，但该方法仍有其优势。事实上，谷氨酸并不能始终准确模拟磷酸化对蛋白结构的影响及其相互作用参数。例如，在磷酸化丝氨酸202（pSer202）和磷酸化苏氨酸205（pThr205）周围观察到的转角结构模体，就无法通过谷氨酸突变重现。⁹.

此处首先介绍用于核磁共振（NMR）研究的同位素标记Tau蛋白的制备方法。由ERK2磷酸化的Tau蛋白在多个被描述为病理磷酸化位点的位置发生修饰，因此可作为高磷酸化Tau蛋白的一个重要研究模型。以下为Tau蛋白的详细实验方案 体外 由重组ERK2激酶介导的磷酸化作用。ERK2通过丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶（MEK）的磷酸化作用而被激活。^10-12除了修饰的同位素标记Tau蛋白的制备外，还描述了用于鉴定翻译后修饰的核磁共振策略。

方案

1. ¹⁵N、¹³C标记Tau蛋白的制备（图1）

1. 将 pET15b-Tau 重组 T7 表达质粒^13,14 转化至 BL21(DE3) 感受态 Escherichia coli 细菌细胞中¹⁵。
   注意：编码最长 Tau 亚型（441 个氨基酸残基）的 cDNA 已克隆至 pET15b 质粒的 NcoI 和 XhoI 限制性酶切位点之间。
   1. 在 1.5 ml 塑料离心管中，轻轻混合 50 µl 感受态 BL21(DE3) 细胞（每 µg 质粒 DNA 可形成 1–5 × 10⁷ 个菌落）与 100 ng 质粒 DNA。
      注意：用于真核 cDNA 表达的密码子优化细菌菌株并非表达人源 Tau 蛋白所必需。
   2. 将细胞混合物置于冰上 30 分钟，随后在 42 °C 下热激 10 秒。再将离心管放回冰上 5 分钟，并加入 1 ml 室温 LB（Luria-Bertani）培养基。将细菌悬液在 37 °C 下轻轻振荡培养 30 分钟。
2. 用接种环将 100 µl 细菌悬液均匀涂布于含 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。
3. 将筛选平板在 37 °C 下培养 15 小时。
4. 将筛选平板保存于 4 °C，直至进入培养步骤，最长可保存约 2 周。
   注意：可制备细菌培养物的甘油冻存液（含 50% 甘油），于 -80 °C 保存，以便后续启动培养。
5. 向 1 L 已高压灭菌的 M9 盐溶液（含 6 g Na₂HPO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 g NaCl）中加入 1 ml 1 M MgSO₄、1 ml 100 mM CaCl₂、10 ml 100 倍 MEM 维生素补充液和 1 ml 100 mg/ml 氨苄青霉素。
   注意：将 CaCl₂ 溶液加入 M9 盐溶液时会形成白色沉淀，但该沉淀会迅速消散。
6. 将 300 mg ¹⁵N, ¹³C 完全标记培养基、1 g ¹⁵NH₄Cl 和 2 g ¹³C₆-葡萄糖溶于 10 ml M9 培养基中。使用 0.2 µm 滤器将同位素溶液过滤除菌，直接滤入 M9 培养基中。
7. 用接种环从筛选平板上挑取一单菌落的 pET15b-Tau 转化菌，接种至 20 ml 含 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中。
8. 将接种后的培养基在 37 °C 下培养约 6 小时。
9. 取 1 ml 十倍稀释的细菌培养液，用塑料比色皿在 600 nm 处测定光密度（OD₆₀₀）。
   注意：当细菌培养液的浊度对应 OD₆₀₀ 值为 3.0–4.0 时，表明已达到饱和生长阶段。
10. 将 20 ml 饱和 LB 培养液加入 1 L 含氨苄青霉素（终浓度 100 µg/ml）的 M9 生长培养基中，置于 2 L 带挡板的锥形塑料培养瓶中。
11. 将培养瓶放入程序控温培养箱中，设定为 10 °C、50 rpm。设定程序于次日清晨自动切换至 200 rpm 和 37 °C。
12. 取 1 ml 细菌培养液，用塑料比色皿测定 OD₆₀₀。当 OD₆₀₀ 达到约 1.0 时，加入 400 µl 1 M IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）储存液（保存于 -20 °C），以诱导重组 Tau 蛋白的表达。
13. 继续在 37 °C 下培养 3 小时。通过离心（5,000 × g，20 分钟）收集细菌细胞。
14. 将细菌沉淀在 -20 °C 冻存。如需长期保存，可保持冷冻状态直至进行纯化步骤。

2. ¹⁵N、¹³C标记Tau蛋白的纯化（图2）

1. 将阳离子交换（CEX）纯化缓冲液在15 psi压力下、121 °C条件下高压灭菌20分钟。将缓冲液储存于4 °C。
2. 解冻细菌细胞沉淀，并在45 ml提取用CEX A缓冲液（50 mM NaPi缓冲液，pH 6.5，含1 mM EDTA）中充分重悬，该缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂混合物1x（1片）和DNAseI（2,000单位）。
3. 使用高压均质机在20,000 psi条件下裂解细菌细胞，需进行3-4次循环。在20,000 × g条件下离心40分钟，以去除不溶性物质。
4. 将细菌细胞提取物置于水浴中，在75 °C加热15分钟。
   注意：数分钟后可观察到白色沉淀产生。
5. 在15,000 × g条件下离心20分钟，保留含有热稳定Tau蛋白的上清液。
6. 如需，将样品储存于-20 °C，待进行下一步纯化。
7. 使用强阳离子交换树脂装填5 ml柱床，通过快速蛋白液相色谱系统（FPLC）进行阳离子交换层析（图3 A）。
   1. 设定流速为2.5 ml/min。
   2. 用CEX A缓冲液平衡层析柱。
   3. 使用进样泵或系统中的泵A（视具体系统而定），将60–70 ml加热后的提取物上样至柱中。收集穿流液用于分析，以确认Tau蛋白是否有效结合至树脂（见步骤2.8）。
   4. 用CEX A缓冲液洗涤树脂，直至280 nm处的吸光度恢复至基线水平。
   5. 通过逐步增加CEX B缓冲液（含1 M NaCl的CEX A缓冲液）实现三步NaCl梯度洗脱Tau蛋白。FPLC程序设置如下：第一步，在10个柱体积（CV）内梯度升至25% CEX B缓冲液，达到250 mM NaCl；第二步，在5 CV内升至50% CEX B缓冲液，达到500 mM NaCl；第三步，在2 CV内升至100% CEX B缓冲液，达到1 M NaCl。在洗脱过程中收集每管1.5 ml的组分。
8. 取洗脱过程中收集的各组分10 µl，通过SDS-PAGE（12% SDS-丙烯酰胺凝胶）及考马斯亮蓝染色进行分析（图3 A）¹⁶。同时取10 µl穿流液进行分析，以检测上样步骤中Tau蛋白的结合情况。
9. 选择含有Tau蛋白的组分，并将其合并用于下一步操作。
10. 对含Tau蛋白的合并组分进行缓冲液置换（图3 B）。
    1. 使用FPLC系统，以50 mM碳酸氢铵（挥发性缓冲液）平衡装填有53 ml G25树脂（26 × 10 cm）的脱盐柱。
    2. 设定流速为5 ml/min。通过5 ml进样环将Tau样品注入层析柱，收集280 nm处吸收峰对应的组分。
    3. 根据初始CEX合并液的体积，重复进样3–4次。
11. 根据280 nm处色谱图的峰面积计算纯化Tau蛋白的含量（1 mg Tau对应140 mAU*ml）。
    注意：Tau蛋白在280 nm处的消光系数为7,550 M^-1cm^-1。Tau蛋白不含任何色氨酸（Trp）残基。
12. 将所有含Tau蛋白的组分合并。
13. 将样品分装至若干离心管中，每管含相当于1至5 mg的Tau蛋白。选择管体容积远大于溶液体积的离心管（例如，5 ml溶液置于50 ml离心管中）。
14. 用针头在管盖上打孔。将Tau样品在-80 °C冷冻。
15. 对Tau样品进行冻干。冻干后的Tau蛋白可在-20 °C长期保存。

3. 体外 磷酸化 ¹⁵N-Tau

1. 将5 mg冻干Tau蛋白溶解于500 µl磷酸化缓冲液（50 mM Hepes·KOH，pH 8.0，12.5 mM MgCl₂，1 mM EDTA，50 mM NaCl）中。
2. 在总体积为1 ml的样品中加入2.5 mM ATP（25 µl 100 mM储存液，-20 °C保存）、1 mM DTT（1 µl 1 M储存液，-20 °C保存）、1 mM EGTA（2 µl 0.5 M储存液）、1×蛋白酶抑制剂混合物（25 µl 40×储存液，通过将1片试剂溶于1 ml磷酸化缓冲液制备）以及1 µM活化的His-ERK2（250 µl保存于-80 °C的保存缓冲液中，缓冲液成分为10 mM Hepes，pH 7.3，1 mM DTT，5 mM MgCl₂，100 mM NaCl和10%甘油）。
   注意：活化的His-ERK2可通过MEK激酶磷酸化在实验室自行制备^5,8。
3. 在37 °C孵育3小时。
4. 将样品在75 °C加热15分钟以灭活ERK激酶。
5. 在20,000 × g离心15分钟，收集并保留上清液。
6. 使用装填体积为3.45 ml G25树脂（柱尺寸1.3 × 2.6 cm）的脱盐柱，将蛋白样品置换至50 mM碳酸氢铵溶液中，适用于1 ml样品。
7. 取2.5 µl蛋白样品进行12% SDS-PAGE¹⁶电泳，以检测蛋白完整性和磷酸化效率（图4）。
8. 将磷酸化的Tau蛋白样品冻干，粉末于-20 °C保存。

4. 核磁共振谱图的采集（图5）

1. 将4 mg冻干的¹⁵N、¹³C标记的ERK磷酸化Tau蛋白溶于400 µl NMR缓冲液（50 mM NaPi或50 mM氘代Tris-d11.Cl，pH 6.5，30 mM NaCl，2.5 mM EDTA和1 mM DTT）中。
2. 加入5% D₂O用于NMR谱仪的磁场锁场，并加入1 mM TMSP（3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d₄钠盐）作为NMR信号的内标。再加入10 µl 40倍浓度的蛋白酶抑制剂混合液原液。
3. 使用带长针头的电子移液器或巴斯德吸管将样品转移至5 mm NMR管中。用推杆封闭NMR管，并通过移动推杆排除推杆与液体之间可能存在的气泡。
4. 将NMR管放入转子中。使用与所用NMR探头匹配的量规调节其在转子中的垂直位置，使样品溶液的大部分位于NMR线圈内部。
5. 启动气流：在磁体控制系统窗口中点击lift。小心地将装有NMR管的转子置于磁体孔道顶部的气流中。停止气流（点击lift），使NMR管在磁体内部下降并就位于探头中。
6. 将温度设定为25 °C（298 K）。
7. 执行探头的半自动调谐与匹配，以优化射频功率传输效率。在命令行中输入atmm。
8. 利用样品在氘通道中记录的D₂O信号锁定谱仪频率。在磁体控制系统窗口中点击lock。
9. 启动匀场程序，以优化样品位置处磁场的均匀性。在命令行中输入topshim gui以打开匀场窗口，然后点击start。检查残余B0标准偏差值以确认匀场是否达到最佳状态（小于2 Hz为佳）。
10. 校准p1参数（质子射频脉冲的持续时间，单位为µsec），该参数用于实现质子自旋的90°翻转。通过水性质子的一维谱（图6）调整至360°脉冲。
11. 通过设置o1参数（单位为Hz）至一维谱中水性质子的共振频率，调整频率偏移（图6）。
12. 开始采集一维质子谱（例如使用watergate序列抑制水信号的zggpw5脉冲序列），以确认样品信号的存在（图7）。根据蛋白质的相对浓度调整扫描次数。在命令行中输入zg以开始采集。
13. 设置采集二维[¹H,¹⁵N] HSQC谱的额外参数（脉冲序列为hsqcetfpf3gpsi，图8-9）。
    1. 对于¹⁵N,¹³C标记的样品，在¹⁵N间接演化期间对¹³C进行去耦。
    2. 设定¹H（F2）和¹⁵N（F1）维的采样点数和谱宽（ppm）。
       注：根据谱仪磁场强度调整采集数据点数，以保持每点相近的Hz数并限制去耦时间：在900 MHz时使用3,072点，在600 MHz时使用2,048点（¹H维）。
    3. 优化脉冲序列中的其他参数，包括延迟时间、脉冲长度、偏移频率和功率水平。在命令行中输入ased以显示与实验相关的所有参数。
14. 在600 MHz条件下，设置采集三维[¹H,¹⁵N,¹³C] HNCACB谱的参数（脉冲序列为hncacbgpwg3d，图10A）。
15. 在600 MHz条件下，设置三维[¹H,¹⁵N,¹⁵N] HNCANNH实验的参数（脉冲序列为hncannhgpwg3d）。将¹H维的采样点数设为2048，两个¹⁵N维分别设为64和128点。将谱宽分别定义为14、25、25 ppm，中心频率分别为4.7、119、119 ppm（对应¹H、¹⁵N和¹⁵N维）。使用16次扫描时，采集时长为1天22小时。

5. 磷酸化位点的鉴定

1. 使用核磁共振采集与处理软件对谱图进行处理。
   1. 对数据进行傅里叶变换（图7）。类型 英尺 对于一维谱 xfb 对于二维谱 ft3d 用于三维谱图，在命令行中。
   2. 相位校正并设定所有谱图的参考图7C) 使用交互式窗口。
2. 鉴定2D HSQC中可能对应于磷酸化Ser和Thr残基的共振信号图9，红色方框）。
3. 提取平面（即 二维 ¹H-¹³C 谱）来自 3D ¹H-¹⁵N-¹³C谱，使用 ¹⁵二维谱中目标共振峰的N化学位移。使用第二维（w2）的光标选择 ¹⁵对应于待观测平面（w1-w3）的 N 频率（图10B).
4. 选取“CA”和“CB”的共振频率 ¹³每个[i残基的‘i’和‘i-1’残基的C核（相对于i残基的信号较弱的一组信号）¹H, ¹⁵通过点击指针模式菜单中的共振峰，在“查找/添加峰”选项中将HNCACB三维谱中感兴趣的[N]共振峰化学位移值添加至峰列表文件中。
   1. 通过将峰列表中的化学位移值与已知的 pSer 和 pThr 的 CA 与 CB 化学位移值进行比较，确定 i 位点的残基类型是 pSer 还是 pThr¹⁷.
   2. 通过CA化学位移值特征性地额外偏移+2 ppm，判断在i+1位置是否存在Pro残基¹⁸.
   3. 将对应于第 i-1 个残基的 CA 和 CB 共振峰的化学位移值与预测的 Tau 氨基酸残基化学位移值表进行比较¹⁹ 确定 i-1 位点残基的性质。
5. 选择共振频率 ¹⁵每个[i]的'i'和'i-1'残基的N核¹H, ¹⁵N] HNCANNH 谱中感兴趣的共振峰
6. 比较 ¹⁵Tau蛋白的N化学偏移值与其化学偏移归属^20-23.
7. 将鉴定出的二肽与Tau蛋白序列进行比对，以确定序列特异性归属。

结果

图 3A 显示在洗脱梯度过程中于 280 nm 处观察到一个主要的吸收峰。该峰对应于色谱图上方聚丙烯酰胺凝胶中所见的纯化 Tau 蛋白。图 3B 显示在 280 nm 处出现一个分离良好的吸收峰以及电导率峰，表明蛋白脱盐效果良好。图 4 显示通过 SDS-PAGE 分析观察到的蛋白迁移率变化¹⁶，这是多种蛋白磷酸化的特征（比较泳道 2 和 3）。图 6 显示一系列质子（¹H）一维谱图，脉冲长度逐渐增加（单位为 µsec）。为了确定使 ¹H 自旋磁化矢量旋转 90° 的脉冲长度，实际操作中通常使用对应于 360° 旋转的脉冲，因为通过最小化信号更容易进行校准。当 360° 脉冲长度被准确设定时，水的质子信号将被完全抑制。将对应于 360° 旋转的数值除以 4 即可得到目标脉冲长度。本实验中 p1 为 10.5 µsec。放大区域：利用残余信号的频率来确定 o1p 参数（¹H 的频率偏移量）。图 7A 显示自由感应衰减（FID）...

讨论

我们已采用核磁共振（NMR）波谱技术对经酶学修饰的Tau蛋白样品进行表征。本文所述全长人源Tau蛋白的重组表达与纯化方法，同样可用于制备突变型Tau蛋白或Tau蛋白结构域。NMR波谱分析需要使用同位素标记的蛋白质，因此必须通过重组表达实现。磷酸化位点的鉴定需要完成共振峰归属，并使用¹⁵N和¹³C双标记的蛋白质。鉴于同位素试剂成本较高，重组表达步骤中需要获得较高的蛋白产量。在M9培养基中，葡萄糖是细菌生长的限制性因素，因此可将¹³C₆-葡萄糖的添加量提高至每升培养基4克，以提高产量。添加完全培养基和MEM维生素并非必需，但有助于促进细菌生长并提高产量。考虑到完全标记培养基价格昂贵，该产品仅用作培养基的补充成分。M9培养基中细菌生长较慢，通常情况下，添加3%完全培养基的M9培养体系在约4小时的培养后达到诱导时间。培养结束时通常可达到OD₆₀₀为1.6–1.8。每升细菌培养物中重组Tau蛋白的预期产量约为15 mg。使用可编程培养箱可方便地安排蛋白质生产流程，使细菌沉淀的收集及蛋白质生产的分析检测可在正常工作时间内完成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pET15B 重组 T7 表达质粒	Novagen	69257	-20℃保存 °C
BL21(DE3) 感受态细胞转化 E. coli 细菌	新英格兰生物实验室	C2527I	-80 保存 °C
高压灭菌的LB肉汤，Lennox	DIFCO	240210	细菌培养基
MEM维生素混合液（100倍浓缩）	Sigma	58970C	细菌培养基添加剂
15N, 13C-ISOGRO 完全培养基粉末	Sigma	608297	细菌培养基添加剂
15NH4Cl	Sigma	299251	同位素
13C6葡萄糖	Sigma	389374	同位素
蛋白酶抑制剂片剂	罗氏	5056489001	4℃保存 °C
1片溶于1 ml即为40倍浓缩液，可保存于-20℃ °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	-20℃保存 °C
均质机（EmulsiFlex-C3）	AVESTIN		裂解在4℃下进行 °C
皮尔斯™ 未染色蛋白质分子量标准品	皮尔斯	266109
活性人源MEK1激酶，GST标签	Sigma	M8822	-80 保存 °C
AKTÄ 纯化色谱系统	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF（5 ml 柱）	GE Healthcare	17-5156-01	阳离子交换层析柱
HiPrep 26/10 脱盐柱	GE Healthcare	17-5087-01	蛋白质脱盐柱
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	蛋白质脱盐柱
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	氘代核磁共振缓冲液
5 mm 对称微管 SHIGEMI D2O（内圈，5个装） &和外管）	Euriso-top	BMS-005B	核磁共振Shigemi管
eVol 套件——电子注射器入门套件	Cortecnet	2910000	移液
布鲁克900 MHz AvanceIII，配备三共振低温探头	布鲁克		用于数据采集的核磁共振波谱仪
布鲁克600 MHz Avance核磁共振波谱仪，配备三共振低温探头	布鲁克		用于数据采集的核磁共振波谱仪
TopSpin 3.1	布鲁克		核磁共振实验的数据采集与处理软件
Sparky 3.114	加州大学旧金山分校（T. D. Goddard 和 D. G. Kneller）		核磁共振数据分析软件