激光显微切割RNA测序实验设计:从玉米叶片发展的经验分析

摘要

许多发育上重要的基因具有细胞或组织特异性的表达模式。本文描述了 LM RNA-seq 实验，以鉴定与野生型相比在玉米叶片-鞘边界和 lg1-R 突变体中差异表达的基因。这里讨论的实验考虑适用于其他发育现象的转录组学分析。

摘要

在发展重要作用的基因往往有空间和/或时间限制的表达模式。通常这些基因转录物不被检测或作为整个植物器官的转录分析差异表达（DE）不识别。激光显微切割RNA测序（RNA LM-SEQ）是一个强大的工具，以确定被取消的具体发展领域的基因。然而，蜂窝结构域的选择microdissect和比较，以及microdissections的精度是该实验的成功至关重要。在这里，两个例子说明了转录实验设计考虑;个LM的RNA-SEQ分析，以确定沿着玉米叶近端-远端轴DE基因，和第二个实验，以确定是-R liguleless1（LG1-R） 的 DE中的基因 突变体与野生型。 ，对这些实验的成功作出贡献的关键因素进行了详细的组织学和SI该区域的涂杂交分析待分析，在相当于发育阶段叶原基的选择，使用形态的地标选择区域用于显微切割，并精确测量畴的显微解剖。本文提供了通过LM RNA测序发育域分析详细的协议。此处呈现的数据说明了如何选择用于显微切割的区域会影响获得的结果。

引言

玉米叶是研究形态发生过程发展领域的形成一个理想的模型，因为它具有在刀片和鞘是服从遗传解剖（ 图1A）之间有明显的边界。期间叶发育，较小的细胞的线性带的早期阶段，preligule带（PLB），细分叶原基成预刀片和预鞘域。刘海状叶舌和三角耳从PLB（ 图1A，C，D）制定。遗传筛选已经确定了破坏刀片鞘边界突变。例如，隐性liguleless1（LG1）突变删除叶舌和耳廓^{1，2，3，4（} 图1B）。 原位杂交透露，LG1成绩单积累的PLB和新兴叶舌，使其成为一个很好的标志物叶舌开发^5，6（ 图1E）。

方案

注意:在同一时间，组织被固定LM修复组织学分析的组织。检查形态特征，将引导后期LM染色切片。当比较突变体与野生型，执行原位杂交或免疫定位以限定的目的基因表达的结构域（在这种情况下，LG1）。

1.组织固定和处理

1. 种植玉米苗单位两周标准条件下^，6岁。
2. 解剖横向截面（ 图4）茎尖。
   1. 消费税只是育苗土壤线以下。
   2. 用刀片，从杆（削减1， 图4A）的底部除去薄片直到被一个或两个成熟叶片包围秆的椭圆是可见的（ 图4B）。
   3. 进行另一个切割约10mm基部上述（切割2， 图4A）。这10毫米段将包含SAM和年轻的叶原基。
   4. 转10mm的段，因此基本朝上。使平行于横向轴线两个切口，使得获得的组织2-3毫米厚的片（切口3和4中， 图4B）。丢弃外两部分，并保留中心切片进行固定并包埋。
      注:菜帮可能会被裁剪并丢弃。
3. 修复组织和流程嵌入。
   1. 确保在随后的步骤中使用的所有材料都是无RNA酶的。治疗与焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液（每升溶液1 DEPC。偶尔晃动，并且高压釜孵育过夜）。烘烤玻....

结果

使用图2所概述的LM方案中，约1,000,000-1,500,000微米²组织中收集的每个中的所有单元层LM复制（ 图5），200,000微米²每复制为近轴表皮LM。大约组织2,500,000微米²收集对每个在LG1-R和野生型叶原基的LM复制。两轮线性RNA扩增得到微克量的RNA的每个重复。从任何给定的显微解剖获得的RNA的量将依赖于细胞大小和转录活性以及所捕获的组织的量。 RNA的完整性会影响RNA扩增的效率。

成绩单积累在叶片，叶舌和护套地区的所有细胞层，共有2359根德的分析ES被发现，具有一个假发现率（FDR）<0.05（ 图6A）。具体地，1714基因叶舌和叶片之间分别DE，1044个基因DE叶舌和护套之间，和657个基因刀片和护套之间DE（一些基因D.......

讨论

实验设计是在RNA-SEQ实验的关键因素。主要问题是精确域和发育阶段（多个）进行分析，和什么比较将进行。这是认为在比较而言是至关重要的，因为输出是通常被两个或多个条件之间DE基因的列表。如同所有的实验中，在一个时间，以改变只有一个变量是重要的。例如，比较不同的叶域时，叶片的相同年龄和发育阶段，在同样的条件下生长，应比较。

这些实验的目的是，以确定是特异性上调或在野生型叶原基的叶舌区域下调的基因，并确定是DE在LG1-R的突变体与野生型的基因。我们首先研究开发叶原基的形态和LG1成绩单积累的格局。这些形态学和分子标瓦特ERE用来选择精确域为LM ^{14，15，16。}在第一个实验中，在叶舌区域转录积累与相同叶原基的其他区域，从而消除了由于生长条件，遗传背景，发育阶段，以及植物对植物变异差异。为了比较突变体与野生型，这是必要的，以确定感兴趣的基因被表达时。我们建议您通过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
焦碳酸二乙	Sigma-Aldrich	159220	用于溶液的RNase处理
剃须刀片	电子显微镜科学	72000
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020-250ML	RNase 去污溶液
乙醇绝对值 200 标准	费舍尔科学	BP28184
冰河	Sigma-Aldrich	A6283
玻璃样品瓶 - 22 ml	VWR	470206-384
二甲苯，组织学级	Sigma-Aldrich	534056-4L
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1KG
一次性底模，15 mm x 15 mm x 5 mm	VWR	15154-072
嵌入环	VWR	15154-303
硅胶包	电子显微镜科学	71206-01	用于储存石蜡块的干燥剂
烘箱	Fisher Scientific	15-103-0503	烤箱必须保持 60 ° 的温度;C
石蜡包埋站	Leica	EG1160
徕卡切片机		RM2235
载玻片加热器	电子显微镜科学	71317-10
科普林罐	电子显微镜科学	70316-02
激光显微切片	器 蔡司
KIMWIPES™Delicate Task 擦拭布	Kimberly-Clark Professional	34120	用于吸走显微镜载玻片上多余的溶液的无绒湿巾
膜载玻片 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000	激光显微切割载玻片
胶帽 200 不透明	Zeiss	415190-9181-000	激光显微切割管
PicoPure RNA 分离试剂盒	ThermoFisher Scientific	KIT0204