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方法文章

激光显微切割RNA测序的实验设计：来自玉米叶片发育分析的经验

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DOI：

10.3791/55004

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2017年3月5日

 ,  , 
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

本文内容

摘要

许多在发育过程中重要的基因具有细胞或组织特异性的表达模式。本文描述了通过激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-seq）实验，鉴定在玉米叶片叶片-叶鞘边界以及与野生型相比在lg1-R突变体中差异表达的基因。本文讨论的实验设计考虑因素同样适用于其他发育现象的转录组学分析。

摘要

在发育过程中发挥重要作用的基因通常具有空间和/或时间上受限的表达模式。在对整个植物器官进行转录组分析时，这些基因的转录本往往无法被检测到，或无法被识别为差异表达（DE）基因。激光显微切割RNA测序（LM RNA-Seq）是一种用于鉴定特定发育区域中差异表达基因的有力工具。然而，显微切割目标细胞区域的选择以及显微切割的准确性对实验的成功至关重要。本文通过两个实例说明转录组学实验的设计考量：一项是利用激光显微切割RNA测序分析玉米叶片近-远轴向沿程差异表达基因的鉴定；另一项实验旨在鉴定在特定发育区域中差异表达的基因 liguleless1-R (lg1-R) 与野生型相比，突变体表现出显著差异。这些实验成功的关键因素包括详细的组织学和 原位 待分析区域的杂交分析、选择处于相同发育阶段的叶原基、利用形态学标志物选择显微切割区域，以及对精确测量的区域进行显微切割。本文提供了一套利用激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-Seq）分析发育区域的详细实验方案。文中数据说明了显微切割所选区域将如何影响最终获得的实验结果。

引言

玉米叶片是研究形态发生过程中发育区域形成的理想模型，因其叶片与叶鞘之间具有明显的边界，适合进行遗传学分析。图1A）。在叶片发育的早期阶段，一条由较小细胞组成的线性区域，即叶舌前区带（preligule band, PLB），将叶原基划分为叶鞘前区和叶鞘前区两个区域。叶舌呈 fringe-like（ fringe 状）结构，而三角形的耳叶则由 PLB 发育而来。图1A, C, D）。遗传筛选已鉴定出破坏叶片-叶鞘边界的突变。例如，隐性突变 liguleless1 (lg1) 突变会缺失叶舌和叶耳1,2,3,4 (图1B). 原位 杂交结果显示 lg1 转录本在PLB和正在形成的叶舌处积累，使其成为叶舌发育的优良标记5,6 (图1E).

叶片结构的植物解剖图；图示包括叶片、叶耳、叶舌、叶鞘及组织切片。
图1：野生型与liguleless1-R玉米叶片。（A）成熟野生型叶片的叶鞘-叶片边界区域，显示叶舌和叶耳结构。（B）成熟liguleless1-R叶片的叶鞘-叶片边界区域，显示缺乏叶舌和叶耳结构。A和B中的叶片沿中脉被切成两半。（C）野生型叶原基的纵切面。样品已进行组织学分析的处理和染色。正在形成的叶舌表现为从叶平面突出的一个小突起（箭头所示）。（D）野生型叶原基的纵切面。样品按文中所述方法进行光学显微镜（LM）制样。箭头指示正在形成的叶舌。（E）茎尖侧向纵切面的lg1原位杂交。星号表示lg1转录本在P6叶原基PLB位置的积累。箭头指示P6原基的基部。标尺表示从原基基部到PLB的测量距离。A和B中的比例尺 = 20 mm。C-E中的比例尺 = 100 µm。本图改编自参考文献6（版权归属美国植物生物学家学会）。请点击此处查看此图的放大版本。

本研究采用激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-Seq）技术，以鉴定在叶原基的叶片-叶鞘边界区域相对于其他部位差异表达（DE）的一组基因，并鉴定在lg1-R突变体中相对于野生型同胞差异表达的基因。LM RNA-Seq是一种用于定量特定细胞或细胞区域中转录本积累水平的方法7。激光显微切割系统结合了激光、显微镜和数字相机。将切片组织固定于载玻片上，并通过显微镜观察。激光显微切割软件通常配备绘图工具，允许用户勾画出待显微切割的任意选定区域。激光沿所绘线条进行切割，目标组织被弹射脱离载玻片，落入悬于玻片上方的收集管中。该技术使研究者能够精确分离特定区域，包括特定的细胞层甚至单个细胞8,9。随后可从显微切割获得的组织中提取RNA。接着，RNA-Seq部分利用高通量测序技术对从提取RNA构建的cDNA文库进行测序10,11。

激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-seq）的主要优势在于能够对精确定义的组织区域中的转录本积累进行定量，并可同时分析整个转录组7。该技术特别适用于研究早期发育事件，因为在这些过程中感兴趣区域通常为微观尺度。以往的研究已将激光显微切割与微阵列技术相结合，用于分析植物中的发育过程9,12,13。RNA-Seq的优势在于可在宽动态范围内对转录本进行定量，包括低表达基因，且无需预先获得序列信息10,11。此外，LM RNA-Seq有望发现那些在诱变筛选中可能因基因冗余或功能缺失突变体致死而被遗漏的、在发育过程中具有重要作用的基因。

发育过程中重要的基因，例如 窄鞘1 (ns1）和 杯状子叶2 (cuc2), 通常具有一种或少数几种细胞的特异性表达模式17,18,19,20许多基因仅在早期发育阶段表达，而在成熟器官中不表达。当对整个器官或大范围区域进行分析时，这些细胞特异性转录本会被稀释，可能在更常规的分析中无法被检测到。通过允许对精确定义的区域进行分析，激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-Seq）能够识别并定量这些组织特异性基因。

实验成功的关键因素包括通过详尽的组织学分析来指导选择合适的发育阶段和分析区域，以及对细胞-组织区域进行精确测量以用于显微切割。为了确保所有重复样本均取自等效区域，组织均采集自相同发育阶段的叶原基，并且显微切割的区域相对于形态学标志（如正在形成的叶舌）进行测量（图2）。已知某些基因在叶片从顶端到底部的方向上呈梯度表达。通过精确测量特定区域，可将因沿叶片近-远轴不同位置取样所导致的变异降至最低（图3A）。通过显微切割相同大小的区域，也可减少因细胞特异性转录本稀释程度不同而引起的变异（图3B）。所有显微切割均使用茎尖的侧向纵切面进行，这些切面垂直于中脉-边缘轴（图4）。仅使用包含茎尖分生组织（SAM）的切面，可确保对叶原基的等效侧向区域进行分析。

在为光镜（LM）处理和切片的样品中，叶片舌外凸的首个形态学标志是近轴面出现一个隆起，这是由于近轴表皮细胞发生垂周分裂所致（图1D，图2）。研究确定，叶片舌在叶原基第7叶龄期（plastochron 7 stage）即可被可靠识别。我们关注在整片叶片舌区域表达的基因，包括正在形成的叶片舌及其远端即将发育成叶耳的细胞。为确保选取的组织区域具有一致性，以叶片舌隆起作为形态学标记，并在该隆起中心选取一个100 µm宽的矩形区域用于显微切割（图2A，图2B）。同时，从同一叶原基中选取等尺寸的叶鞘前体和叶 blade 前体矩形区域进行对照。

对无叶舌突变体植株的分析面临不同的挑战；lg1-R 突变体不形成叶舌，因此无法利用这一形态特征来选择激光显微切割（LM）的区域。取而代之的是，确定了lg1转录本在野生型叶原基中的表达区域，并据此定义了一个能够涵盖该表达区域的范围。这些初步分析所用的幼苗与最终分析所用的为同一批次种植的植株，因为先前的研究表明，叶原基分生组织（PLB）的位置会因生长条件的不同而发生变化。原位杂交结果显示，lg1转录本在P6叶原基的PLB中积累（图1E）。我们选取了从叶原基基部起400–900 µm的区域，该区域涵盖了lg1的表达范围（紫色矩形，图2A），并从野生型和lg1-R植株中捕获了相应的等效区域。为了在比较lg1-R与野生型植株中转录本积累时尽量减少遗传背景和生长条件的差异，实验采用了分离群体中的突变体及其野生型同胞植株。

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方案

注意：进行显微成像（LM）组织固定的同时，应取组织进行组织学分析的固定。对染色切片进行形态学特征观察，以指导后续的显微成像分析。在比较突变体与野生型时，需同时进行 原位 杂交或免疫定位以确定目的基因表达的区域（在本例中 lg1).

1. 组织固定与处理

  1. 在标准条件下培养玉米幼苗，使其生长至两周龄6。
  2. 分离茎尖以制备侧向切片（图4）。
    1. 在土壤线稍下方切除幼苗。
    2. 使用剃刀刀片从茎基部切下薄片（切口1，图4A），直至观察到被一至两片成熟叶片包围的椭圆形茎秆结构（图4B）。
    3. 在基部上方约10 mm处进行第二次切割（切口2，图4A）。该10 mm长的茎段应包含茎尖分生组织（SAM）及幼嫩叶原基。
    4. 将10 mm茎段翻转，使基部朝上。沿侧轴方向平行切割两次，获得厚度为2–3 mm的组织切片（切口3和4，图4B）。弃去外侧两部分，保留中央切片用于固定和包埋。
      注意：可修剪并弃去外层叶片。
  3. 固定组织并进行包埋前处理。
    1. 确保后续步骤中使用的所有材料均无RNase污染。用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理溶液（每升溶液加入1 ml DEPC，偶尔振荡，4 ℃孵育过夜，随后高压灭菌）。将玻璃器皿置于200 ℃或更高温度的烘箱中烘烤至少6小时，并用RNase去污染溶液处理塑料器皿。
    2. 第1天：将组织切片浸入盛有约10 ml Farmer固定液（乙醇:冰醋酸 = 3:1）的玻璃小瓶中，置于冰上。待所有样品解剖完成后，施加真空以去除气泡并促进固定液渗透，维持真空10分钟，然后缓慢释放。更换新鲜固定液，在4 ℃轻柔振荡条件下过夜孵育。
    3. 第2天：依次将组织转移至以下溶液中，每种溶液约10 ml，每步1小时，均在轻柔振荡条件下进行：4 ℃的85%乙醇、4 ℃的95%乙醇、4 ℃的100%乙醇、4 ℃的100%乙醇、4 ℃的100%乙醇、室温下的1:1乙醇:二甲苯混合液、室温下的100%二甲苯、室温下的100%二甲苯。
      注意：二甲苯可通过接触和吸入产生毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的手套。
    4. 向约半体积的二甲苯中加入石蜡组织包埋介质颗粒，在室温下轻柔振荡孵育过夜。
    5. 第3天：将小瓶转移至60 ℃烘箱，直至颗粒完全熔化。倒出溶液，更换为新鲜熔化的组织包埋介质。当天内再更换介质两次。
    6. 第4天：上午更换一次组织包埋介质。放回60 ℃烘箱，持续至下午。
  4. 制备包埋块
    1. 将包埋模具置于组织包埋仪的加热板上。用镊子将组织样本转移至模具中，使切面朝下。向模具中加满熔化的石蜡，并将包埋环置于模具上方。转移至冷台，直至石蜡完全凝固。将石蜡块储存于4 ℃、含硅胶的密封容器中。

2. 切片与载玻片制备

  1. 使用切片机切取 10 µm 的切片25。
  2. 检查切片带并选择中位切片。中位切片是指包含分生组织（SAM）的切片，SAM 在显微镜下呈现为被叶原基包围的细胞圆顶结构。
  3. 将切片贴附到载玻片上。
    1. 将适用于光学显微镜（LM）观察的载玻片（无 RNase 处理或经烘烤处理）置于 42 °C 的载玻片加热台上，并滴加数滴 50% 乙醇溶液以覆盖整个载玻片表面。
    2. 将切片漂浮于乙醇溶液中，直至切片完全展开。
      注意：使用乙醇溶液而非水进行漂浮，可使 RNA 保持沉淀状态，从而减少 RNA 降解。
    3. 倾斜载玻片，用一次性移液管吸除多余的乙醇溶液，并用无绒擦拭布吸走残留液体。
    4. 在 42 °C 下干燥载玻片数小时或过夜。将干燥后的载玻片存放在含硅胶的密闭容器中，于 4 °C 保存。
  4. 在使用当天进行脱蜡处理。
    1. 准备三个玻璃染色缸，分别装入 100% 二甲苯（二甲苯 I）、100% 二甲苯（二甲苯 II）和 100% 乙醇（每种溶液约 50 ml）。
    2. 用洁净镊子夹取载玻片，依次浸入二甲苯 I 中 2 分钟、二甲苯 II 中 2 分钟，再浸入 100% 乙醇中 1 分钟。
    3. 将载玻片取出后置于无绒擦拭布上沥干，并在室温下自然晾干。

3. 从第7叶原基的叶尖、叶舌和叶鞘样品中进行显微解剖

  1. 将切片固定在光学显微镜载物台上。每次重复实验使用五到六张切片，每张切片使用五个切片区域。
    注：单次重复的组织 pooling 示意图见图5。
  2. 观察切片，以 SAM 顶端为中央参考点，在每张切片中确定最接近中位的五个切片区域。
    注：此步骤可在低倍镜下完成，通常使用 5X 物镜即可。
  3. 使用 10X 或 20X 物镜，在每个切片的 plastochron 7 叶原基上定位叶舌的位置。叶舌在叶原基近轴面表现为一个突出的隆起。使用光学显微镜软件的绘图工具标记该位置：选择铅笔图标，将光标移至适当位置，点击并拖动鼠标进行绘制。
    注：此步骤及后续步骤均适用 10X 或 20X 物镜。当使用侧向切片时，每个叶原基的两侧均会出现在同一张切片中（图2A）。
  4. 使用标尺工具和矩形绘图工具，以每个切片的叶舌为中心，测量 100 µm 高的矩形区域（红色矩形，图2A、图2B）。这些区域将作为"叶舌"样本。
    1. 使用标尺工具时，选择标尺图标，将光标移至待测物体的一端，点击并拖动以测量物体长度，标尺的长度将显示在屏幕上。
    2. 绘制矩形时，选择矩形图标，将光标移至矩形的一个角点位置，点击并拖动以绘制适当大小的矩形。或者，选择直线绘图工具，绘制四条直线构成矩形。
    3. 在"叶舌"矩形上下方各 50 µm 处，测量 100 µm 高的矩形区域。
      注：这些区域将分别作为"叶片"和"叶鞘"样本（绿色和蓝色矩形，图2A、图2B）。根据我们的组织学数据，100 µm 的矩形区域可完整涵盖整个叶舌区域。选择相同尺寸的叶片和叶鞘区域是为了确保各部分收集的组织量相近。设置 50 µm 的间隔区域，以避免在叶片或叶鞘的显微切割过程中无意中包含叶舌区域的组织。
  5. 对已测量的矩形区域进行显微切割（图2D–图2F）7,8,9，将叶舌、叶片和叶鞘样本分别收集至不同的管中。使用激光切割功能，沿所选区域的轮廓切割组织切片；使用弹射功能将组织矩形从切片上弹出，并射入收集管的管盖中（图2D–图2F）。

4. 从叶原基第7个叶龄期分离叶片、叶舌和叶鞘近轴表皮样品的显微解剖

  1. 选择相应区域，并使用标尺工具测量以叶原基第7叶舌为中心的100 µm高区段，具体方法见第3节（上文）。
    1. 使用绘图工具勾画出每个100 µm高"叶片"和"叶鞘"区段（绿色和蓝色选区，图2C）的近轴表皮细胞。表皮为最外层细胞层，近轴面指靠近茎尖分生组织的一侧。
    2. 对于"叶舌"样本，仅选择正在形成的叶舌隆起部分的细胞，具体方法见第3.3节（红色选区，图2C）。
  2. 显微解剖所选区域，将叶片、叶舌和叶鞘的表皮样本分别收集至不同的离心管中，具体操作见第3.5节。

5. 从 lg1-R 及野生型同胞中显微分离第6个叶原基

  1. 培育突变体（的分离群体家族lg1-R）以及野生型植株。
  2. 固定并处理茎尖以用于LM，具体步骤如1.2–1.4节所述。将野生型和突变体茎尖分别置于不同的小瓶中固定，以保持分离。同一播种批次的样品应同时固定并进行后续处理 原位 杂交。
  3. 确定位置 lg1 在野生型同胞中通过执行转录 原位 lg1 杂交6,26,27. 测量位置 lg1 从多个样本的叶原基基部开始的转录本积累图1E).
  4. 根据 原位 杂交数据，选择包含叶原基中该区域的部分 lg1 被转录。在此情况下，取自叶原基第6个叶序基部400-900 µm处（紫色矩形， 图2A).
  5. 显微解剖叶原基的选定部分，具体操作如第3.5节所述，进行收集 lg1-R 将野生型样品分别置于不同的试管中。

6. 加入RNA提取缓冲液

  1. 向显微切割的组织中加入50 µl RNA提取缓冲液，并按照参考文献6中所述方法继续进行RNA提取、RNA扩增、文库构建、测序及生物信息学分析。

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结果

根据图2中所述的激光显微切割（LM）方案，全细胞层LM（图5）每个重复收集约1,000,000–1,500,000 µm2的组织，而近轴表皮层LM每个重复收集200,000 µm2组织。lg1-R突变体和野生型叶原基的LM样本中，每个重复收集约2,500,000 µm2组织。经过两轮线性RNA扩增，每个重复可获得微克级的RNA。从特定显微切割样本中获得的RNA量取决于细胞大小、转录活性以及捕获组织的量。RNA的完整性将影响RNA扩增的效率。

在叶片、叶舌和叶鞘区域的所有细胞层中分析了转录本的积累情况，共发现2,359个差异表达基因（FDR < 0.05）（图6A）。其中，叶舌与叶片之间有1,714个差异表达基因，叶舌与叶鞘之间有1,044个差异表达基因，叶片与叶鞘之间有...

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讨论

实验设计是RNA-seq实验中的关键因素。需要重点考虑待分析的特定区域和发育阶段，以及将进行哪些比较。必须以比较的思路进行设计，因为实验结果通常是两个或多个条件下差异表达的基因列表。与所有实验一样，每次实验应仅改变一个变量。例如，在比较不同叶片区域时，应选择在相同生长条件下、相同年龄和相同发育阶段的叶片进行比较。

这些实验的目的是鉴定在野生型叶原基的叶舌区域特异性上调或下调的基因，并鉴定在该区域差异表达的基因 lg1-R 与野生型相比的突变体。我们首先研究了发育中叶原基的形态及模式 lg1 转录本积累。这些形态学和分子标记被用于选择激光显微切割（LM）的精确区域14,15,16在第一个实验中，将叶舌区域的转录本积累情况与同一叶原基的其他区域进行比较，从而消除了因生长条件、遗传背景、发育阶段以及植株间差异所导致的差异。为了比较突变体与野生型，有必要确定目标基因的表...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 S. Hake 在叶舌发育方面的持续合作和富有启发性的讨论。本研究由美国国家科学基金会资助，项目编号为 MCB 1052051 和 IOS-1848478。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
焦碳酸二乙酯Sigma-Aldrich159220用于溶液的RNase处理
剃刀刀片 Electron Microscopy Sciences72000
RNA酶清除剂RNase ZapSigma-AldrichR2020-250MLRNase去污染溶液
无水乙醇（200 proof）Fisher ScientificBP28184
冰醋酸Sigma-AldrichA6283
玻璃小瓶 - 22 mlVWR470206-384
二甲苯，组织学级Sigma-Aldrich534056-4L
Paraplast Plus石蜡Sigma-AldrichP3683-1KG
一次性包埋底模，15 mm × 15 mm × 5 mmVWR15154-072
包埋环VWR15154-303
硅胶干燥剂小包Electron Microscopy Sciences71206-01用于石蜡块储存的干燥剂
烘箱Fisher Scientific15-103-0503烘箱必须维持60 °C的温度
石蜡包埋工作站Leica EG1160
切片机Leica RM2235
载玻片烘片台Electron Microscopy Sciences71317-10
柯林瓶（Coplin jars）Electron Microscopy Sciences70316-02
激光显微切割系统Zeiss
KIMWIPES™ 精细任务擦拭纸Kimberly-Clark Professional34120无绒擦拭纸，用于吸除载玻片上多余的溶液
膜片1.0 PENZeiss415190-9041-000用于激光显微切割的载玻片
不透明粘附帽200Zeiss415190-9181-000用于激光显微切割的收集管
PicoPure RNA 提取试剂盒ThermoFisher ScientificKIT0204

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