许多在发育过程中重要的基因具有细胞或组织特异性的表达模式。本文描述了通过激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-seq）实验，鉴定在玉米叶片叶片-叶鞘边界以及与野生型相比在lg1-R突变体中差异表达的基因。本文讨论的实验设计考虑因素同样适用于其他发育现象的转录组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
在发育过程中发挥重要作用的基因通常具有空间和/或时间上受限的表达模式。在对整个植物器官进行转录组分析时，这些基因的转录本往往无法被检测到，或无法被识别为差异表达（DE）基因。激光显微切割RNA测序（LM RNA-Seq）是一种用于鉴定特定发育区域中差异表达基因的有力工具。然而，显微切割目标细胞区域的选择以及显微切割的准确性对实验的成功至关重要。本文通过两个实例说明转录组学实验的设计考量：一项是利用激光显微切割RNA测序分析玉米叶片近-远轴向沿程差异表达基因的鉴定；另一项实验旨在鉴定在特定发育区域中差异表达的基因 liguleless1-R (lg1-R) 与野生型相比，突变体表现出显著差异。这些实验成功的关键因素包括详细的组织学和 原位 待分析区域的杂交分析、选择处于相同发育阶段的叶原基、利用形态学标志物选择显微切割区域，以及对精确测量的区域进行显微切割。本文提供了一套利用激光显微切割结合RNA测序（LM RNA-Seq）分析发育区域的详细实验方案。文中数据说明了显微切割所选区域将如何影响最终获得的实验结果。
引言
玉米叶片是研究形态发生过程中发育区域形成的理想模型，因其叶片与叶鞘之间具有明显的边界，适合进行遗传学分析。图1A）。在叶片发育的早期阶段，一条由较小细胞组成的线性区域，即叶舌前区带（preligule band, PLB），将叶原基划分为叶鞘前区和叶鞘前区两个区域。叶舌呈 fringe-like（ fringe 状）结构，而三角形的耳叶则由 PLB 发育而来。图1A, C, D）。遗传筛选已鉴定出破坏叶片-叶鞘边界的突变。例如，隐性突变 liguleless1 (lg1) 突变会缺失叶舌和叶耳1,2,3,4 (图1B). 原位 杂交结果显示 lg1 转录本在PLB和正在形成的叶舌处积累，使其成为叶舌发育的优良标记5,6 (图1E).
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方案
注意：进行显微成像（LM）组织固定的同时，应取组织进行组织学分析的固定。对染色切片进行形态学特征观察，以指导后续的显微成像分析。在比较突变体与野生型时，需同时进行 原位 杂交或免疫定位以确定目的基因表达的区域（在本例中 lg1).
1. 组织固定与处理
- 在标准条件下培养玉米幼苗，使其生长至两周龄6。
- 分离茎尖以制备侧向切片（图4）。
- 在土壤线稍下方切除幼苗。
- 使用剃刀刀片从茎基部切下薄片（切口1，图4A），直至观察到被一至两片成熟叶片包围的椭圆形茎秆结构（图4B）。
- 在基部上方约10 mm处进行第二次切割（切口2，图4A）。该10 mm长的茎段应包含茎尖分生组织（SAM）及幼嫩叶原基。
- 将10 mm茎段翻转，使基部朝上。沿侧轴方向平行切割两次，获得厚度为2–3 mm的组织切片（切口3和4，图4B）。弃去外侧两部分，保留中央切片用于固定和包埋。
注意：可修剪并弃去外层叶片。
- 固定组织并进行包埋前处理。
- 确保后续....
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结果
根据图2所示的激光显微切割（LM）方案，全细胞层LM（图5）每个重复收集约1,000,000–1,500,000 µm2的组织，而近轴表皮层LM每个重复收集200,000 µm2组织。lg1-R突变体与野生型叶原基的LM中，每个重复收集的组织量约为2,500,000 µm2。经过两轮线性RNA扩增，每个重复可获得微克级的RNA。从任意一次显微切割所获得的RNA量取决于细胞大小、转录活性以及捕获组织的总量。RNA的完整性将影响RNA扩增的效率。
在叶片、叶舌和叶鞘区域的所有细胞层中分析了转录本的积累情况，共发现2,359个差异表达基因（DE基因），错误发现率（FDR）<0.05（图6A）。其中，叶舌与叶片之间有1,714个基因差异表达，叶舌与叶鞘之间有1,044个基.......
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讨论
实验设计是RNA-seq实验中的关键因素。需要重点考虑待分析的特定区域和发育阶段，以及将进行哪些比较。必须以比较的思路进行设计，因为实验结果通常是两个或多个条件下差异表达的基因列表。与所有实验一样，每次实验应仅改变一个变量。例如，在比较不同叶片区域时，应选择在相同生长条件下、相同年龄和相同发育阶段的叶片进行比较。
这些实验的目的是鉴定在野生型叶原基的叶舌区域特异性上调或下调的基因，并鉴定在该区域差异表达的基因 lg1-R 与野生型相比的突变体。我们首先研究了发育中叶原基的形态及模式 lg1 转录本积累。这些形态学和分子标记被用于选择激光显微切割（LM）的精确区域14,15,16在第一个实验中，将叶舌区域的转录本积累情况与同一叶原基的其他区域进行比较，从而消除了因生长条件、遗传背景、发育阶段以及植株间差异所导致的差异。为了比较突变体与野生型，有必要确定目标基因的表.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 S. Hake 在叶舌发育方面的持续合作和富有启发性的讨论。本研究由美国国家科学基金会资助，项目编号为 MCB 1052051 和 IOS-1848478。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | 159220 | 用于溶液的RNase处理 |
| 剃刀刀片 | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNA酶清除剂RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase去污染溶液 |
| 无水乙醇（200 proof） | Fisher Scientific | BP28184 | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 玻璃小瓶 - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| 二甲苯，组织学级 | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast Plus石蜡 | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| 一次性包埋底模，15 mm × 15 mm × 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| 包埋环 | VWR | 15154-303 | |
| 硅胶干燥剂小包 | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | 用于石蜡块储存的干燥剂 |
| 烘箱 | Fisher Scientific | 15-103-0503 | 烘箱必须维持60 °C的温度 |
| 石蜡包埋工作站 | Leica | EG1160 | |
| 切片机 | Leica | RM2235 | |
| 载玻片烘片台 | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| 柯林瓶（Coplin jars） | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| 激光显微切割系统 | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ 精细任务擦拭纸 | Kimberly-Clark Professional | 34120 | 无绒擦拭纸，用于吸除载玻片上多余的溶液 |
| 膜片1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | 用于激光显微切割的载玻片 |
| 不透明粘附帽200 | Zeiss | 415190-9181-000 | 用于激光显微切割的收集管 |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
参考文献
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation....
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重印与许可
