大鼠策略集转换任务的新变式

摘要

转换任务（set-shifting）是一种行为灵活性的形式，需要将注意力从一个刺激维度转移到另一个刺激维度。我们通过根据情境要求关注不同刺激，扩展了一种已建立的啮齿类动物转换任务¹。该任务结合特定的脑损伤模型，以鉴定介导成功转换的神经元亚型。

摘要

在不断变化的环境中，行为灵活性对生存至关重要。广义而言，行为灵活性要求个体根据规则的变化而转换行为策略。本文描述了一种策略集合转移任务，该任务要求将注意力从一个刺激维度转移到另一个刺激维度。这一范式常用于灵长类动物认知灵活性的测试，然而其在啮齿类动物中的应用尚未得到充分发展。我们近期在大鼠中改进了一种已建立的集合转移任务¹，通过要求动物根据情境关注不同的刺激来进行实验。所有实验条件均要求动物在左侧或右侧杠杆中进行选择。最初，所有动物需根据杠杆的位置进行选择；随后规则发生变化，要求动物将策略从基于位置的规则转变为基于光线索指示正确杠杆的新规则。我们比较了动物在三种不同任务版本中的表现，其中光刺激分别为新颖刺激、先前相关刺激或先前无关刺激。研究发现，特定的神经化学损伤会选择性地损害动物在不同类型集合转移中的能力，该结果通过动物在不同任务版本中的表现得以量化。

引言

在不断变化的环境中，行为灵活性是生存的关键要求之一。测试这种能力的成熟行为范式之一是范畴转换（set-shifting），即当规则发生变化后，个体必须将注意力从一个刺激维度转移到另一个维度，以调整其行为策略。多个脑区，如前额叶皮层和纹状体，已被证实参与范畴转换过程^2,3,4,5。该功能的神经机制已在包括人类⁵、猴子⁶和大鼠^1,7,8,9在内的多个物种中得到研究。然而，适用于大鼠的范畴转换任务范式尚未得到充分发展。鉴于大鼠具有成本效益高、适合立体定位手术的体型，以及近年来遗传学方法的不断进步¹⁰，进一步开发适用于大鼠的范畴转换行为范式具有重要意义。

大鼠典型的策略转换范式要求在两种行为策略之间进行转换：例如，反应策略和视觉线索策略。大鼠最初必须在两个可选选项中选择其一（例如，在操作箱自动化版本中选择左侧或右侧杠杆¹，或在T型迷宫版本中选择左侧或右侧臂^7,8,9,11）。在策略转换后，它们必须转而采用视觉线索策略，例如根据灯光线索判断正确的一侧。在这些传统的策略转换任务中，动物需要将注意力从一个刺激维度转移到此前无关的另一个维度上。

除了转换到此前无关的维度外，还存在一种逻辑上的可能性，即某个刺激此前是相关的，或此前不存在而现在是新出现的。自然界中的实际情况可能需要关注新出现的刺激，或历史上相关但并非关键的线索。因此，我们在先前建立的自动化设定转移任务的基础上，设计了一种新的啮齿类动物设定转移实验变式，以考察这些设定转移的亚型¹。

我们最近在一项实验中展示了新版任务转换范式的应用，以确定纹状体神经化学特异性损伤的影响¹²。在之前的研究中，我们靶向了背内侧或腹侧纹状体中释放乙酰胆碱（ACh）的胆碱能中间神经元，因为ACh及这些亚区已被证实与行为灵活性相关。所有实验条件均要求相同的策略性转换，但各自涉及不同类型的注意力转移：转向新异的、先前相关或先前无关的线索。本文详细描述了这些范式的方法，并重点展示了代表性结果，提示纹状体胆碱能系统在任务转换中发挥着基础性作用，且该作用在不同纹状体亚区之间可分离，并依赖于具体的行为情境¹²。

方案

所有动物实验程序均经冲绳科学技术大学院大学动物护理与使用委员会批准。

1. 动物

1. 获取雄性Long-Evans大鼠（到货时体重250-300 g）。
2. 到达后，将两只或三只大鼠共同饲养一周，随后将其分至单独的笼具中单独饲养。需要注意的是，本实验设计涉及食物限制，需将每只动物单独饲养在各自的笼具中，以控制其摄食量。
3. 为所有动物提供食物和水 随意摄取，并在标准条件下饲养（12小时光照/12小时黑暗循环，23 °C）。
4. 行为实验开始前5天，将动物的食物摄入量限制至其平均体重的约85%，实验期间自由饮水。
5. 实验开始前至少5天，每天对动物进行5分钟的抓握操作，使其熟悉实验人员。

2. 行为测试与分析的硬件和软件

1. 硬件
   1. 使用配备有隔音箱的自主操作实验箱。
   2. 实验箱包含多个附加组件：前面板上有两个 receptacle 杠杆，杠杆上方各有一个灯光提示信号，两个杠杆之间设有一个带传感器的食盒区域，用于检测动物头部进入；此外还包括一个食物分发器、一个纯音发生器以及后板上的笼灯。
2. 软件
   1. 通过 Trans IV 软件编写的程序代码控制所有行为事件。在训练和测试期间，使用 Med-PC IV 软件来发送信号并检测所有行为事件。
   2. 使用 Trans IV 编写行为测试的程序代码。打开一个新文件进行编写。
   3. 程序编写完成后，在软件内进行翻译和编译。若发现错误，则修改代码并重新尝试。
   4. 程序成功调试后，在正式开始实验前进行试运行，以检查用户代码是否正常工作。
   5. 使用 MED-PC IV 运行行为实验。打开软件，点击 "open session"，并为每个实验箱分配一个独立的程序。
   6. 当所有程序均已正确分配至各个实验箱后，发送启动实验所需的信号。
   7. 任务完成后，点击 "Save Data" 保存数据，或编写代码实现数据的自动保存（具体操作详见 MED-PC IV 程序员手册）。
   8. 数据导出至指定文件夹后，将其重命名为“获取日期_动物编号”格式，以便后续使用。收集到的数据将导入 Matlab 中，用于下文所述的行为分析（方案，3.7）。

3. 行为训练与测试

1. 习惯化与食管训练。
   1. 在这些阶段不要向动物提供杠杆。
   2. 在适应阶段，每天将动物放入操作箱中20分钟。同一天，在动物的饲养笼内给予10粒蔗糖颗粒（45 mg），使其熟悉蔗糖奖励。
   3. 接下来，开始食丸盒训练。将动物放入实验箱中，给予20粒蔗糖食丸（每分钟1粒），使其学习食物托盘的位置并获取食丸。
      注意：尽管我们采用了这些阶段以使动物熟悉实验箱并从食盘中进食，但这些阶段可能会因动物在无需操作反应的情况下即可获得食丸而产生混淆，因此可以跳过。
2. 连续强化时间表
   1. 在连续强化训练中，通过按压杠杆使动物获得奖励。每次训练持续至动物获得60粒食丸（即完成60次按压）或达到40分钟为止。
   2. 在每次实验的前半段（直到获得30粒食丸为止）呈现左侧或右侧杠杆中的一个，后半段则呈现另一个相反的杠杆。每日交替呈现顺序。
   3. 继续此强化程序，直至动物连续两天至少成功获得60次奖励。需注意，不同动物首次按压杠杆所需时间可能存在较大个体差异，这可能影响强化训练的进展。若在首日训练中动物无任何反应，可在呈现的杠杆上放置少量蔗糖颗粒，以促使动物接近杠杆。
      注意：一种可能的替代方法是在首次向动物呈现杠杆时给予蔗糖颗粒，以加快该阶段的完成速度。
3. 杠杆按压训练与测试实验的时间安排
   1. 开始单次试验，使用持续3秒（s）的音调。
   2. 在声音刺激结束2秒后，呈现两个杠杆，允许动物在10秒内按压任一杠杆。若动物在10秒内未作出反应，则收回两个杠杆，并将该次试验记为遗漏试验。
   3. 在进行压杆训练时，仅在任意一侧呈现一个压杆。
   4. 在大多数实验条件下，其中一个杠杆上方会有一个光刺激。在声音停止后立即开启光提示，并在动物做出反应后关闭；若动物未做出反应，则在杠杆插入后10秒关闭光提示。
   5. 将试次间隔设为20~30秒。
4. 杠杆按压训练
   1. 在训练阶段，不向动物呈现任何光刺激。
   2. 让动物在杠杆按压训练下进行5至8次训练，每次训练的时间安排与下文所述测试阶段的试验时间表相同。
   3. 在此训练中，随机呈现左侧或右侧杠杆，动物需在杠杆出现后10秒内按压，否则该次试验记为无应答遗漏。每次按压杠杆训练会话包含80次试验。
   4. 当动物在80次试验中的遗漏次数少于10%时，将其转入下一侧向偏倚测试。
5. 侧向偏好测试
   1. 进行侧偏测试以确定动物对左侧或右侧杠杆的偏好¹一次试验包括在两侧各进行一次杠杆按压。
   2. 将动物放入操作性条件反射箱中，使其可选择任意一个杠杆。在下一次尝试中，动物必须选择相反一侧的杠杆才能获得奖励。如果动物第二次按压与第一次相同侧的杠杆，则不给予奖励，并继续该次试验，直至动物在相反侧做出反应。
   3. 共进行7次试验以确定动物的侧向偏好。
6. 测试。
   1. 每日训练包含80次试验。
   2. 准备如图所示的三种不同条件用于集合转移实验程序 图1.
   3. 所有三种条件均要求动物以相似方式改变行为策略，即从选择始终位于同一侧的杠杆（第一阶段，反应策略）转变为根据指示正确一侧的光线索进行选择（第二阶段，视觉线索策略）。
   4. 从初始学习反应策略阶段（第1阶段）开始，共进行4个训练 session，期间动物需根据杠杆的位置按压相应的杠杆。在此阶段中，根据上述初步侧向偏好测试的结果，将正确的一侧设定为与动物偏好相反的杠杆侧。
   5. 接下来，进行10个阶段的视觉线索学习（第2阶段）。任一杠杆上方的灯光提示表示正确的杠杆。在此转换阶段，可在三种实验条件下比较三种不同的注意力转移模式，如下所述（3.3.6–3.3.8）。
   6. 在转换任务条件1中（图1A），在第一阶段不提供光线，但在第二阶段通过光线索指示正确的一侧。因此，在条件1中，动物需要关注新的刺激。
   7. 在转换条件2中（图1B），在第1阶段和第2阶段均在正确的杠杆上方呈现光线索。在此条件下，光线索在第1阶段具有相关性，但并非做出选择所必需。因此，动物必须关注先前具有相关性的线索。
   8. 在转换条件3中图1C），在第1阶段随机在左侧或右侧杠杆上方开启光线索，因此该线索必须被忽略。在第2阶段，动物需要关注此前无关的光刺激。
7. 行为学分析。
   1. 在整个实验过程中，每天测量正确反应的百分比，排除遗漏试验。
   2. 统计视觉线索学习10个阶段中累积的错误，并根据先前研究中的定义将其分类为持续性错误、回归性错误或从未强化的错误¹在那里，对错误类型进行的详细分析提示了在任务转换中存在不同的功能。
   3. 将反复性错误定义为动物表现仍低于偶然水平时，对先前正确杠杆作出的错误反应^4,6,13,14,15. 类似的标准已在先前的研究中使用^1,3,7,11.
   4. 基于一种有原则的方法，确定将重复性错误与回归性错误区分开的标准：在连续10次试验的滑动窗口中，当动物首次出现10次错误反应中少于8次错误（即产生8次或以上错误的概率为0.054，依据累积二项分布）时，以此作为分界点。
   5. 为了找到该点，从第1次试验开始，计算一个包含10次试验的滑动平均窗口^st 试验一次，然后逐次推进一个试验，直到 <测量了8/10次错误。在视觉线索策略中，针对所有在先前错误杠杆上方点亮提示光的试验进行此项分析。
   6. 将从此处之后发生的所有后续错误定义为回退错误。
   7. 在视觉线索学习过程中，当动物对先前不正确且未被灯光提示照亮的杠杆作出反应时，记录未被强化的错误次数。根据学习阶段将其分为早期和晚期两部分；前10个会话中前半段（第1-5会话）发生的错误视为早期错误，后半段（第6-10会话）发生的错误视为晚期错误。

结果

我们采用上述的策略转换任务来研究胆碱能中间神经元在行为灵活性中的作用。我们比较了免疫毒素诱导的背内侧纹状体（DMS）、腹侧纹状体（VS）胆碱能中间神经元选择性损毁以及生理盐水注射对照组对任务表现的影响。所有动物均需从根据杠杆位置（左侧或右侧）进行选择，转变为根据正确杠杆上方的提示灯进行选择。我们设置了三种实验条件下的任务转换，其中提示灯分别为：（1）新异刺激，（2）先前相关刺激（指示正确杠杆），或（3）先前无关刺激（随机分配）。

在这三种实验条件下，所有处理组在初始阶段均成功获得了反应策略，表明纹状体中胆碱能神经元的缺失对初始学习没有影响（图 2A–2C）。这些结果与以往研究一致，表明使背内侧纹状体（DMS）或腹侧纹状体（VS）失活不会影响初始辨别能力^7,9，且系统性给予胆碱能拮抗剂¹⁶...

讨论

我们开发了用于大鼠的既定转换任务范式的新型变体。利用这些范式，发现纹状体的胆碱能损伤会损害任务转换能力，提示纹状体胆碱能中间神经元在任务转换中具有特定作用：抑制旧规则并促进对新规则的探索。这种效应在背内侧纹状体与腹侧纹状体之间有所不同，这与这些结构在学习中的不同功能相一致。

转换任务（set-shifting task）已被广泛用于测试从人类到啮齿类动物等多种物种的行为灵活性^{1,4,5,7,8,9,12}。术语“"set"”被定义为在特定试验中与行为相关的刺激属性²⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标准模块化测试箱	Med Associates	ENV-008
低剖面可伸缩反应杠杆	Med Associates	ENV-112CM
大鼠用刺激光源	Med Associates	ENV-221M
可切换双颗粒/液体给药受体口（适用于大鼠）	Med Associates	ENV-202RM-S
大鼠受体口头部进入检测器	Med Associates	ENV-254-CB
模块化颗粒分配器；45 mg（适用于大鼠）	Med Associates	ENV-203M-45
大鼠用Sonalert模块	Med Associates	ENV-223AM	可提供4.5 kHz（ENV-223HAM）
大鼠实验箱用室内灯	Med Associates	ENV-215M
SmartCtrl接口模块，8输入/16输出	Med Associates	DIG-716B
SmartCtrl连接面板，8输入/16输出	Med Associates	SG-716B
45 mg片剂-水果味	TestDiet	1811255	提供多种口味