体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

摘要

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法⁺ T细胞 体外不同的FOXP3诱导方案可用于研究各自方案所获得的特定iTreg表型。

摘要

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，能够抑制针对自身结构的免疫反应，从而预防自身免疫性疾病。目前正在进行通过过继性转移Tregs治疗疾病，或在癌症中耗竭Tregs的临床研究，初步结果令人鼓舞。

由于天然调节性T细胞（nTregs）的数量非常有限，利用天然调节性T细胞研究某些调节性T细胞特征存在困难 体外 诱导性调节性T细胞（iTregs）具有重要优势。迄今为止，尽管并非绝对特异，但最常用于界定调节性T细胞（Tregs）的蛋白标志物是转录因子FOXP3。尽管Tregs具有重要作用，包括外周诱导性Tregs的非冗余功能，但目前生成iTregs的实验方案仍存在争议，尤其是在人类细胞中。因此，本方案描述了 体外 利用多种调节性T细胞诱导因子（仅TGF-β加IL-2，或其与视黄酸、雷帕霉素或丁酸盐的组合）平行诱导人初始T细胞分化为CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞。同时描述了通过流式细胞术和定量反转录PCR对这些细胞进行表型分析的方法。

这些方案可实现FOXP3及其他调节性T细胞特征基因的可重复表达，有助于研究FOXP3的一般调控机制以及特定方案的影响，从而明确某些因素的作用。诱导型调节性T细胞（iTregs）可用于研究调节性T细胞诱导过程中的多种表型特征及分子机制。由于能够获得相对大量的细胞，因此有利于开展深入的分子水平研究。

iTreg细胞在应用上的一个局限性在于，与nTreg细胞相比，其FOXP3的表达相对不稳定。通过本方案生成的iTreg细胞也可用于功能检测，例如研究其抑制功能，其中由TGF-β联合视黄酸和雷帕霉素诱导产生的iTreg细胞表现出更强的抑制活性。然而，iTreg细胞的抑制能力可能与nTreg细胞存在差异，因此使用适当的对照至关重要。

引言

CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞（Tregs）能够抑制其他免疫细胞，是外周免疫耐受的关键介导者，可防止自身免疫和过度炎症反应¹。Tregs的重要性体现在人类疾病——免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征（IPEX）中，该病由于调控Treg发育的“主控”转录因子叉头框P3（forkhead box P3, FOXP3）发生突变，导致Tregs缺失，从而引发严重的全身性自身免疫病，并在幼年即致死。然而，Tregs在免疫系统中具有双重作用，在某些情况下也可能削弱抗肿瘤免疫²。因此，对Treg数量和功能的治疗性调控正成为多项临床研究的焦点。在癌症治疗中，清除Tregs可能是有益的，已有部分临床策略取得成功，推动了进一步研究³。在自身免疫性和炎症性疾病中，除了Tregs在多种小鼠疾病模型中展现出的治疗效果外，近期开展的首批人体试验也显示出非常有希望的结果：包括采用过继性Treg输注预防移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）^4-7，以及评估其在治疗1型糖尿病中的安全性⁸。

天然存在的调节性T细胞（nTregs）包括胸腺来源的tTregs和外周诱导产生的pTregs，在维持机体健康中具有非冗余的重要功能^9-11

方案

人外周血单个核细胞（PBMCs）从瑞典卡罗林斯卡大学医院购买的匿名健康供体血沉棕黄层中新鲜分离获得。实验的伦理许可由瑞典斯德哥尔摩地区伦理审查委员会（Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm）批准（批准编号：2013/1458-31/1）。

1. 外周血T细胞分离

1. PBMC 的分离
   1. 在 50 ml 离心管中预先加入 15 ml 密度梯度离心液（如 Ficoll）（每份血沉棕黄层使用 5 支管），并预热至室温。
   2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）（室温）将血沉棕黄层补至 180 ml。若使用新鲜血液，则以等体积 PBS 稀释血液。
   3. 将离心管倾斜，缓慢地将约 35 ml 稀释后的血液叠加至每管的密度梯度离心液上层。添加血液时需格外小心，避免密度梯度离心液相与血液层混合。
   4. 在室温下以 1,150 × g 离心 20 分钟，不启用刹车。操作离心机时应关闭刹车，若可能，采用低至中等加速度，以防止各层混合。
   5. 取出位于密度梯度离心液与血浆层之间的白色环状层（含 PBMCs），转移至新的 50 ml 离心管中（先用 5 ml 移液器转移一次，再用 2 ml 塑料巴氏移液器转移两次）。尽量避免带入血浆和密度梯度离心液，切勿触碰底部的红细胞沉淀。
   6. 洗涤 PBMCs。将 PBMCs 分装至 50 ml 离心管中（每份....

结果

图1展示了实验装置的示意图。图2展示了磁性分离的初始CD4⁺ T细胞和nTregs的代表性纯度检测染色结果。

F图3A 展示了流式细胞术的设门策略以及 图3B 显示在指定的iTreg或对照条件下培养第6天时，FOXP3和CD25的代表性流式细胞术染色结果。经 体外 刺激后，大多数细胞会上调CD25，而在雷帕霉素存在下，CD25表达降低。只有在添加iTreg诱导因子的情况下，才会出现明显的FOXP3+细胞群体，且该群体在CD25+细胞中富集。⁺ 在iTreg条件下培养的细胞 图3C 在显微镜下显示iTreg培养物的表型特征，增殖的细胞表现为深色的细胞簇。每种iTreg培养条件均呈现出特异且可重复的细胞增殖模式：在此培养条件下，.......

讨论

所述方案可实现从人初始CD4+ T细胞高效诱导生成人CD4+FOXP3+ 诱导性调节性T细胞（iTregs）⁺ T细胞。该方法包含我们近期描述的一种新方案，即使用TGF-β、ATRA和雷帕霉素联合处理，以诱导产生功能更优的iTreg细胞 体外 抑制功能²²与其他已发表的方案相比，另一优势在于可并行使用不同方案诱导出不同的诱导性调节性T细胞（iTreg）亚群，从而能够直接比较特定iTreg诱导因子的作用效果，同时设置仅在IL-2存在下激活的对照细胞。所述方案可实现FOXP3的可重复诱导，且供体间变异较小。初始CD4⁺ 本方案中T细胞通过磁激活细胞分选法分离，但也可采用荧光激活细胞分选法。初始CD4的预期产量⁺ 采用本方案时，T细胞的比例通常在5-10%之间，但该值高度依赖于供体（年龄），且当红细胞比例较高时，T细胞比例似乎会更低。若需估算，可在单核细胞耗竭步骤期间对PBMCs进行染色（见步骤1.4）。通常情况下，初始型CD4⁺ T细胞约占一半 "初始CD4百分比⁺ 淋巴细胞门中的T细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全反式维甲酸	Sigma Aldrich	R2625-50MG
抗人 Foxp3-APC 克隆 236A/E7	eBioscience	17-4777-42
抗人 CD25 磁珠	Miltenyi Biotec	130-092-983
抗人 CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024
抗人 CD28 抗体，LEAF 纯化	Biolegend	302914
抗人 CD3 抗体，LEAF 纯化	Biolegend	317315
抗人 CD45RA，FITC	Miltenyi Biotec	130-092-247
抗人 CD45RO PE 克隆 UCHL1	BD Biosciences	555493
抗人 CD4-PerCP 克隆 SK3；mIgG1	BD Biosciences	345770
抗人 CD8-eFluor 450（克隆 OKT8），mIgG2a	eBioscience	48-0086-42
抗人 CTLA-4（CD152），克隆 BNI3，mIgG2ak， Brilliant violet 421	BD Biosciences	562743
抗人 IFN-γ FITC 克隆 4S.B3；mIgG1k	eBioscience	11-7319-81
含布雷菲德菌素 A 的溶液：GolgiPlug	BD Biosciences	555029
cDNA 合成试剂盒：SuperScript VILO（逆转录酶）cDNA 合成试剂盒	Invitrogen	11754-250
密度梯度离心介质：Ficoll-Paque	GE healthcare	17-1440-03
DMSO 99.7%	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML
FBS，热灭活	Invitrogen	10082-147
可固定的活力染料，eFluor 780	eBioscience	65-0865-14 或 65-0865-18
Foxp3 染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00	注意：含甲醛。也可与抗体组合购买试剂盒；77-5774-40 抗人 Foxp3 染色套装 APC 克隆：236A/E7 套装
GlutaMAX（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）	Invitrogen	35050-061
人初始 CD4 T 细胞分离试剂盒 II	Miltenyi Biotec	130-094-131
人血清白蛋白 50 g/L	Baxter	1501057
来自链球菌（Streptomyces conglobatus）的离子霉素 >98%	Sigma Aldrich	I9657-1MG
MACS LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
小鼠 IgG1 K 同型对照 APC 克隆：P3.6.2.8.1	eBioscience	17-4714-42
小鼠 IgG1 K 同型对照 FITC 50 μg	eBioscience	11-4714-81
小鼠 IgG2a 同型对照，Brilliant violet 421，克隆 MOPC-173	BD Biosciences	563464
巴斯德移液管，塑料，独立包装	Sarstedt	86.1172.001
PMA 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯	Sigma Aldrich	P1585-1MG
雷帕霉素	EMD (Merck)	553210-100UG
重组人 IL-2，CF	R&D	202-IL-050/CF
重组人 TGF-β1，CF	RnD	240-B-010/CF
RNA 提取试剂盒：RNAqueous-Micro 试剂盒	Ambion	AM1931
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	72400-054
丁酸钠	Sigma Aldrich	B5887-250MG
T 细胞培养基：X-Vivo 15 培养基，含庆大霉素和酚红	Lonza	04-418Q
TaqMan 基因表达检测，FOXP3（最佳覆盖）	Applied Biosystems	4331182；检测 ID：Hs01085834_m1	注意：含甲醛
TaqMan 基因表达检测，RPL13A（最佳覆盖）	Applied Biosystems	4351370；检测 ID：Hs04194366_g1	注意：含甲醛
TaqMan 基因表达主混合液	Applied Biosystems	4369514