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方法文章

体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

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⸱

DOI：

10.3791/55015

⸱

2016年12月30日

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法+ T细胞 体外不同的FOXP3诱导方案可用于研究各自方案所获得的特定iTreg表型。

摘要

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，能够抑制针对自身结构的免疫反应，从而预防自身免疫性疾病。目前正在进行通过过继性转移Tregs治疗疾病，或在癌症中耗竭Tregs的临床研究，初步结果令人鼓舞。

由于天然调节性T细胞（nTregs）的数量非常有限，利用天然调节性T细胞研究某些调节性T细胞特征存在困难 体外 诱导性调节性T细胞（iTregs）具有重要优势。迄今为止，尽管并非绝对特异，但最常用于界定调节性T细胞（Tregs）的蛋白标志物是转录因子FOXP3。尽管Tregs具有重要作用，包括外周诱导性Tregs的非冗余功能，但目前生成iTregs的实验方案仍存在争议，尤其是在人类细胞中。因此，本方案描述了 体外 利用多种调节性T细胞诱导因子（仅TGF-β加IL-2，或其与视黄酸、雷帕霉素或丁酸盐的组合）平行诱导人初始T细胞分化为CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞。同时描述了通过流式细胞术和定量反转录PCR对这些细胞进行表型分析的方法。

这些方案可实现FOXP3及其他调节性T细胞特征基因的可重复表达，有助于研究FOXP3的一般调控机制以及特定方案的影响，从而明确某些因素的作用。诱导型调节性T细胞（iTregs）可用于研究调节性T细胞诱导过程中的多种表型特征及分子机制。由于能够获得相对大量的细胞，因此有利于开展深入的分子水平研究。

iTreg细胞在应用上的一个局限性在于，与nTreg细胞相比，其FOXP3的表达相对不稳定。通过本方案生成的iTreg细胞也可用于功能检测，例如研究其抑制功能，其中由TGF-β联合视黄酸和雷帕霉素诱导产生的iTreg细胞表现出更强的抑制活性。然而，iTreg细胞的抑制能力可能与nTreg细胞存在差异，因此使用适当的对照至关重要。

引言

CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞（Tregs）能够抑制其他免疫细胞，是外周免疫耐受的关键介导者，可防止自身免疫和过度炎症反应1。Tregs的重要性体现在人类疾病——免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征（IPEX）中，该病由于调控Treg发育的“主控”转录因子叉头框P3（forkhead box P3, FOXP3）发生突变，导致Tregs缺失，从而引发严重的全身性自身免疫病，并在幼年即致死。然而，Tregs在免疫系统中具有双重作用，在某些情况下也可能削弱抗肿瘤免疫2。因此，对Treg数量和功能的治疗性调控正成为多项临床研究的焦点。在癌症治疗中，清除Tregs可能是有益的，已有部分临床策略取得成功，推动了进一步研究3。在自身免疫性和炎症性疾病中，除了Tregs在多种小鼠疾病模型中展现出的治疗效果外，近期开展的首批人体试验也显示出非常有希望的结果：包括采用过继性Treg输注预防移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）4-7，以及评估其在治疗1型糖尿病中的安全性8。

天然存在的调节性T细胞（nTregs）包括胸腺来源的tTregs和外周诱导产生的pTregs，在维持机体健康中具有非冗余的重要功能9-11然而，天然调节性T细胞（nTreg）的数量有限，因此促使人们采用诱导生成调节性T细胞（iTregs）的补充策略。 体外 来自初始T细胞前体12iTregs 的稳定性仍然不足，可能是由于 FOXP3 基因位点中所谓的调节性 T 细胞特异性去甲基化区（TSDR）缺乏去甲基化所致13，仍然是一个令人担忧的问题，且多项研究表明 体内 诱导型Treg细胞更稳定14.

迄今为止，FOXP3 仍是调节性 T 细胞（Tregs）最理想的蛋白标志物，但其并非绝对特异，因为人传统的 CD4+CD25- T 细胞在活化后可短暂表达中等水平的 FOXP315,16尽管在阐明FOXP3表达调控机制方面已取得显著进展，但关于FOXP3的诱导、稳定性及其功能，特别是在人类细胞中的相关机制，仍有许多未知有待探索。尽管与nTregs存在差异， 体外 诱导的 FOXP3+ CD4+ T细胞可作为研究FOXP3诱导分子机制的模型系统，并为未来开发生成更接近天然调节性T细胞的诱导性调节性T细胞（iTregs）的实验方案提供起点 体内 诱导生成的调节性T细胞，未来可能适用于过继性转移治疗策略。

目前尚无诱导人源iTreg的“金标准”方案，现有方案均基于模拟Treg诱导条件而开发 体内：白细胞介素2（IL-2）和转化生长因子β（TGF-β）信号通路对FOXP3的诱导至关重要 体内17，以及全反式维甲酸（ATRA）——由其产生 体内 由肠道相关树突状细胞介导的方法常被用于增强FOXP3的诱导 体外18-21我们已开发出使用丁酸盐的其他人类Treg诱导方案22一种由肠道微生物群产生的短链脂肪酸，最近被发现可增强小鼠调节性T细胞（Treg）的诱导23,24我们最近还建立了一种新的诱导性调节性T细胞（iTreg）制备方案，可获得功能更强的抑制性iTreg 体外 通过联合使用 TGF-β、ATRA 和雷帕霉素22后者是一种经临床批准的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂，已知可在人调节性T细胞扩增过程中促进FOXP3的维持25,26.

该方法描述了可重复的 体外 通过不同条件诱导生成人CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞（iTregs），并利用流式细胞术和定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对其进行后续表型分析，以揭示不同实验方案下FOXP3及其他调节性T细胞特征分子（如CD25、CTLA-4、EOS）的表达模式，以及IFN-γ和SATB1的抑制情况 表达22所产生的细胞群体可用于功能性检测，以评估其抑制活性，或用于分子研究，包括针对FOXP3通用调控因子的研究，或特定化合物（如丁酸盐或雷帕霉素）作用效应的分析。深入理解驱动Treg分化的分子机制，对于未来在自身免疫疾病或癌症治疗中，精准靶向参与Treg生成与功能的关键分子具有重要意义。

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方案

人外周血单个核细胞（PBMCs）从瑞典卡罗林斯卡大学医院购买的匿名健康供体血沉棕黄层中新鲜分离获得。实验的伦理许可由瑞典斯德哥尔摩地区伦理审查委员会（Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm）批准（批准编号：2013/1458-31/1）。

1. 外周血T细胞分离

  1. PBMC 的分离
    1. 在 50 ml 离心管中预先加入 15 ml 密度梯度离心液（如 Ficoll）（每份血沉棕黄层使用 5 支管），并预热至室温。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）（室温）将血沉棕黄层补至 180 ml。若使用新鲜血液，则以等体积 PBS 稀释血液。
    3. 将离心管倾斜，缓慢地将约 35 ml 稀释后的血液叠加至每管的密度梯度离心液上层。添加血液时需格外小心，避免密度梯度离心液相与血液层混合。
    4. 在室温下以 1,150 × g 离心 20 分钟，不启用刹车。操作离心机时应关闭刹车，若可能，采用低至中等加速度，以防止各层混合。
    5. 取出位于密度梯度离心液与血浆层之间的白色环状层（含 PBMCs），转移至新的 50 ml 离心管中（先用 5 ml 移液器转移一次，再用 2 ml 塑料巴氏移液器转移两次）。尽量避免带入血浆和密度梯度离心液，切勿触碰底部的红细胞沉淀。
    6. 洗涤 PBMCs。将 PBMCs 分装至 50 ml 离心管中（每份血沉棕黄层分至 4 支管），每管加 PBS 至 50 ml。
    7. 在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。
    8. 弃去上清液，将细胞收集至 1 支含 10 ml RPMI/10% 胎牛血清（FCS）培养基的离心管中并充分重悬。若存在细胞团块，需通过 40 µm 细胞筛过滤。
    9. 将细胞转移至 T175 细胞培养瓶中用于贴壁培养。用 40 ml 培养基冲洗原离心管，并将洗液合并至细胞中（总体积 50 ml）。如需，可取部分细胞用于流式细胞术分析（见步骤 1.4）。通常，CD4+ T 细胞约占淋巴细胞门控内细胞的 30–40%，而初始 T 细胞约占 CD4+ T 细胞的 30 至 60%，具体比例因供体而异。
    10. 将培养瓶平放，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 至 90 分钟。此步骤通过塑料贴壁去除单核细胞。该步骤非必需，但可提高后续步骤中每单位 PBMCs 所得 T 细胞的比例。
    11. 重悬细胞（使用培养瓶中原有的 50 ml 培养基），并充分冲洗培养瓶底部的细胞层。将细胞均分至两个 50 ml 离心管中（可重复使用同一供体的原管）。用 50 ml 新鲜 RPMI/10% FCS 培养基冲洗培养瓶，并将洗液均分加入上述两管。
      注：PBMCs 可在 4 °C 下将离心管侧放保存过夜，或最好直接用于 T 细胞分离。
  2. 通过磁珠激活细胞分选法分离 nTreg
    1. 配制分离缓冲液：含 0.5%（w/v）人血清白蛋白和 2 mM EDTA 的 PBS 溶液。始终将缓冲液保持在 4 °C。也可使用牛血清白蛋白替代人血清白蛋白。
    2. 使用自动或手动细胞计数器在台盼蓝存在下重悬并计数 PBMCs（无需计数小血小板）。若观察到细胞团块，需通过 40 µm 细胞筛过滤。
    3. 在室温下以 450 × g 离心 PBMCs 10 分钟。
    4. 用 1 ml 移液器将细胞重悬于每 107 个 PBMCs 加 90 µl 分离缓冲液中，以获得单细胞悬液。将细胞保留在原始的 50 ml 离心管中（每份血沉棕黄层使用 2 支管）。
    5. 每 107 个细胞加入 2 µl CD25 磁珠，混匀后在 4 °C 下孵育 15 分钟。
    6. 用 PBS 补至 30 ml，在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟。
    7. 准备 LS 柱（每份血沉棕黄层准备 2 支）：用 3 ml 分离缓冲液平衡，弃去穿流液。可重复使用离心管冲洗其他柱子。
    8. 用 1 ml 移液器将每管细胞重悬于 3 ml 分离缓冲液中。将细胞转移至 LS 柱，穿流液收集至新的 15 ml 离心管中。
    9. 用 2 ml 分离缓冲液分别冲洗 50 ml 离心管。将洗液转移至柱子中。
    10. 每次用 3 ml 分离缓冲液洗涤柱子 2 次。每次加液前必须等待柱子完全停止滴液。将穿流液在 4 °C 下保存，用于后续步骤。
    11. 将柱子从磁架上取下。每柱用 3 ml 分离缓冲液洗脱 2 次，洗脱液收集至 15 ml 离心管中。
      注：同一供体的两根柱子的洗脱液可合并。切勿将柱子浸入液体中。
    12. 准备并平衡新的 LS 柱（每份血沉棕黄层 1 支）。将步骤 1.2.11 的洗脱液转移至柱子中。穿流液可弃去。待洗脱液完全通过柱子后，冲洗收集管，并用 3 ml 分离缓冲液洗涤柱子 3 次。
      注：第二根柱子对提高纯度至关重要。
    13. 将柱子从磁架上取下。每柱用 3 ml 分离缓冲液洗脱 CD25++ "nTregs" 2 次。
    14. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟，彻底弃去上清液。
    15. 用 15 ml T 细胞培养基洗涤细胞，在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟，彻底弃去上清液。
    16. 将细胞重悬于 0.5 ml T 细胞培养基中（每管均含 100 IU/ml IL-2），转移至 24 孔板中。用 0.5 ml 培养基（含 100 IU/ml IL-2）冲洗离心管，并将洗液合并至 24 孔板中。
    17. 计数 nTregs（方法同步骤 1.2.2）。每份血沉棕黄层通常可获得约 1–4 × 106 个 Treg 细胞。用 T 细胞培养基 + 100 IU/ml IL-2 将 Treg 细胞密度调整至 1–2 × 106 个细胞/ml。
    18. 将 Treg 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至使用。
  3. 通过磁珠激活细胞分选法分离初始 CD4+ T 细胞
    注：取步骤 1.2.8–1.2.10 的穿流液继续进行细胞分离。若未分离 nTreg，可直接从 PBMCs 开始。
    1. 将每供体的两管 Treg 耗尽型 PBMCs 合并于一支 50 ml 离心管中，用室温 PBS 补至 50 ml。
    2. 在室温下以 200 × g 离心 PBMCs 5–10 分钟。弃去上清液，用 50 ml PBS 重悬细胞。
    3. 重复步骤 1.3.2 两次。
      注：PBS 洗涤对去除血小板至关重要，因为后续的阴性分选试剂盒无法去除血小板。在低速离心条件下，血小板保留在上清液中。可在显微镜载玻片上监测各步骤中的血小板去除情况。所有步骤必须使用 PBS 并在室温下进行离心。
    4. 用 50 ml PBS 重悬 PBMCs。按步骤 1.2.2 的方法计数细胞。
    5. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 PBMCs 10 分钟。弃去上清液，用每 107 个细胞加 40 µl 分离缓冲液（4 °C）重悬细胞。
    6. 每 107 个细胞加入 10 µl 初始 CD4+ T 细胞生物素标记抗体混合物 II。
    7. 混匀后在 4 °C 下孵育 10 分钟。
    8. 加入 40 ml PBS（4 °C）洗涤细胞，在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，用每 107 个细胞加 80 µl 分离缓冲液重悬细胞。
    9. 每 107 个细胞加入 20 µl 抗生物素磁珠。充分混匀后在 4 °C 下孵育 15 分钟。
    10. 用冷 PBS 补至 50 ml，在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟。
    11. 准备 LS 柱（用 3 ml 分离缓冲液平衡）。为避免柱子过载，每根柱子最多处理 250 × 106 个 PBMCs；若 PBMCs 中红细胞较多，则应减少细胞量。
    12. 弃去上清液，将细胞重悬于 3 ml 分离缓冲液中。将细胞转移至 LS 柱，穿流液（含初始 CD4+ T 细胞）收集至 15 ml 离心管中。
    13. 用 2 ml 分离缓冲液冲洗离心管，将洗液转移至柱子中。
    14. 每次用 3 ml 分离缓冲液洗涤柱子 3 次。每次加液前必须等待柱子完全停止滴液。
    15. 收集穿流液（初始 CD4+ T 细胞），在 4 °C 下以 450 × g 离心 10 分钟。柱子可弃去。
    16. 彻底弃去上清液。用 15 ml 培养基洗涤细胞，在室温下以 450 × g 离心 10 分钟，彻底弃去上清液。
      注：分离缓冲液含 EDTA，可螯合钙离子，从而抑制 T 细胞活化。在进行任何刺激实验前，必须彻底去除分离缓冲液，并用 15 ml 培养基洗涤细胞两次。
    17. 将细胞重悬于 T 细胞培养基中，调整至 2–3 × 106 个细胞/ml。在培养箱中适当容器中静置过夜。若细胞将直接用于刺激实验，则需再用培养基洗涤一次。
  4. 纯度检测染色
    1. 分别取约 50,000 个细胞（初始 T 细胞、nTreg、PBMCs），每份 20 µl。
      注：若需同时染色初始 T 细胞和 nTreg 检测组，每种细胞取两份样本。
    2. 根据仪器要求配制 2 倍浓缩的抗体预混液（溶于 PBS），例如：初始 T 细胞组：CD4-PerCP 1:5；CD45RA-FITC 1:10；CD45RO-PE 1:5；CD8-eFlour450 1:8。对于 Treg 检测组，将 CD45RO-PE 替换为 CD25-PE（1:10）。
      注：仅某些识别与 CD25 磁珠不同表位的 CD25 抗体可用于染色经 CD25 磁珠分离的 nTreg。
    3. 向 20 µl 细胞中加入 20 µl 抗体预混液。同时为每种荧光染料制备单染样本（使用含阳性细胞的样本，例如 PBMCs）及未染色样本，用于流式细胞仪设置和补偿调节。
    4. 在室温避光条件下孵育 15 分钟。
    5. 每管加入 200 µl PBS，以 450 × g 离心 5–10 分钟。
    6. 用荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（即不含 EDTA 的分离缓冲液）重悬细胞，进行流式细胞术分析。初始 CD4+ T 细胞的纯度通常 >95%（见 图 2）。

2. Treg 诱导培养

  1. 刺激培养基与培养板的制备
    1. 准备并预热T细胞培养基：添加了2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的无血清造血培养基。
    2. 配制细胞因子、刺激抗体和化合物的储备液浓度。
      1. 制备IL-2储存液：将IL-2溶解于经无菌过滤（使用耐酸滤膜）的100 mM乙酸溶液中，配制成400,000 IU/ml的溶液（若所用批次的活性为每1 µg含2,400 IU，则相当于167 µg/ml；需向供应商确认活性）。分装至已灭菌的低蛋白吸附0.5 ml离心管中，用Parafilm封口，干冰速冻后，长期储存置于-80 °C，或短期储存（不超过3个月）置于-20 °C。
      2. 制备TGF-β1储存液（10 µg冻干粉，无载体）：将TGF-β1粉末在1,000 × g离心3分钟，加入100 µl 4 mM HCl（经耐酸滤膜无菌过滤），配制成浓度为100 µg/ml的储存液，待其完全溶解后涡旋混匀。分装至灭菌的低蛋白吸附0.5 ml离心管中，每管5 µl，用Parafilm密封，干冰速冻后于-80 °C保存，可保存长达6个月。
      3. 制备全反式维甲酸（ATRA）储备液：将粉末溶于DMSO，配制成20 mg/ml（66.6 mM）溶液，再用DMSO稀释至10 mM的储备浓度。分装后避光保存于-80 °C，可稳定保存长达1年。ATRA对光、热和空气敏感。
      4. 制备雷帕霉素储备液：将雷帕霉素溶于DMSO中，配制成1 mg/ml（1.11 mM）溶液，分装后于-80 °C保存，可保存长达1年。
      5. 制备丁酸钠储备液：0.908 M（0.1 mg/ml）的无菌超纯水溶液2O并经无菌过滤。分装后于-20 °C保存。
    3. 在T细胞培养基中配制4倍浓缩预混液（每孔50 µl），方法如下 表1.
    4. 前一天，用抗CD3抗体包被板孔。在96孔U型板中，按每孔65 µl加入含5 µg/ml抗CD3抗体的PBS溶液，包被所需数量的孔。用铝箔纸包裹板子，于4 °C孵育过夜。
      注意：不要使用96孔板的边缘孔。可以使用较大的孔，但U形孔有助于在不同实验中保持每单位面积的细胞数量一致。如果需要更多细胞，可在培养后合并所需数量的孔。通常，在扩增4-6天后，每个样本取2个孔即足以进行流式细胞术分析和RNA分析。
      1. 铺板当天，在铺板前短时间内，从孔中移除抗CD3溶液。每孔加入200 µl PBS，随后移除PBS。用200 µl/孔PBS重复洗涤一次。彻底移除PBS，并立即使用该培养板。
    5. 准备平板（不要使用边缘孔）：
      1. 每个孔中加入 50 µl 4x 抗 CD28/IL-2 预混液（除 "未刺激的" 细胞，加入T细胞培养基），50 µl 4x TGF-β1预混液（用于所有iTreg细胞）或50 µl T细胞培养基 "仅刺激" 模拟对照，50 µl 4x ATRA、ATRA/雷帕霉素或丁酸盐预混液（如适用）或培养基
      2. 用 200 µl PBS 填充所有空孔，包括边缘孔。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下预热2.
  2. 准备用于铺板的初始T细胞
    1. 静置细胞后，转移至15 ml离心管中，用预热的T细胞培养基冲洗培养瓶/孔板，并将冲洗液收集至该离心管中。用T细胞培养基定容至15 ml。
    2. 在室温下以 450 x g 离心 10 分钟。
    3. 吸除培养基，用新鲜的预热T细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.2–2.6 × 106/ml。按照步骤1.2.2计数细胞，必要时调整密度。
    4. 将细胞加入已制备的刺激板中（参见步骤2.1），每孔50 µl细胞悬液（每孔110,000–130,000个细胞）。每孔总体积应为200 µl。
    5. 用铝箔包裹培养板，以保护全反式维甲酸（ATRA）免受光照；在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 所需的时间段。
  3. 监测Treg诱导培养
    1. 通过光学显微镜（40倍放大）监测Treg细胞培养情况。从第2至第3天起，应可见少量增殖细胞形成的微小细胞簇，随后时间点逐渐融合为较大的细胞簇。使用雷帕霉素培养的细胞总体增殖较少。另请参见 图3.
    2. 在预定时间点，采集样本用于RNA提取或流式细胞术表型分析（见下文）。对于涉及细胞增殖的较晚时间点，每个时间点取1个孔即可；其他情况则需取1 × 10⁶个细胞。5-1 × 106 细胞，分别用于RNA提取和3 x 105-1 × 106 用于流式细胞术的细胞。
  4. 评估 FOXP3 稳定性
    1. 用于评估iTreg表型的稳定性，方法如前所述22,27用T细胞培养基洗涤iTreg细胞两次，随后将iTreg细胞继续培养于T细胞培养基中，可选择不加或添加抗CD3和抗CD28进行再刺激，具体操作如2.1和2.2所述。加入细胞因子（如50 IU/ml IL-2）以研究其对FOXP3稳定性的影
    2. 在预定的时间点，采集样本用于RNA提取、流式细胞术表型分析（见下文）以及TSDR甲基化分析，具体方法如前所述。22,28.

3. 通过qRT-PCR对iTreg进行表型分析

  1. 样品制备
    1. 在预定时间点，取 1 x 105 至 1 × 106 每个样本用于RNA提取的细胞量。将细胞转移至无RNase的1.5 ml离心管中，于500 × g离心5分钟。
    2. 如有需要，移除部分上清液并冻存，用于酶联免疫吸附测定（ELISA）或类似分析。将剩余上清液从细胞中完全移除。可直接进行RNA提取，或将在干冰上速冻的细胞沉淀于-20 °C至-80 °C保存最多2周。
    3. 提取RNA并进行qRT-PCR FOXP3 以及一个看家基因（例如 RPL13A）按照标准方案进行。此外，检测其他Treg特征基因的表达（例如“Treg up”基因 IL2RA, CTLA4, IKZF4和“Treg下调”基因 IFNG，SATB1).

4. 流式细胞术进行表型分析

注意：本方案优化适用于 96U 孔板，每孔细胞数为 3 × 105 至 1 × 106。若每孔细胞数较少，请从多个孔开始，并按以下所述进行合并。

  1. 细胞再刺激（可选）
    1. 若需进行细胞内细胞因子染色，请在蛋白转运抑制剂存在下，用佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）/离子霉素对细胞进行脉冲处理。
      注意：该操作不会影响上述iTreg培养体系中的FOXP3表达，但其他标志物可能会发生变化——例如CD4会下调。
    2. 在T细胞培养基中配制10倍浓度的布雷菲德菌素A/PMA/离子霉素预混液（每孔20 µl）：布雷菲德菌素A原液按1:100稀释，离子霉素（储存液5 µg/µl）按1:1,300稀释，PMA（储存液12.35 µg/µl，预先按1:1235稀释）使用预稀释液按1:100稀释。
    3. 染色前4小时，每孔加入20 µl 10倍浓度的布雷菲德菌素A/PMA/离子霉素混合液，使终浓度分别为布雷菲德菌素A 1:1,000、离子霉素0.5 µM（375 ng/ml）、PMA 10 ng/ml。
    4. 在37 °C、5%CO2条件下孵育4小时
  2. 表面染色
    注意：此处建议的抗体组合仅为参考；可根据目标抗原及仪器配置选用其他组合。
    1. 将PBS置于冰上预冷。配制FACS缓冲液（含0.5%人血清白蛋白HSA的PBS），并置于冰上预冷。BSA或FBS可替代HSA使用。
    2. 将细胞重铺至染色板：用移液器吹打重悬细胞，转移至新的96U型底板，每孔周围留空一孔（防止后续染色过程中液体交叉污染）。若原始孔中细胞数量不足，可在重悬前去除部分上清液，并将多个孔的细胞合并至一个染色孔中。
    3. 室温下以400 × g离心10分钟。
    4. 去除上清液。将上清液倒入废液盒，将板倒扣，立即在吸水纸上轻拍一次（期间不翻转板），然后立即翻回。涡旋震荡板以重悬残留液体中的细胞。
    5. 加入25 µl表面染色预混液（CD25-PE 1:20，CD4-PerCP 1:5，溶于FACS缓冲液），并重悬细胞。
      注意：应同时设置每种荧光染料的单染对照，样本中需包含相应抗原的阳性细胞；并设置未染色对照样本。这些对照将用于仪器补偿调节。也可使用补偿微珠替代。
    6. 在4 °C避光孵育30分钟。
    7. 加入200 µl PBS，以400 × g在4 °C离心10分钟，按步骤4.2.4所述方法去除上清液。涡旋震荡板。
    8. 重复步骤4.2.7两次。
  3. 活力染色
    注意：活力染色必不可少，因为在固定/通透处理后，死细胞无法通过前向散射/侧向散射（fsc/ssc）有效排除，可能产生非特异性信号。必须使用可固定的活力染料。
    1. 将细胞重悬于130 µl活力染色预混液（可固定活力染料-eFlour780按1:1,400稀释于PBS中），并立即用多通道移液器重悬细胞。
      注意：应同时设置活力染料的单染对照，样本中需包含死细胞，例如未经刺激、培养数天的T细胞，或按照制造商说明通过加热等方式杀死的细胞。这些对照将用于补偿调节。
    2. 在4 °C避光孵育30分钟。
    3. 在4 °C以400 × g离心10分钟。按步骤4.2.4所述方法去除上清液。涡旋震荡板。
    4. 加入200 µl FACS缓冲液。重复步骤4.3.3。
    5. 加入200 µl PBS。重复步骤4.3.3。
  4. 使用FOXP3染色缓冲液试剂盒进行细胞内染色
    1. 每孔配制如下试剂：150 µl Fix/Perm缓冲液（将Fix/Perm浓缩液与稀释液按1:4稀释）；850 µl 1倍通透缓冲液（将10倍通透缓冲液与超纯H2O按1:10稀释）。
    2. 涡旋震荡后，将细胞重悬于150 µl Fix/Perm缓冲液中，并立即用移液器重悬。立即重悬至关重要，以避免细胞团块发生固定。
      注意：固定缓冲液含有多聚甲醛，应妥善操作和废弃。
    3. 在4 °C避光孵育30分钟。
    4. 加入100 µl冷PBS。在4 °C以850 × g离心10分钟。
      注意：从本步骤起，离心速度提高，以避免细胞损失。固定后细胞不可见，因此应在离心结束后立即按步骤4.2.4所述方法小心去除上清液，以尽量减少细胞损失。
    5. 按步骤4.2.4所述方法去除上清液。涡旋震荡板。
      注意：本步骤可暂停染色流程；若暂停，需用200 µl PBS洗涤细胞两次，然后重悬于250 µl PBS中，4 °C避光保存。细胞可保存数天，之后继续进行通透处理。但为获得最佳结果，建议直接进行通透步骤。
    6. 涡旋震荡后，加入200 µl通透缓冲液。在4°C以850 × g离心10分钟。按步骤4.2.4所述方法去除上清液。涡旋震荡板。
    7. 加入200 µl通透缓冲液重悬细胞。
      注意：此时可将样本分为细胞内染色组和同型对照组（取每份样本的一半）。若细胞数量有限，可制备合并的同型对照样本（取每份样本10–20 µl合并）。也可设置荧光减一（FMO）对照。
    8. 在4 °C以850 × g离心10分钟。按步骤4.2.4所述方法去除上清液。涡旋震荡板。
    9. 将沉淀重悬于44 µl通透缓冲液加1 µl正常小鼠血清（预先混合）中，以阻断非特异性结合。
      注意：若下一步所用抗体为小鼠来源同型抗体，则使用此阻断条件。若使用其他来源抗体（如大鼠来源），则应使用相应的阻断血清（例如大鼠血清）。
    10. 在4 °C避光孵育15分钟。
    11. 加入抗体：
      注意：请查询特定批次抗体的推荐使用浓度。若未在步骤4.2中使用相应荧光标记的表面抗原抗体（例如 CD4）进行单染，也应为每种使用的荧光染料设置单染对照，样本中需包含相应抗原的阳性细胞，用于补偿调节。
      1. 向样本（单染、未染色、同型对照及FMO对照除外）加入15 µl抗体预混液：每样本预混液组成为：0.7 µl（0.35 µg）抗干扰素γ（IFN-γ）-FITC（若经再刺激后适用）、2.3 µl（0.115 µg）CTLA-4 Brilliant Violet 421、2 µl（0.05 µg）抗-FOXP3-APC、10 µl PBS。
      2. 向同型对照样本中加入15 µl同型抗体预混液，各抗体用量与4.4.11.1中所用抗体相同：每样本预混液组成为：0.7 µl（0.35 µg）小鼠IgG1 K同型对照FITC（若适用）、0.58 µl（0.115 µg）小鼠IgG2a-BV421同型对照、0.5 µl（0.05 µg）小鼠IgG1 K同型对照APC、13.2 µl PBS。
      3. 对于FMO对照，按4.4.11.1加入抗体，每次用PBS替换其中一种抗体。
    12. 在4 °C避光孵育30分钟。
    13. 加入200 µl通透缓冲液。按步骤4.4.8进行离心、去除上清液及涡旋震荡。重复一次。
    14. 将细胞重悬于冷FACS缓冲液中（体积根据所用仪器确定），并立即在流式细胞仪上检测。

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结果

图1展示了实验装置的示意图。图2展示了通过磁珠分离获得的初始型CD4+ T细胞和自然调节性T细胞（nTregs）的代表性纯度检测染色结果。

F图3A 显示流式细胞术设门策略及 图3B 显示在指定的iTreg或对照条件下培养第6天时FOXP3和CD25的代表性流式细胞术染色结果。在 体外 刺激后，大多数细胞会上调CD25，而在雷帕霉素存在时，CD25表达降低。只有在添加iTreg诱导因子的情况下，才会出现明显的FOXP3+细胞群体，且该群体在CD25+细胞中富集。+ 在iTreg条件下培养的细胞 图3C 在显微镜下显示iTreg培养物的表型特征，增殖的细胞呈现为深色的细胞簇。每种iTreg培养条件均表现出特异且可重复的细胞增殖...

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讨论

所述方案可实现从人初始CD4+ T细胞高效诱导生成人CD4+FOXP3+ 诱导性调节性T细胞（iTregs）+ T细胞。该方法包含我们近期描述的一种新方案，即使用TGF-β、ATRA和雷帕霉素联合处理，以诱导产生功能更优的iTreg细胞 体外 抑制功能22与其他已发表的方案相比，另一优势在于可并行使用不同方案诱导出不同的诱导性调节性T细胞（iTreg）亚群，从而能够直接比较特定iTreg诱导因子的作用效果，同时设置仅在IL-2存在下激活的对照细胞。所述方案可实现FOXP3的可重复诱导，且供体间变异较小。初始CD4+ 本方案中T细胞通过磁激活细胞分选法分离，但也可采用荧光激活细胞分选法。初始CD4的预期产量+ 采用本方案时，T细胞的比例通常在5-10%之间，但该值高度依赖于供体（年龄），且当红细胞比例较高时，T细胞比例似乎会更低。若需估算，可在单核细胞耗竭步骤期间对PBMCs进行染色（见步骤1.4）。通常情况下，初始型CD4+ T细胞约占一半 "初始CD4百分比+ 淋巴细胞门中的T细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Nina Nagel 在视频拍摄和实验准备过程中提供的技术支持。感谢 Eva-Maria Weiss 在细胞内 FOXP3 染色实验方案方面提供的帮助，感谢 Elisabeth Suri-Payer 和 Nina Oberle 建立了天然调节性 T 细胞（nTreg）分离方案。感谢 Matilda Eriksson 和 Peri Noori 在实验室管理方面的工作。

基金支持：A.S. 获得了第七框架计划（7th European Community Framework Programme）内的玛丽·居里欧洲内部奖学金、Åke Olsson 博士基金会以及KI研究基金会的支持；A.S. 和 J.T. 获得了炎症与心血管疾病卓越研究中心（CERIC）项目的资助；J.T. 获得了瑞典科研理事会医学与健康部（Vetenskapsrådet Medicine and Health，项目编号 2011-3264）、托尔斯滕·瑟德贝里基金会、FP7 STATegra 项目、AFA 保险以及斯德哥尔摩县议会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全反式维甲酸Sigma AldrichR2625-50MG  
抗人 Foxp3-APC 克隆 236A/E7eBioscience17-4777-42
抗人 CD25 磁珠Miltenyi Biotec130-092-983
抗人 CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
抗人 CD28 抗体，LEAF 纯化 Biolegend302914
抗人 CD3 抗体，LEAF 纯化 Biolegend317315
抗人 CD45RA，FITCMiltenyi Biotec130-092-247
抗人 CD45RO PE 克隆 UCHL1BD Biosciences555493
抗人 CD4-PerCP 克隆 SK3；mIgG1BD Biosciences345770
抗人 CD8-eFluor 450（克隆 OKT8），mIgG2aeBioscience48-0086-42 
抗人 CTLA-4（CD152），克隆 BNI3，mIgG2ak， Brilliant violet 421BD Biosciences562743
抗人 IFN-γ FITC 克隆 4S.B3；mIgG1keBioscience11-7319-81 
含布雷菲德菌素 A 的溶液：GolgiPlugBD Biosciences555029
cDNA 合成试剂盒：SuperScript VILO（逆转录酶）cDNA 合成试剂盒Invitrogen11754-250
密度梯度离心介质：Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS，热灭活Invitrogen10082-147
可固定的活力染料，eFluor 780  eBioscience65-0865-14 或 65-0865-18 
Foxp3 染色缓冲液套装eBioscience00-5523-00注意：含甲醛。也可与抗体组合购买试剂盒；77-5774-40 抗人 Foxp3 染色套装 APC 克隆：236A/E7 套装
GlutaMAX（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）Invitrogen35050-061
人初始 CD4 T 细胞分离试剂盒 IIMiltenyi Biotec130-094-131
人血清白蛋白 50 g/LBaxter1501057
来自链球菌（Streptomyces conglobatus）的离子霉素 >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
小鼠 IgG1 K 同型对照 APC 克隆：P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
小鼠 IgG1 K 同型对照 FITC 50 μgeBioscience11-4714-81 
小鼠 IgG2a 同型对照，Brilliant violet 421，克隆 MOPC-173BD Biosciences563464
巴斯德移液管，塑料，独立包装Sarstedt86.1172.001  
PMA 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯Sigma AldrichP1585-1MG 
雷帕霉素EMD (Merck)553210-100UG
重组人 IL-2，CFR&D202-IL-050/CF
重组人 TGF-β1，CFRnD240-B-010/CF
RNA 提取试剂盒：RNAqueous-Micro 试剂盒AmbionAM1931  
RPMI 1640 培养基 Invitrogen72400-054 
丁酸钠Sigma AldrichB5887-250MG 
T 细胞培养基：X-Vivo 15 培养基，含庆大霉素和酚红Lonza04-418Q
TaqMan 基因表达检测，FOXP3（最佳覆盖） Applied Biosystems4331182；检测 ID：Hs01085834_m1注意：含甲醛
TaqMan 基因表达检测，RPL13A（最佳覆盖）Applied Biosystems4351370；检测 ID：Hs04194366_g1  注意：含甲醛
TaqMan 基因表达主混合液Applied Biosystems4369514

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CD4 T TGF qRT PCR FOXP3 T
体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化
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