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方法文章

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

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DOI：

10.3791/55022

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2016年12月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

本文内容

摘要

脯氨酰-脯氨酰内肽酶-1（PPEP-1）是一种由人类病原体Clostridium difficile分泌的金属蛋白酶，也是具有前景的药物靶点。本文描述了该蛋白的制备及其结构解析所需的全部方法。

摘要

目前亟需开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的Clostridium difficile感染。C. difficile金属蛋白酶PPEP-1是未来开发抑制剂以降低该病原体毒力的潜在靶点。为了进行生物物理和结构表征以及抑制剂筛选，需要大量高纯度且具有活性的蛋白。我们已建立了一种高效生产与纯化PPEP-1的实验方案，利用E. coli作为表达宿主，可获得足够数量和纯度的蛋白，满足结晶及结构解析的需求。此外，通过微晶接种技术，可将严重共晶生长的PPEP-1晶体转化为高度有序、适用于X射线衍射分析的单晶。该方法也可用于其他重组蛋白的制备，以及研究产生共晶现象的其他蛋白质的结构。

引言

Clostridium difficile 是医院内抗生素相关性腹泻感染的主要病因之一1。这种革兰氏阳性厌氧细菌通过粪-口途径以其孢子形式传播。例如 BI/NAP1/027 等新型“流行性”或“高毒力”菌株在过去十年中导致北美和欧洲的感染病例数和死亡率急剧上升2。C. difficile 相关疾病（CDAD）是一种危及生命的结肠炎症，具有较高的致死率3。其症状范围从腹泻4到假膜性结肠炎5，以及常导致死亡的中毒性巨结肠6。

由于高致病性菌株具有多重耐药性且复发率高，艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的治疗较为困难7。目前的治疗方案包括使用抗生素甲硝唑、非达霉素或万古霉素，对于反复复发的病例则采用粪便微生物群移植。迫切需要新的治疗策略8。目前已取得一定进展，针对艰难梭菌（C. difficile）毒素B的治疗性单克隆抗体贝洛托单抗（Bezlotoxumab）9已成功完成III期临床试验，并已向美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）提交上市申请。此外，目前还有多种新型抗生素正处于不同阶段的临床试验中10。

为了开发有效的治疗方法，必须识别新的治疗靶点。最近发现的 C. difficile 蛋白酶脯氨酸-脯氨酸内肽酶-1（PPEP-1；CD2830/Zmp1；E.C. 3.4.24.89）是一个极具前景的靶点，因为敲除菌株中PPEP-1的缺失会降低其毒力 体内艰难梭菌11PPEP-1 是一种分泌型金属蛋白酶12,13 切割两个 C. difficile 其C末端的黏附素13 从而将黏附的细菌从人体肠道上皮释放出来。因此，该过程参与维持细菌固着表型与运动表型之间的平衡 C. difficile为了开发针对PPEP-1的选择性抑制剂，并深入理解其识别底物的机制，必须充分掌握其三维结构的详细信息。我们已解析了PPEP-1单独存在及其与底物肽结合状态下的首个晶体结构。14PPEP-1 是首个已知可特异性切割两个脯氨酸残基之间肽键的蛋白酶15它以双弯曲方式结合底物，并通过位于覆盖蛋白酶活性位点的S环中的一系列脂肪族-芳香族残基网络来稳定底物14这种底物结合模式为PPEP-1所独有，迄今未见于人类蛋白酶中。这使其成为一个极具前景的药物靶点，且抑制剂产生脱靶效应的可能性极低。

未来若要开发并筛选选择性PPEP-1抑制剂，需要大量高纯度且单分散的PPEP-1蛋白。此外，为了确定首批抑制剂的结合模式，还需解析其与PPEP-1的共结晶结构。在我们实验过程中，PPEP-1始终产生重叠生长的晶体。因此，我们建立了一种优化方法，以获得可用于衍射分析的单一高质量PPEP-1晶体。本方案中，我们详细描述了PPEP-114的表达、纯化、结晶及结构解析过程。我们采用在Escherichia coli中进行胞内表达的方式，表达缺失分泌信号序列的PPEP-1变体，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化，并切除纯化标签；接着采用微晶接种法16进入优化筛选，最终通过锌单波长反常散射（zinc-SAD）方法完成结构解析17。该方案可适用于其他蛋白质（e.g. 金属蛋白酶）的制备与结构解析，尤其适用于易形成重叠晶体的蛋白质。应要求，可用于教学目的的质粒DNA（pET28a-NHis-rPPEP-1）及衍射数据可提供使用。

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方案

1. 克隆与载体构建

  1. 使用 NdeI 和 XhoI 限制性酶切位点，将 C. difficile PPEP-1 去除信号肽后的密码子优化序列（E. coli 优化，氨基酸 27-220，以下称为重组 PPEP-1（rPPEP-1）11）克隆至 pET28a 载体中（图 1），并在 3'端加入终止密码子（所得载体为 pET28a-NHis-rPPEP-1）。该构建体可表达带有 N 端 6×His 标签的蛋白（NHis-rPPEP-1），并含有凝血酶切割位点，以便在纯化过程中去除标签（图 1）。该质粒含有卡那霉素抗性盒用于筛选。克隆所用引物已在其他文献中描述14。

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图1：pET28a-NHis-rPPEP-1 载体的示意图及表达与各纯化步骤的 SDS-PAGE 分析。（A）使用 PlasMapper 绘制的通过 NdeI/XhoI 酶切位点将 NHis-rPPEP-1 克隆至 pET28a 载体的质粒图谱。（B）NHis-rPPEP-1 构建体的示意图（上图）以及经凝血酶切割 6xHis 标签后在 N 端保留额外 GSHM 序列的最终构建体（下图）。SDS-PAGE 分析（C）BL21 (DE3) Star 菌株在 37 °C 条件下诱导表达 4 小时的结果，以及（D）各纯化步骤样品的分析结果（M：分子量标记）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. rPPEP-1的表达与纯化

  1. NHis-rPPEP-1的表达
    1. 配制并高压灭菌 LB（溶菌肉汤）培养基（10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，用 NaOH 调节 pH 至 7.5）。添加硫酸卡那霉素（50 µg/ml) 使用前立即加入（LB/Kan 培养基）。
    2. 从新鲜转化的菌液中接种200 ml过夜培养物 E. coli 在LB/Kan培养基中，37℃过夜培养 37 °C 以220 rpm的转速振荡。
    3. 次日早晨，检测 OD600 （600 nm 波长下的光密度）的过夜培养物。将过夜培养物接种至两个装有 1 L LB/Kan 培养基的 2.8 L 有挡板锥形瓶中，使 OD600 0.1。添加三滴水-硅油乳液以防止泡沫过度产生。将细胞置于 37 °C 以180 rpm摇床振荡至OD600 达到 0.6。
    4. 取诱导前样品用于SDS-PAGE分析（相当于OD600下1 ml培养液的样品）600 = 1）；加入IPTG至终浓度0.5 mM，以诱导NHis-rPPEP-1的表达。继续在 37 °C180 rpm，4 小时
    5. 测定 OD600 在10倍稀释后取收获样品（相当于从OD值为指定值的培养液中取1 ml）600 = 1).
    6. 以 7,000 x g 离心 20 分钟收集细胞，并 4 °C. 为去除残留的LB培养基，将1 L培养物的菌体沉淀重悬于40 ml TBS缓冲液（Tris缓冲盐水：20 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM NaCl）中，转移至50 ml离心管。在10,000 x g条件下离心10 min收集菌体，并 4 °C 并储存于 -80 °C 直至使用前。通过SDS-PAGE分析表达（总裂解物和可溶性组分）18.
  2. 未标记rPPEP-1的纯化
    1. 取 50 µl 每个纯化步骤取样用于SDS-PAGE分析。将1 L培养物的细胞沉淀用含TBS缓冲液重悬 10 µg/ml DNaseI。每克细胞使用5 ml TBS/DNaseI。
      1. 在冰/水浴中超声破碎细胞，设置超声功率为30%，处理15分钟（工作2秒，间歇2秒）。随后在10,000 × g离心10分钟，去除细胞碎片 4 °C 并将上清液转移至超速离心管中。在165,000 x g条件下超速离心30分钟以澄清裂解液，并 4 °C.
    2. 在 4-6 °C使用蠕动泵或层析系统，将2 ml镍-次氮基三乙酸（NiNTA）树脂装入玻璃柱中，并用含10 mM咪唑（pH 7.5）的TBS缓冲液平衡。也可采用重力流方法。
      1. 用1 M 咪唑（pH 7.5）调节澄清裂解液，使其终浓度为10 mM。将裂解液上样至层析柱，随后分别用含有10 mM和30 mM咪唑的TBS缓冲液进行梯度洗涤，直至280 nm处的紫外吸收值降至基线水平。
      2. 用含250 mM咪唑的TBS缓冲液洗脱蛋白质。将层析柱重新平衡至含10 mM咪唑的TBS缓冲液，并于4℃过夜保存。
    3. 使用25,900 M⁻¹cm⁻¹的消光系数在280 nm处测定蛋白浓度-1 cm-1 或其他任何方法（例如 Bradford 法19）。每毫克蛋白加入2单位凝血酶，并将蛋白溶液在4℃下透析过夜 4 °C 用 NiNTA 洗脱体积的 50 倍体积的 TBS 进行置换。
      注意：测定蛋白质浓度时应选择正确的空白对照，因为咪唑在280 nm处有强吸收。
    4. 将蛋白溶液通过已平衡的NiNTA树脂，以去除未切割的蛋白。接着，向柱中加入与样品等体积的含10 mM咪唑的TBS，以回收所有已切割的蛋白。为清洗柱子，用250 mM咪唑洗脱残留的所有蛋白。通过SDS-PAGE分析样品图1).
    5. 以 4,000 × g 离心力在 4 ℃ 下每隔 10 分钟浓缩蛋白溶液至 4 ml 4 °C 使用离心超滤装置进行浓缩。每次间隔后混合浓缩的蛋白质，以防止沉淀和聚集。尽管已进行混合操作，此步骤中重组PPEP-1仍偶尔出现少量沉淀。
      1. 将浓缩的蛋白质样品加入预先用TBS缓冲液平衡的尺寸排阻色谱柱中，4-6 °C用 TBS 缓冲液洗脱柱子，收集 1 ml 组分并进行后续处理 5 µl 每第二个组分进行SDS-PAGE分析。rPPEP-1洗脱为单一峰，对应于单体（图2偶尔可在较高分子量处观察到一个小峰（前沿峰），对应于蛋白质的二聚体。每升培养液应获得约50 mg纯蛋白。通过SDS-PAGE分析所有样品18 (图2).

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图2：重组PPEP-1蛋白的代表性凝胶过滤层析及SDS-PAGE分析。使用Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，含200 mM NaCl）在6 °C条件下，通过(16/600)柱对纯化的无标签rPPEP-1进行凝胶过滤层析（A280；280 nm处的吸光度）。根据洗脱体积，rPPEP-1的迁移行为符合22 kDa蛋白的预期，表明其主要以单体形式存在。偶尔会出现一个较小的前置峰，对应于二聚体形式。（插图）凝胶过滤层析各馏分的SDS-PAGE分析结果（M：分子量标记物）。每两个馏分取一个上样。主rPPEP-1条带下方的微弱条带对应于偶尔出现的少量杂质。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 采用微晶接种法进行结晶与晶体优化

注意：rPPEP-1 在结晶过程中始终产生严重重叠的晶体，不适合进行X射线衍射分析（图3）。因此，开发了一种优化策略（图4），以获得高质量晶体（图5）。

  1. 使用商业筛选试剂盒对rPPEP-1进行初筛
    注意：使用标准市售筛选试剂盒和结晶机器人，以悬滴法进行结晶试验。
    1. 使用离心超滤装置，在 4,000 x g 条件下以 5 分钟为间隔将纯化的蛋白质浓缩至 12 mg/ml，并 4 °C每次间隔后混合浓缩蛋白，以防止沉淀和聚集。通过在280 nm处测定吸光度，并利用25,900 M⁻¹cm⁻¹的消光系数确定蛋白浓度。-1 厘米-1 或其他任何方法（例如 Bradford 法）。将蛋白质平衡至 20 °C. 通过离心清除所有颗粒和灰尘，16,000 x g 离心 10 分钟 20 °C.
    2. 使用预先装填并密封后在 4 °C 或向板的储液孔中加满液体 70 µl 每种结晶条件的平衡。将所有结晶板平衡至 20 °C操作需迅速，因为小体积液滴会很快干燥。如果可能，应在机器人操作台周围使用加湿室。
      注意：以下筛选条件作为标准操作程序使用：SaltRx、Index、PEG/Ion、Crystal、Wizard、PACT++、JCSG++。
    3. 通过移液将蛋白质和储液加入2-4号子孔中以设置筛选板。液滴体积为300 nl，比例（蛋白质:储液）分别为200:100（2号子孔）、150:150（3号子孔）和100:200（4号子孔）（单位：nl）。立即密封平板并置于培养室中 20 °C.
    4. 设置后立即检查托盘，随后在第一周内每天检查一次，之后改为每周检查一次。
  2. rPPEP-1与配体的共结晶
    1. 将 rPPEP-1（24 mg/ml）与底物肽溶液（Ac-EVNPPVPD-NH₂）按体积比 1:1 混合，其中肽溶液摩尔浓度为 rPPEP-1 的 7 倍，用于底物肽-rPPEP-1 复合物的共结晶2) 溶于TBS缓冲液中的冻干粉末，以获得12 mg/ml的r-PPEP-1蛋白终浓度，以及相对于PPEP-1的7倍摩尔过量的多肽。在30分钟内孵育 20 °C 并通过离心在 16,000 x g 条件下离心 10 分钟以去除所有颗粒和灰尘 20 °C采用与未结合的r-PPEP-1蛋白相同的微晶接种法进行结晶。

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图3：初筛中获得的代表性晶体。 来自12 mg/ml rPPEP-1的互生晶体，生长条件如下。（A）Crystal screen I/38（1.4 M 柠檬酸三钠三水合物，0.1 M HEPES 钠盐，pH 7.5；200 nl:100 nl）。（B）SaltRx screen/52（2.4 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 8.5；100 nl:200 nl）和（C）（200 nl:100 nl）。（D）SaltRx screen/96（60% v/v Tacsimate，pH 7.0，0.1 M BIS-TRIS 丙烷，pH 7.0；200 nl:100 nl）。比例尺 = 0.2 mm。体积比始终为蛋白:储液。请点击此处查看该图的高清版本。

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图4：rPPEP-1 结晶条件的优化流程。 初始条件下，rPPEP-1 在浓度为 12 mg/ml 时获得的晶体衍射质量较差，且存在多个晶格（共生晶体），随后在包含 24 种条件的优化筛选中重现了该结果。在含有 2.55 M 磷酸氢二铵的条件下，再次仅观察到共生晶体。选取一个单一的共生晶体制备晶种储备液，并按 1:1,000 比例稀释后加入相同条件中（微晶接种法）。取 0.5 µl 稀释后的晶种储备液加入其余澄清液滴中，几乎在所有条件下均生长出单晶。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用微晶接种法优化晶体生长
    注意：在含有2.4 M磷酸氢二铵、0.1 M Tris-HCl（pH 8.5）的条件下（SaltRx筛选板，E4条件，全部三个副孔），两日后出现高度连生的rPPEP-1晶体。图3). 采用在初始条件周围进行网格筛选并结合微晶接种的优化方法（图4).
    1. 制备网格筛图4) 包含24种条件，每种条件含有1.8–2.55 M磷酸氢二铵（以0.15 M为梯度递增）和0.1 M Tris-HCl（pH 7.5–9.0，以0.5 pH单位为梯度递增），由适当储备液（4 M磷酸氢二铵和1 M Tris缓冲液）配制而成。
      注意：使用 Make Tray 小工具（http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx）计算每种条件所需的体积和移液方案，以获得 2 ml 每种条件，可进行 10 次优化筛选。4 M 磷酸铵储备液的配制较为困难，需在搅拌过程中加热溶液，使粉末完全溶解于水中。
    2. 移液器 200 µl 将每种网格筛选溶液加入24孔板的各孔中，并在 20 °C.
    3. 手动设置结晶板。液滴体积为 3 µl 蛋白:储液比例分别为2:1、1.5:1.5和1:2（以 µl）。此处应使用正位移移液器，以避免产生气泡。立即密封培养板并放入加样舱中 20 °C避免气泡形成。
      注意：在含有 2.55 M 磷酸氢二铵和 0.1 M Tris-HCl（pH 7.5 – 9.0）的四种条件下，经过一至四天后出现高度连生的晶体图4在磷酸铵浓度低于2.55 M的其余20种条件下未形成晶体。采用微晶接种法在这些条件下获得rPPEP-1的单晶。
    4. 通过从含有2.55 M磷酸氢二铵和0.1 M Tris-HCl（pH 8.0或8.5）的两种条件之一中收获一颗单一生长的共晶，制备微晶种子储备液。晶体可能附着在塑料表面。使用针灸针小心地变形周围塑料，有助于分离晶体。
      1. 转移 50 µl 将相应母液加入含有一个微小高抛光玻璃珠（用于成核的珠子）的1.5 ml离心管中。使用固定好的尼龙环将晶体转移至 1 µl 置于玻璃盖玻片上的母液。
      2. 将含有晶体的液体转移至离心管中，高速涡旋震荡30秒。取种子储备液与新制备的相同条件溶液按1:1,000比例稀释至另一1.5 ml离心管中，充分涡旋震荡5秒。
        注意：种子库存可在 -80 °C 以备后续使用。
    5. 移除覆盖在 20 种条件透明液滴上的板封，用移液器移取 0.5 µl 将种子液（1:1,000 稀释）加入孔板中。密封孔板并置于培养箱内 20 °C高质量衍射单晶在2至7天内出现（图5).

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图5：优化筛选中获得的代表性晶体。 使用1:1,000稀释的种子储备液对浓度为12 mg/ml的rPPEP-1进行接种，在以下条件下生长出单晶：（A）2.1 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 7.5；1.5 µl:1.5 µl；（B）2.1 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 7.5；2 µl:1 µl；（C）2.25 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 8；2 µl:1 µl；（D）2.1 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 8；1 µl:2 µl。（E）将晶体装载于0.1-0.2 µm尼龙环上，晶体在2.1 M 磷酸氢二铵、0.1 M Tris、pH 8（2 µl:1 µl）条件下生长，并用含20%甘油的2.1 M 磷酸氢二铵、0.1 M Tris、pH 8溶液进行冷冻保护。标尺 = 0.2 mm（A-D）。体积比始终为蛋白质:储液。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 晶体安装与数据收集

注意：为了获得最优质的衍射数据，晶体应在质量和尺寸达到最佳状态时进行安装。晶体可保存在液氮中，直至在100 K条件下进行X射线衍射分析。因此，必须将晶体所处的原始条件调整为适合冷冻的条件。rPPEP-1晶体可通过添加20%甘油或30%蔗糖实现冷冻保护（即用冷冻保护剂替换条件中的水）。

  1. 晶体 mounting
    注意：所有晶体操作步骤均应在体视显微镜下进行。
    1. 选择适合所选晶体最大长度的尼龙环尺寸。rPPEP-1 晶体的典型最长轴约为 100-200 µm (图5）。准备盖玻片和适当的冷冻条件（例如 2.1 M 磷酸氢二铵，0.1 M Tris，pH 8.0，20% 甘油
      1. 将泡沫杜瓦瓶中装满液氮，将冻存管夹持器装入冻存管后置于盛有液氮的800 ml泡沫杜瓦瓶中预冷。将带有合适标识的冷冻套管和冷冻提篮架放入盛有液氮的2 L泡沫杜瓦瓶中。将磁力棒装上固定尼龙环。
        注意：使用液氮时需穿戴防护服（护目镜/眼镜、手套）。将温暖物体浸入液氮可能引起飞溅。
    2. 用锋利的手术刀切开密封膜，并用镊子将其移除。移液 1 µl 将冷冻条件下的液滴转移到盖玻片上（或 alternatively 转移至同一板中的空孔中），然后用已安装的尼龙环捞取晶体并从液滴中取出图5）。附着的晶体可通过针灸针弯曲周围塑料的方式轻松从基质上分离。
      1. 将晶体迅速转移至冷冻保护液滴中，平衡1秒。尽快捞出晶体，投入液氮中进行骤冷冻结。
      2. 当固定在环上的液氮停止沸腾后，将环放入小瓶中。将小瓶置于冷冻提柄架上，当装满6个小瓶后，在提柄架周围套上冷冻套管。将晶体存放在充满液氮的液氮罐中，直至使用。
  2. 数据采集
    注意：数据收集可在实验室自备衍射仪上进行（如有条件），或在同步辐射光束线上完成。rPPEP-1 的数据是在瑞士保罗谢勒研究所（Paul-Scherrer-Institute）Villigen 的瑞士光源（Swiss Light Source）X06DA 光束线处，使用混合光子计数探测器收集的。原始数据及用于结构解析的所有文件可根据要求提供。
    1. 将光束的波长设置为 1.282 Å （9,667 keV），即锌元素的特征X射线吸收边能量（峰值）。rPPEP-1是一种金属蛋白酶，其每个分子的活性位点含有一个锌原子。
    2. 在100 K下以反向光束模式采集数据 10° 楔形物，共计 270° 在每个方向上，曝光时间为 0.1 秒，间隔为 0.1° 每幅图像的旋转角度。将透射率设置为14%（0.14）。
    3. 将波长设置为1.00，以采集来自相同结晶条件所获得的另一颗晶体的原位高分辨率数据集 Å (12,398 keV)。在100 K下收集数据，曝光时间为0.1秒，间隔0.1° 每幅图像的旋转角度。将透射率设为 70%（0.7）。

5. 通过锌单波长反常散射测定结构

注意：为了通过锌单波长反常衍射（zinc-SAD）确定rPPEP-1的结构，需要具备基本的晶体学知识，以及XDS20、Phenix21软件包和Coot22程序。用于结构可视化的软件需使用PyMOL23或Chimera24。在锌元素吸收边峰对应的波长下收集的数据可用于单波长反常散射（SAD）25，以获得相位信息，并进一步扩展至所有蛋白质原子。

  1. 数据处理
    1. 使用软件 XDS（也可选用 iMosflm 或 HKL3000）在空间群 P212121（空间群 19）中处理两套衍射数据集（正峰和反峰），并分离弗里德尔对（即保留异常散射数据）。晶胞参数约为 a, b, c (Å) = 43.17, 71.68, 117.70，α = β = γ (°) = 90。该处理将生成两个HKL文件（反射文件）。
    2. 检查 CORRECT.LP 文件。使用数据至 CC1/2 至少为 50% 的分辨率。使用 XSCALE 将两套数据集/反射文件（HKL 文件）合并缩放。检查 XSCALE.LP 文件，查看异常信号的延伸程度（SigAno），并记录异常相关性（Anomal Corr）约为 30% 时的分辨率，在本例中收集数据至 1.67 Å，而异常信号的截断分辨率为 2 Å。该分辨率将作为 Phenix AutoSol 中异常信号使用的截断值。
    3. 使用 XDSCONV 将（已缩放的）HKL 文件转换为 CCP4 格式的反射文件（例如命名为 peak_anom.mtz），生成 5% 的 Rfree 子集，并保留异常数据（FRIEDEL'S_LAW=FALSE）。使用程序 mtzdmp 检查 mtz 文件的一致性，确认晶胞参数、空间群，以及 Rfree 子集（标签为 FreeRflag）和异常数据（标签为 DANO/SIGDANO）的存在。同时，使用 XDSCONV 生成另一份不提取异常数据的 mtz 文件（FRIEDEL'S_LAW=TRUE；例如命名为 peak_native.mtz），用于后续的结构精修。
  2. 亚结构求解（相位确定）
    1. 使用反射文件 peak_anom.mtz 运行 Phenix AutoSol。选择 SAD/MAD 峰作为数据类型，并设定 2 个锌结合位点（因非对称单元中有两个分子）。可选择在同步辐射光束线上通过荧光扫描测定的精确实验 f'/f'' 参数值，或使用理论值 f' = -8.245 和 f'' = 3.887。同时加载包含结晶蛋白氨基酸序列的 FASTA 文件。
    2. 将分辨率上限设为异常相关性（Anomal Corr）约为 30% 的分辨率（由步骤 5.1.2 确定），本例中为 2 Å，并选择“autobuild model”（自动构建模型）选项。利用 Phenix HySS（Phenix AutoSol 流程的一部分）确定的两个锌位点的相位，可推导出整个蛋白的相位，并通过 Phenix RESOLVE 将模型构建到电子密度图中。所得最优模型命名为“overall_best.pdb”。
  3. 模型构建、精修与验证
    1. 选择“autobuild model”选项，以自动构建大部分 rPPEP-1 模型。使用程序 Coot 在 1.0 σ 轮廓水平下检查电子密度（图6）。电子密度应连续且包裹模型中的原子。在分辨率优于 2.5 Å 时，理想情况下还应将部分水分子构建入模型中。分子间的体相水区域应无电子密度。
    2. 检查整个模型是否完整（所有氨基酸残基均已构建入电子密度中）。若不完整，需使用 Coot 提供的工具手动构建。通过迭代运行 Phenix Refine 进行结构精修，每次进行 5 轮精修，使用 overall_best.pdb 模型文件、peak_native.mtz 反射文件和 FASTA 序列文件，并结合在 Coot 中的手动模型构建。
    3. 使用 Coot 中相应的工具验证结构模型的质量。

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图6：Phenix Autosol 运行后 rPPEP-1 的实验电子密度图及模型。 使用程序 Coot 显示的蓝色电子密度图，等高线水平为 1.0 σ。在此初始图谱中，电子密度清晰可辨，模型已构建于电子密度中。放大图显示了 His142 和 Glu189 残基以及一个水分子。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 通过分子置换法进行高分辨率结构测定

注意：为了获得 rPPEP-1 的高分辨率结构信息，需收集一套天然状态的数据集。随后使用 Phenix 软件包中的 Phaser26,27 软件，以锌-SAD 方法解析的结构作为模型，进行分子置换。该方法后续也可用于求解 rPPEP-1 与小分子复合物的结构。

  1. 为了获得更高分辨率的晶体结构（本例中高达 1.4 Å），使用软件 XDS（也可选用 iMosflm 或 HKL3000）在空间群 P212121（空间群 19）下处理天然数据集。晶胞参数应约为 a, b, c (Å) = 43.17, 71.77, 117.80，α = β = γ (°) = 90。此步骤生成一个 HKL 文件（反射文件）。
  2. 检查文件 CORRECT.LP。使用数据至 CC1/2 至少为 50% 的分辨率。使用 XDSCONV 将 HKL 文件转换为 CCP4 格式的反射文件（例如命名为 native.mtz），并创建 5% 的 Rfree 子集。使用程序 mtzdmp 检查 mtz 文件的一致性，确认晶胞参数、空间群以及 Rfree 子集的存在（标签为 FreeRflag）。
  3. 准备包含此前确定的 overall_best.pdb 模型的 PDB 文件，并移除所有水分子和所有配体（i.e. 锌原子）。同时加载包含结晶蛋白氨基酸序列的 FASTA 文件。在 Phenix 中运行 Phaser，使用反射文件 native.mtz，搜索每个不对称单元中的两个分子。
  4. 在成功解出结构后（TFZ 分数大于 8；本例中为 10.2），在 Coot 中检查模型（命名为 native_phaser.1.pdb）和电子密度图。通过交替运行 Phenix Refine（每次进行 5 轮精修）和在 Coot 中进行手动模型构建，对结构进行迭代式构建与精修，使用 native_phaser.1.pdb 模型文件、native.mtz 反射文件和 FASTA 序列文件。
  5. 使用 Coot 中相应的工具验证结构模型的质量。

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结果

rPPEP-1 在多种 E. coli 菌株中均呈现过表达，其中在 E. coli BL21 (DE3) Star 中产量最高（图 1C）。经过第一次 NiNTA 亲和层析后，6xHis 标签可从大部分蛋白中成功切除；在第二次 NiNTA 层析步骤中，未消化的蛋白可与凝血酶消化后的蛋白完全分离（图 1D）。在 S200 16/600 柱上，去标签的 rPPEP-1 以单体形式迁移，偶尔出现前延峰，很可能对应二聚体物种（图 2A）。该蛋白纯度高（图 2B），每升 E. coli 培养液可获得约 50 mg 蛋白。rPPEP-1 在多种条件下均可结晶（图 3），晶体中常含有磷酸盐。所有条件下的晶体均高度重叠生长，因此必须进行晶体优化。图 4 展示了源自商业筛选条件 SaltRx E4 (52)（图 3B-C...

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讨论

X射线晶体学仍然是测定蛋白质三维近原子分辨率结构最快且最准确的方法28。然而，该方法需要生长出高度有序的单晶，而这类晶体往往难以获得，且晶体状态本身属于人为条件。尽管如此，将X射线晶体学测定的蛋白质结构与其他方法（尤其是核磁共振，NMR）测定的结构进行比较，通常显示出非常好的一致性。以PPEP-1为例，最近发表的NMR结构29与我们的晶体结构14高度一致，包括S环的流动性也相符。

本方案描述了用于结构研究的N端带His标签的重组PPEP-1蛋白的表达与纯化，以及无标签重组PPEP-1的结晶与结构解析。本案例中单晶难以生长，需采用特殊的微晶接种方法。在下文中，我们将讨论PPEP-1的研究结果，并说明如何调整该方案以适用于其他任何蛋白的表达与结晶。

载体设计与表达的变异

rPPEP-1 表达为N端带His标签的变体（图1A），因为在结晶时，由于His标签可能影...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

我们感谢瑞士保罗谢勒研究所（Paul-Scherrer-Institute）Villigen 分部瑞士光源（Swiss Light Source）X06DA 光束线的工作人员在同步辐射数据采集过程中提供的支持。我们衷心感谢 Monika Gompert 提供出色的技术支持。本项目得到了科隆大学以及德国研究基金会（German Research Council）资助项目 INST 216/682-1 FUGG 的支持。我们感谢国际研究生院“发育、健康与疾病”（International Graduate School in Development Health and Disease）为 C.P. 提供的博士生奖学金。本研究工作获得了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 283570（BioStruct-X）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基因/载体/细胞株
pET28a 载体Merck-Millipore69864凝血酶可切割的N端His标签
E. coli 菌株 BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003RNase H 缺陷型
针对 E. coli 密码子优化的 PPEP-1 (CD630_28300) 基因Geneart (Thermo Fisher Scientific)custom氨基酸 27-220
名称公司目录编号备注
化学试剂
酵母提取物任意
胰蛋白胨任意
消泡剂BSigma-AldrichA5757水性硅油乳液
琼脂任意
卡那霉素任意
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087缓冲级
NaCl任意缓冲级
DNaseIAppliChemA3778
咪唑AppliChemA1073缓冲级
凝血酶Sigma-AldrichT4648
磷酸氢二铵Sigma-Aldrich215996
甘油 100%任意最纯级
蔗糖Sigma-Aldrich84097
液氮任意用于晶体储存和低温冷却
名称公司目录编号备注
设备（通用）
摇床培养箱任意提供 20 °C - 37 °C 的温度
玻璃器皿任意带挡板的锥形瓶（50 ml - 2.8 L）
大体积培养物离心机任意可处理最大 12 L 体积的离心机
超声破碎仪 Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500或其他任意超声破碎仪/细胞破碎仪
超速离心机任意转速可达 150,000 × g
NiNTA Superflow 树脂Qiagen
空玻璃 Econo-Column 柱Bio-Rad7371007或其他任意空玻璃或塑料柱
尺寸排阻色谱柱 HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
色谱系统 Äkta PurifierGE Healthcare28406264或其他任意色谱系统
透析袋 Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
透析袋封口夹Spectrum Labs132738
超滤装置（浓缩器）10,000 NWCO任意
紫外-可见分光光度计任意
名称公司目录编号备注
设备（晶体学）
低体积移液器 0.1-10 µl任意
正向置换移液器 Microman M10GilsonF148501
结晶机器人任意
96孔结晶板 TTP IQ，含三个蛋白孔TTP4150-05810或其他任意96孔结晶板 
24孔 CombiClover Junior 板Jena BioscienceEB-CJR
Crystal Clear 密封胶带Hampton ResearchHR3-511
硅化玻璃盖玻片Hampton ResearchHR3-225
商用结晶筛选试剂盒：SaltRx、Index、PEG/Ion、CrystalHampton Researchdiverse
商用结晶筛选试剂盒：Wizard、PACT++、JCSG++Jena Biosciencediverse
JBS Beads-for-SeedsJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT（尼龙环）Hampton Researchdiverse环尺寸 0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCap 样品管Hampton ResearchHR4-904
800 ml 冷冻泡沫杜瓦瓶Hampton ResearchHR4-673
2 L 冷冻泡沫杜瓦瓶Hampton ResearchHR4-675
直型样品管夹Hampton ResearchHR4-670
直型磁性 CrystalWandHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 样品管架Hampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane 颜色编码器 - 白色Hampton ResearchHR4-713
手术刀任意
直头微型镊子任意用于操作密封胶带等etc.
针灸针任意例如 药店购买
体视显微镜任意用于检查结晶板和晶体挂载，放大倍数最高达 160X

参考文献

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