方法文章

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

DOI：

10.3791/55022

⸱

2016年12月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脯氨酰-脯氨酰内肽酶-1（PPEP-1）是一种由人类病原体Clostridium difficile分泌的金属蛋白酶，也是具有前景的药物靶点。本文描述了该蛋白的制备及其结构解析所需的全部方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前亟需开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的Clostridium difficile感染。C. difficile金属蛋白酶PPEP-1是未来开发抑制剂以降低该病原体毒力的潜在靶点。为了进行生物物理和结构表征以及抑制剂筛选，需要大量高纯度且具有活性的蛋白。我们已建立了一种高效生产与纯化PPEP-1的实验方案，利用E. coli作为表达宿主，可获得足够数量和纯度的蛋白，满足结晶及结构解析的需求。此外，通过微晶接种技术，可将严重共晶生长的PPEP-1晶体转化为高度有序、适用于X射线衍射分析的单晶。该方法也可用于其他重组蛋白的制备，以及研究产生共晶现象的其他蛋白质的结构。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile 是医院内抗生素相关性腹泻感染的主要病因之一1。这种革兰氏阳性厌氧细菌通过粪-口途径以其孢子形式传播。例如 BI/NAP1/027 等新型“流行性”或“高毒力”菌株在过去十年中导致北美和欧洲的感染病例数和死亡率急剧上升2。C. difficile 相关疾病（CDAD）是一种危及生命的结肠炎症，具有较高的致死率3。其症状范围从腹泻4到假膜性结肠炎5，以及常导致死亡的中毒性巨结肠6。

由于高致病性菌株具有多重耐药性且复发率高，艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的治疗较为困难7。目前的治疗方案包括使用抗生素甲硝唑、非达霉素或万古霉素，对于反复复发的病例则采用粪便微生物群移植。迫切需要新的治疗策略8。目前已取得一定进展，针对艰难梭菌（C. difficile）毒素B的治疗性单克隆抗体贝洛托单抗（Bezlotoxumab）9已成功完成III期临床试验，并已向美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）提交上市申请。此外，目前还有多种新型抗生素正处于不同阶段的临床试验中10。

为了开发有效的治疗....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 克隆与载体构建

  1. 使用 NdeI 和 XhoI 限制性酶切位点，将 C. difficile PPEP-1 去除信号肽后的密码子优化序列（E. coli 优化，氨基酸 27-220，以下称为重组 PPEP-1（rPPEP-1）11）克隆至 pET28a 载体中（图1），并在 3'-端加入终止密码子（所得载体为 pET28a-NHis-rPPEP-1）。该构建体可表达带有 N 端 6×His 标签的蛋白（NHis-rPPEP-1），并包含凝血酶切割位点，以便在纯化过程中去除标签（图1）。该质粒含有卡那霉素抗性盒用于筛选。克隆所用引物已在其他文献中描述14。

质粒图谱、蛋白表达载体、SDS-PAGE凝胶分析、蛋白纯化步骤。
图1：pET28a-NHis-rPPEP-1载体的示意图及蛋白表达与各纯化步骤的SDS-PA....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rPPEP-1 在多种 E. coli 菌株中均呈现过表达，其中在 E. coli BL21 (DE3) Star 中产量最高（图 1C）。经过第一次 NiNTA 亲和层析后，6xHis 标签可从大部分蛋白中成功切除；在第二次 NiNTA 层析步骤中，未消化的蛋白可与凝血酶消化后的蛋白完全分离（图 1D）。在 S200 16/600 柱上，去标签的 rPPEP-1 以单体形式迁移，偶尔出现前延峰，很可能对应二聚体物种（图 2A）。该蛋白纯度高（图 2B），每升 E. coli 培养液可获得约 50 mg 蛋白。rPPEP-1 在多种条件下均可结晶（图 3），晶体中常含有磷酸盐。所有条件下的晶体均高度重叠生长，因此必须进行晶体优化。图 4 展示了源自商业筛选条件 SaltRx E4 (52)（图 3B-C.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X射线晶体学仍然是测定蛋白质三维近原子分辨率结构最快且最准确的方法28。然而，该方法需要生长出高度有序的单晶，而这类晶体往往难以获得，且结晶状态本身属于人为条件。尽管如此，将X射线晶体学测定的蛋白质结构与其他方法（尤其是核磁共振，NMR）测定的结构进行比较，通常显示出非常好的一致性。以PPEP-1为例，最近发表的一项NMR结构29与我们的晶体结构14高度吻合，包括S环的流动性也一致。

本方案描述了用于结构研究的N端His标签重组PPEP-1蛋白的表达与纯化，以及无标签重组PPEP-1的结晶与结构解析。本案例中单晶难以生长，需采用特殊的微晶接种方法。在下文中，我们将讨论PPEP-1的研究结果，并说明如何调整该方案以适用于其他任何蛋白的表达与结晶。

载体设计与表达的差异

rPPEP-1 以 N 末端带 His 标签的变体形式表达（图 1A），因为在结晶过程中，.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢瑞士保罗谢勒研究所（Paul-Scherrer-Institute）Villigen 分部瑞士光源（Swiss Light Source）X06DA 光束线的工作人员在同步辐射数据采集过程中提供的支持。我们衷心感谢 Monika Gompert 提供出色的技术支持。本项目得到了科隆大学以及德国研究基金会（German Research Council）资助项目 INST 216/682-1 FUGG 的支持。我们感谢国际研究生院“发育、健康与疾病”（International Graduate School in Development Health and Disease）为 C.P. 提供的博士生奖学金。本研究工作获得了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 283570（BioStruct-X）的经费支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基因/载体/细胞株
pET28a 载体Merck-Millipore69864凝血酶可切割的N端His标签
E. coli 菌株 BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003RNase H 缺陷型
针对 E. coli 密码子优化的 PPEP-1 (CD630_28300) 基因Geneart (Thermo Fisher Scientific)custom氨基酸 27-220
名称公司目录编号备注
化学试剂
酵母提取物任意
胰蛋白胨任意
消泡剂BSigma-AldrichA5757水性硅油乳液
琼脂任意
卡那霉素任意
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087缓冲级
NaCl任意缓冲级
DNaseIAppliChemA3778
咪唑AppliChemA1073缓冲级
凝血酶Sigma-AldrichT4648
磷酸氢二铵Sigma-Aldrich215996
甘油 100%任意最纯级
蔗糖Sigma-Aldrich84097
液氮任意用于晶体储存和低温冷却
名称公司目录编号备注
设备（通用）
摇床培养箱任意提供 20 °C - 37 °C 的温度
玻璃器皿任意带挡板的锥形瓶（50 ml - 2.8 L）
大体积培养物离心机任意可处理最大 12 L 体积的离心机
超声破碎仪 Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500或其他任意超声破碎仪/细胞破碎仪
超速离心机任意转速可达 150,000 × g
NiNTA Superflow 树脂Qiagen
空玻璃 Econo-Column 柱Bio-Rad7371007或其他任意空玻璃或塑料柱
尺寸排阻色谱柱 HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
色谱系统 Äkta PurifierGE Healthcare28406264或其他任意色谱系统
透析袋 Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
透析袋封口夹Spectrum Labs132738
超滤装置（浓缩器）10,000 NWCO任意
紫外-可见分光光度计任意
名称公司目录编号备注
设备（晶体学）
低体积移液器 0.1-10 µl任意
正向置换移液器 Microman M10GilsonF148501
结晶机器人任意
96孔结晶板 TTP IQ，含三个蛋白孔TTP4150-05810或其他任意96孔结晶板 
24孔 CombiClover Junior 板Jena BioscienceEB-CJR
Crystal Clear 密封胶带Hampton ResearchHR3-511
硅化玻璃盖玻片Hampton ResearchHR3-225
商用结晶筛选试剂盒：SaltRx、Index、PEG/Ion、CrystalHampton Researchdiverse
商用结晶筛选试剂盒：Wizard、PACT++、JCSG++Jena Biosciencediverse
JBS Beads-for-SeedsJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT（尼龙环）Hampton Researchdiverse环尺寸 0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCap 样品管Hampton ResearchHR4-904
800 ml 冷冻泡沫杜瓦瓶Hampton ResearchHR4-673
2 L 冷冻泡沫杜瓦瓶Hampton ResearchHR4-675
直型样品管夹Hampton ResearchHR4-670
直型磁性 CrystalWandHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 样品管架Hampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane 颜色编码器 - 白色Hampton ResearchHR4-713
手术刀任意
直头微型镊子任意用于操作密封胶带等etc.
针灸针任意例如 药店购买
体视显微镜任意用于检查结晶板和晶体挂载，放大倍数最高达 160X

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epid....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

X Tris pH

相关文章