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活体成像研究紫杉烷耐药性乳腺癌中微管动态不稳定性

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DOI：

10.3791/55027

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2017年2月20日

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

本文内容

摘要

本文中，我们报告了一种描述的实验方案 体内 测定多西他赛耐药乳腺癌细胞（MCF-7）中微管动态不稳定性的一种方法TXT). 在该方法中，采用去卷积显微成像系统检测目标细胞中GFP-微管蛋白的表达。

摘要

紫杉烷类药物（如多西他赛）属于一类常用于治疗癌症的微管靶向药物（MTAs）。然而，癌细胞对紫杉烷类药物产生的耐药性显著降低了这些药物长期使用的疗效。积累的证据表明，紫杉烷耐药的机制既包括一些普遍性机制，例如因药物外排蛋白过表达导致的多药耐药现象，也包括一些紫杉烷特异性机制，例如涉及微管动力学改变的机制。

由于紫杉烷类药物以细胞微管为靶点，测量微管动态不稳定性是确定紫杉烷耐药机制的重要步骤，并有助于理解如何克服这种耐药性。在本实验中，采用了一种体内方法来测定微管动态不稳定性。在MCF-7细胞中表达带有GFP标签的α-微管蛋白，使其整合到微管中，从而可通过高灵敏度相机进行延时成像，记录微管动态变化。结果显示，与非耐药的亲本MCF-7CC细胞不同，多西他赛耐药的MCF-7TXT细胞的微管动态对多西他赛处理不敏感，导致其对多西他赛诱导的有丝分裂阻滞和细胞凋亡产生耐药性。本文将概述这种用于测量微管动态不稳定性的体内方法。

引言

乳腺癌死亡的主要原因是转移1,2。目前，紫杉烷类药物（如多西他赛和紫杉醇）被用作转移性乳腺癌治疗的一线方案2,3,4,5,6。它们属于微管靶向药物（MTAs）的一类，可干扰微管动力学。然而，紫杉烷类药物在根治性治疗中面临的主要挑战之一是癌细胞产生紫杉烷耐药性，从而导致疾病复发7。在转移性乳腺癌患者中，药物耐药性导致的死亡占全部死亡病例的90%以上7。

微管由α-和β-微管蛋白异源二聚体的聚合形成8,9。微管动态的精确调控对多种细胞功能至关重要，包括细胞极性建立、细胞周期进程、细胞内运输以及细胞信号传导。微管及其动态的失调将破坏细胞功能，并导致细胞死亡10,11。根据其引起失调的作用机制不同，微管靶向药物（MTA）可分为微管稳定剂（即紫杉烷类）或微管去稳定剂（即长春碱类或结合秋水仙碱位点的药物）20。尽管这两类药物对微管总量具有相反的作用，但在足够剂量下，它们均可通过影响微管动态而杀死癌细胞21。

紫杉烷类药物主要通过稳定微管纺锤体12，导致染色体错位。随后，纺锤体组装检查点（SAC）持续激活，使细胞停滞在有丝分裂期。长期的有丝分裂阻滞进而引发细胞凋亡13,14。紫杉烷通过与β-微管蛋白上的紫杉烷结合位点相互作用而影响微管8,15，该结合位点仅存在于已组装的微管蛋白中16。

已提出多种紫杉烷耐药的机制9,17这些机制包括由药物外排蛋白过表达引起的广谱耐药性以及紫杉烷类特异性耐药性5,9,18,19例如，紫杉烷类耐药的癌细胞中某些β-微管蛋白异构体的表达和功能可能发生改变5,9,19,20,21,22,23通过使用一种 体内 测量微管动态不稳定性的一种方法表明，与非耐药的亲本MCF-7相比CC 细胞17，多西他赛耐药MCF-7细胞的微管动力学TXT 细胞对多西他赛治疗不敏感。

为了更好地理解微管相关蛋白（MTAs）的功能以及癌细胞中紫杉烷类耐药性的具体机制，测量微管动态性至关重要。本文报道了一种 体内 通过结合活细胞成像与表达GFP标记的微管蛋白的细胞，我们可以测量MCF-7细胞中微管的动力学行为。TXT 和 MCF-7CC 经多西他赛处理与未经处理的细胞。该结果可帮助我们设计出更有效的药物，以克服紫杉烷类耐药性。

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方案

1. 活体成像用细胞的准备

  1. 细胞培养与接种
    1. 使用经选择对多西他赛耐药的 MCF-7 乳腺癌细胞（MCF-7TXT）及其非耐药的亲本细胞系（MCF-7CC）。这些选定细胞系的详细筛选过程及其表征已在先前的研究中描述。24.
    2. 在10 cm培养皿中培养所有细胞 37 °C 由90%的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）和10%的胎牛血清（FBS）组成的培养基中，并添加非必需氨基酸。将培养基维持在5% CO₂环境中。2 大气环境。维持MCF-7TXT 5 nM 多西他赛处理的细胞
    3. 将细胞接种于盖玻片上用于活细胞成像。用70%乙醇冲洗24 mm的聚-L-赖氨酸包被玻璃盖玻片，随后置于紫外线下照射过夜以灭菌。将盖玻片放入35 mm的6孔培养板中，每孔放置一片盖玻片。
    4. 从10 cm培养皿中移除培养基，并用PBS洗涤细胞。向培养皿中加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞从培养皿上脱落。细胞脱落后，向培养皿中加入5 mL培养基以中和胰蛋白酶。
    5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定单位体积内的细胞数量。
    6. 加入约105 根据单位体积的细胞数量，将细胞接种到每个孔中。轻轻摇晃后，将培养板放回培养箱，使细胞贴附在盖玻片上。
  2. 表达GFP标记的α-微管蛋白
    1. 为了检测微管动态，使用带有商业GFP转导对照的GFP标记的α-微管蛋白转导细胞例如， BacMam）按照制造商的说明书进行操作。
    2. 将细胞在培养孔中培养 36 h 37 °C 将细胞置于细胞培养箱中，以促进完全贴壁并达到60%融合度。
    3. 根据以下公式计算每孔所需添加的GFP标记α-微管蛋白的适当体积：
      细胞分析图中GFP-微管蛋白颗粒浓度的体积计算公式
      细胞数量是指标记时孔中细胞的估计总数，而期望的PPC（每个细胞的颗粒数）是指每个细胞所对应的颗粒数量。
      注意：MCF-7 细胞接种后，细胞数量应较初始增加一倍。5 至 2 × 105 目标PPC为20时，每张盖玻片所需的体积因此为 40 µL对于不同的细胞，基于上述公式计算出的体积可能并非最佳。应根据GFP-微管蛋白的实际表达水平调整精确体积。
    4. 将GFP标记的α-微管蛋白反复倒置混匀数次，以确保溶液均匀。切勿涡旋。
      注意：对照组使用的空载（对照）试剂不含任何哺乳动物遗传元件，可用于帮助确定潜在的杆状病毒介导效应及背景荧光。也可使用非靶向性GFP转导对照，其可使整个细胞发荧光。
    5. 更换培养基，加入 2 mL 新鲜培养基。 40 µL GFP标记的α-微管蛋白加入各孔中。
    6. 轻轻振荡培养板，使GFP标记的α-微管蛋白与培养基充分混合。将培养板放回培养箱中，孵育24 h，以诱导GFP-微管蛋白的表达。
  3. 用多西他赛处理细胞
    注意：本实验旨在检测多西他赛对微管动态不稳定性的影响。因此，细胞将用所需浓度的多西他赛进行处理。
    1. 配制一种培养基，其中包含90%的DMEM和10%的FBS，并添加非必需氨基酸。使用不含酚红的DMEM，因为酚红可能干扰GFP-微管蛋白的荧光。加入所需浓度的多西他赛（范围为10 nM至 10 µM）。多西他赛的储备液为二甲基亚砜（DMSO）中10 mM的溶液。
    2. 将含多西他赛的培养基预热至 37 °C 在组织培养孵育箱中。
    3. 将正常培养基更换为含多西他赛的培养基，置于组织培养孵箱中孵育30分钟。每个多西他赛浓度每孔应至少放置3个盖玻片。

2. 活细胞成像检测微管动态不稳定性

  1. 系统设置
    1. 在维持于 37 °C 和 5% CO2 的培养环境中进行实验。使用倒置荧光显微镜系统，配备 60X、1.42 NA 油镜物镜和 CCD 相机，通过延时成像采集荧光图像。
    2. 准备用于活细胞成像的细胞。将样品支架和培养基预先加热至 37 °C。选择待观察的盖玻片。将步骤 1.3.1 中制备的含多西他赛培养基 1 mL 加入所选盖玻片，并将其安装到样品支架上进行孵育。
  2. 微管动态不稳定的活细胞成像
    1. 确定用于成像的细胞。所选细胞应形态扁平，表达的 GFP-微管蛋白荧光强度高，并具有清晰的微管结构。
    2. 从步骤 2.2.1 筛选出的细胞中选择一个首先进行观察。聚焦于该细胞的周边区域。设置图像采集的曝光时间和采集频率。通常曝光时间为 0.5 s，因此每 2 s 采集一次图像。
    3. 为完成步骤 1.33 至 2.2.3 预留额外 20 分钟。因此，在加入多西他赛后精确达到 50 分钟时（如步骤 1.3.3 所述），开始成像（以实现标准化）。
    4. 持续记录微管动态 2 分钟，每 2 s 拍摄一张照片。对选定细胞共采集 60 张图像。
    5. 移动至下一个已选定的细胞，并重复步骤 2.2.2 至 2.2.4。重复此过程，直至完成 5 个细胞的成像。必须在加入多西他赛后 70 分钟内完成该过程（如步骤 1.3.3 所述）。
    6. 针对每种处理条件，重复步骤 2.2.1 至 2.2.5，使用 3 个不同的盖玻片。总共成像 15 个细胞，此数据量足以用于测量微管动态不稳定性。

3. 图像处理与数据分析

  1. 图像去卷积
    1. 对采集的图像进行去卷积处理以获得高质量图像。打开显微镜系统配备的去卷积程序。
    2. 点击“处理”并选择“反卷积”。将图像文件拖入“输入”窗口，然后点击“执行”。图像文件将进行反卷积处理，反卷积后的文件将自动保存为新文件。
  2. 视频生成
    1. 单击反卷积图像文件，使用配备的软件打开。
    2. 单击“文件”，然后选择“另存为电影”。将“电影格式”设为“AV”，将“动画样式”设为“正向”。将“压缩质量”设为“100%”，将“帧率”设为“5/秒”。
    3. 勾选“通过时间动画”选项，然后点击“执行”。视频将被生成。
  3. 微管缩短与生长速率的测量
    1. 确定用于测量的微管。对于每个细胞，只有少数微管能够被清晰且完整地追踪其缩短或生长过程。
    2. 检查视频的每一帧，以确定显示微管起始长度的帧以及微管伸长或缩短最显著的帧。测量两帧间微管长度的变化及对应的时间间隔。
    3. 通过将长度变化除以时间来计算生长或缩短速率（单位为 µm/s每种处理条件下，至少追踪10个细胞，并测量至少20条微管。
    4. 计算每种处理条件的平均值和标准误。使用学生 t 检验分析各条件间的统计学差异。以表格和/或图表形式报告数据。

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结果

利用本实验方案，我们研究了多西他赛对正常（MCF-7CC）和多西他赛耐药（MCF-7TXT）乳腺癌细胞微管动态的影响。两组图像展示了多西他赛（0.5 µM）对MCF-7CC和MCF-7TXT细胞中微管生长与缩短的影响（图1A）。

我们还计算了这两种细胞系在这些条件下微管生长或缩短的速率，并表明在 0.5 µM，多西他赛强烈抑制 MCF-7 的微管蛋白动态CC 细胞，但不包括MCF-7TXT 细胞（图1B).

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讨论

测量微管动态不稳定的两种主要方法是体外（in vitro）和体内（in vivo）。在体外（in vitro）方法中，使用纯化的微管蛋白，通过计算机增强的延时微分干涉差显微镜技术来观察微管的动态不稳定性。在体内（in vivo）方法中，将显微注射的荧光标记微管蛋白或表达的GFP-微管蛋白掺入微管中，然后利用高灵敏度相机对间期细胞周边区域的微管动态（生长和缩短）进行延时成像记录10,20,25。尽管已有多种类型的显微镜被用于此目的，但我们在此报道的实验方案采用的是去卷积显微镜。

体内动态不稳定性仅发生在微管的正端（β-微管蛋白向外的一端），而负端（α-微管蛋白向外的一端）长度保持不变26另一方面，对于组装的微管 体外微管两端均发生动态不稳定性，其...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由CBCF资助（资助对象：ZW）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Sigma-AldrichD5796
非必需氨基酸Life Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）Life Technologies, Invitrogen15240-062
多西他赛Sigma-Aldrich01885-5mg-F
无酚红DMEM培养基Gibco, Invitrogen21063
CellLight 试剂 *BacMam 2.0* GFP-微管蛋白ThermoFisher ScientificC10613用于在细胞中表达GFP标记的微管蛋白的关键试剂
CellLight 试剂 *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383对照
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich+B9:AA9472301用于溶解多西他赛
22 mm 玻璃盖玻片Fisher Scientifics12-545-101
6孔细胞培养板Greiner Bio-One International6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision 显微成像系统GE Health该系统配备环境控制装置，可调节温度和CO₂浓度，同时配备Worx软件用于去卷积和延时成像控制。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红ThermoFisher Scientific25200056
Bright-Line 血细胞计数板套装，Hausser ScientificHausser Scientific, 由VWR分销供应商编号：1492，VWR编号：15170-172

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