活体成像研究紫杉烷耐药性乳腺癌中微管动态不稳定性

摘要

本文中，我们报告了一种描述的实验方案 体内 测定多西他赛耐药乳腺癌细胞（MCF-7）中微管动态不稳定性的一种方法_TXT). 在该方法中，采用去卷积显微成像系统检测目标细胞中GFP-微管蛋白的表达。

摘要

紫杉烷类药物（如多西他赛）属于一类常用于治疗癌症的微管靶向药物（MTAs）。然而，癌细胞对紫杉烷类药物产生的耐药性显著降低了这些药物长期使用的疗效。积累的证据表明，紫杉烷耐药的机制既包括一些普遍性机制，例如因药物外排蛋白过表达导致的多药耐药现象，也包括一些紫杉烷特异性机制，例如涉及微管动力学改变的机制。

由于紫杉烷类药物以细胞微管为靶点，测量微管动态不稳定性是确定紫杉烷耐药机制的重要步骤，并有助于理解如何克服这种耐药性。在本实验中，采用了一种体内方法来测定微管动态不稳定性。在MCF-7细胞中表达带有GFP标签的α-微管蛋白，使其整合到微管中，从而可通过高灵敏度相机进行延时成像，记录微管动态变化。结果显示，与非耐药的亲本MCF-7_CC细胞不同，多西他赛耐药的MCF-7_TXT细胞的微管动态对多西他赛处理不敏感，导致其对多西他赛诱导的有丝分裂阻滞和细胞凋亡产生耐药性。本文将概述这种用于测量微管动态不稳定性的体内方法。

引言

乳腺癌死亡的主要原因是转移^1,2。目前，紫杉烷类药物（如多西他赛和紫杉醇）被用作转移性乳腺癌治疗的一线方案^2,3,4,5,6。它们属于微管靶向药物（MTAs）的一类，可干扰微管动力学。然而，紫杉烷类药物在根治性治疗中面临的主要挑战之一是癌细胞产生紫杉烷耐药性，从而导致疾病复发⁷。在转移性乳腺癌患者中，药物耐药性导致的死亡占全部死亡病例的90%以上⁷。

微管由α-和β-微管蛋白异源二聚体的聚合形成^8,9。微管动态的精确调控对多种细胞功能至关重要，包括细胞极性建立、细胞周期进程、细胞内运输以及细胞信号传导。微管及其动态的失调将破坏细胞功能，并导致细胞死亡^10,

方案

1. 活体成像用细胞的准备

1. 细胞培养与接种
   1. 使用经选择对多西他赛耐药的 MCF-7 乳腺癌细胞（MCF-7_TXT）及其非耐药的亲本细胞系（MCF-7_CC）。这些选定细胞系的详细筛选过程及其表征已在先前的研究中描述。²⁴.
   2. 在10 cm培养皿中培养所有细胞 37 °C 由90%的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）和10%的胎牛血清（FBS）组成的培养基中，并添加非必需氨基酸。将培养基维持在5% CO₂环境中。₂ 大气环境。维持MCF-7_TXT 5 nM 多西他赛处理的细胞
   3. 将细胞接种于盖玻片上用于活细胞成像。用70%乙醇冲洗24 mm的聚-L-赖氨酸包被玻璃盖玻片，随后置于紫外线下照射过夜以灭菌。将盖玻片放入35 mm的6孔培养板中，每孔放置一片盖玻片。
   4. 从10 cm培养皿中移除培养基，并用PBS洗涤细胞。向培养皿中加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞从培养皿上脱落。细胞脱落后，向培养皿中加入5 mL培养基以中和胰蛋白酶。
   5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定单位体积内的细胞数量。
   6. 加入约10⁵ 根据单位体积的细胞数量，将细胞接种到每个孔中。轻轻摇晃后，将培养板放回培养箱，使....

结果

利用本实验方案，我们研究了多西他赛对正常（MCF-7_CC）和多西他赛耐药（MCF-7_TXT）乳腺癌细胞微管动态的影响。两组图像展示了多西他赛（0.5 µM）对MCF-7_CC和MCF-7_TXT细胞中微管生长与缩短的影响（图1A）。

我们还计算了这两种细胞系在这些条件下微管生长或缩短的速率，并表明在 0.5 µM，多西他赛强烈抑制 MCF-7 的微管蛋白动态_CC 细胞，但不包括MCF-7_TXT 细胞（图1B).

讨论

测量微管动态不稳定的两种主要方法是体外（in vitro）和体内（in vivo）。在体外（in vitro）方法中，使用纯化的微管蛋白，通过计算机增强的延时微分干涉差显微镜技术来观察微管的动态不稳定性。在体内（in vivo）方法中，将显微注射的荧光标记微管蛋白或表达的GFP-微管蛋白掺入微管中，然后利用高灵敏度相机对间期细胞周边区域的微管动态（生长和缩短）进行延时成像记录^10,20,25。尽管已有多种类型的显微镜被用于此目的，但我们在此报道的实验方案采用的是去卷积显微镜。

体内动态不稳定性仅发生在微管的正端（β-微管蛋白向外的一端），而负端（α-微管蛋白向外的一端）长度保持不变²⁶另一方面，对于组装的微管 体外微管两端均发生动态不稳定性，其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796
非必需氨基酸	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
多西他赛	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
无酚红DMEM培养基	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight 试剂 *BacMam 2.0* GFP-微管蛋白	ThermoFisher Scientific	C10613	用于在细胞中表达GFP标记的微管蛋白的关键试剂
CellLight 试剂 *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	对照
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	用于溶解多西他赛
22 mm 玻璃盖玻片	Fisher Scientifics	12-545-101
6孔细胞培养板	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision 显微成像系统	GE Health		该系统配备环境控制装置，可调节温度和CO₂浓度，同时配备Worx软件用于去卷积和延时成像控制。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line 血细胞计数板套装，Hausser Scientific	Hausser Scientific, 由VWR分销	供应商编号：1492，VWR编号：15170-172