尽管增殖性多倍体细胞对于分析多倍体细胞的染色体不稳定性是必需的，但从非转化的人类细胞中构建此类细胞并不容易。本报告描述了从正常人成纤维细胞中建立无二倍体细胞群的增殖性四倍体细胞的相对简便的方法。
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摘要
摘要
多倍体（主要是四倍体）细胞常在人体组织的癌前病变中被观察到，其染色体不稳定性被认为与这些组织的癌变过程密切相关。尽管研究多倍体细胞的染色体不稳定性需要增殖性的多倍体细胞，但从非转化的人体细胞中获得此类细胞仍具有较大挑战性。使用化学试剂诱导四倍体化通常会产生二倍体与四倍体细胞的混合群体，大多数研究需依赖荧光激活细胞分选或有限稀释克隆法来分离四倍体与二倍体细胞。然而，这些方法耗时且操作繁琐。本报告介绍了一种相对简便的实验方案，可从正常人成纤维细胞中诱导产生增殖性四倍体细胞，并最大限度减少二倍体细胞的污染。该方案主要包括以下步骤：利用秋水仙胺（DC）将细胞阻滞于有丝分裂期，通过轻摇收集处于有丝分裂期的细胞，将收集的细胞在含DC的培养基中继续孵育3天，随后将细胞转入无药物培养基中继续培养（细胞将在数天内恢复增殖，并表现为四倍体细胞）。根据细胞类型的不同，轻摇收集有丝分裂期细胞的步骤可能可以省略。本方案为从正常人成纤维细胞建立增殖性四倍体细胞提供了一种简单且可行的方法。通过该方法建立的四倍体细胞可作为研究染色体不稳定性及人类多倍体细胞致癌潜能的有用模型。
引言
多倍体现象不仅在哺乳动物物种的特化组织中被观察到，也在多种病理条件下出现，例如癌症和退行性疾病。在人类组织的癌前病变（如巴雷特食管）中，经常可观察到多倍体（主要是四倍体）细胞。 1,2 或宫颈鳞状上皮内病变 3,4，并被认为是有丝分裂异常细胞在这些组织中的来源 5,6尽管有研究表明四倍体细胞向非整倍体细胞的转化可能是肿瘤发生早期的关键事件，但这一过程所涉及的机制尚未完全阐明。这在一定程度上是因为目前尚无 体外 已有模型表明，非转化的多倍体人类细胞能够增殖。
一些研究人员通过抑制细胞质分裂产生双核细胞，从而在非转化的人上皮细胞中诱导出四倍体7-9。然而，在该方法中，必须通过荧光激活细胞分选（FACS）7,8 或有限稀释克隆法9去除不必要的二倍体细胞。由于这些操作步骤繁琐且不易实施，因此该研究领域迫切需要更简便的方法来建立非转化的四倍体细胞。
本报告中，我们描述了一种通过相对简单的步骤，从正常人成纤维细胞或端粒酶永生化人成纤维细胞建立增殖性四倍体细胞的实验方案。该方法利用纺锤体毒剂脱秋水仙碱（DC）将二倍体细胞阻滞在有丝分裂期，通过振荡收集处于有丝分裂期的细胞后，进一步用DC处理。经DC长时间处理的二倍体有丝分裂细胞可转化为四倍体G1期细胞，去除药物并经历数天的生长停滞后，这些细胞能够以四倍体状态持续增殖。该方案为建立研究染色体不稳定性与多倍体人细胞致癌潜能之间关系的有用模型提供了高效的方法。
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方案
1. 细胞培养
- 获取用于诱导四倍体化的细胞。迄今为止已证实，该技术可应用于人成纤维细胞系 TIG-1、BJ、IMR-90 以及端粒酶永生化的 TIG-1（TIG-hT）。
- 将细胞培养于添加了 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（含 α 修改成分）或其他适合待研究细胞类型的细胞培养基中，在 37 °C、5%（v/v）CO2 的环境中孵育。每 3 至 4 天传代一次，避免细胞密度超过亚融合状态。
注意：每次传代时应计算群体倍增水平（PDL），以评估细胞生长状态和细胞年龄。PDL 可根据接种到培养皿中的细胞数量（N1）和下一次传代时收获的细胞数量（N2）通过以下公式计算得出（X 为初始 PDL）。PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. 从二倍体成纤维细胞诱导并建立四倍体细胞
- 不通过振落诱导四倍体。
注意：某些细胞株（例如 TIG-1）可通过连续使用去甲秋水仙碱（DC）处理，几乎完全转变为四倍体。- 在诱导四倍体前一天，将细胞传代至一个或两个100 mm培养皿中。通常，准备5 × 10⁶个细胞5 至 1 × 106 每皿细胞数用于诱导四倍体细胞。
- 用含0.1 µg/mL DC的培养基处理对数生长期的细胞，持续4天。
- 更换为不含 DC 的培养基，并将细胞在 5%（v/v）CO₂ 的培养箱中孵育2 在37 °C的培养条件下，细胞通常在1周内恢复增殖。
- 通过振落法诱导四倍体
注意：由于上述（2.1）中所述的DC简单处理，大多数细胞会变为二倍体和四倍体群体的混合物。因此，有必要对步骤进行如下修改，以消除二倍体群体（图1).- 处理前一天将细胞传代至多个T75培养瓶中以诱导四倍体化。通常，准备至少5 x 106 细胞（1 × 106 每瓶细胞数）以诱导四倍体细胞的产生。
- 用含有 0.1 µg/mL DC 的培养基处理处于对数生长期的细胞，处理 16–18 小时以使细胞停滞在有丝分裂期。使细胞停滞在有丝分裂期所需的时间可能因靶细胞类型而异，应通过预实验确定，以获得尽可能多的有丝分裂期细胞。例如，生长较慢的细胞所需的 DC 处理时间应长于生长较快的细胞。
注意：如果此步骤中处理时间过长，细胞可能发生有丝分裂滑脱并贴附于培养皿表面，导致下一步无法通过振摇法收集有丝分裂期细胞。 - 采用振摇法收集处于有丝分裂阻滞的DC细胞，即通过轻轻振摇培养瓶，收集松散贴壁的有丝分裂期细胞，用培养基冲洗后离心（300 × g，5分钟）。此步骤中应采用适当方法计数细胞数量。
- 将收集的有丝分裂细胞重新接种至60 mm培养皿中，并用0.1 µg/mL DC处理细胞额外3天。接种细胞数量超过1 x 106 每皿有丝分裂细胞，因为仅有不到10%的细胞能够存活于该处理条件下。
- 将含DC的培养基更换为不含药物的培养基，等待细胞恢复增殖，通常在1周内发生。
- 传代细胞与原始二倍体细胞相似。
3. DNA 倍性分析
注意：这是一项成熟的方法，详细步骤和技术提示请参考技术手册。
- 收获细胞（5 × 105 - 1 × 106通过在37 °C下用含有0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的溶液孵育细胞10分钟以消化细胞，随后用含10% FBS的培养基中和胰蛋白酶。
- 将细胞连同培养基一起离心，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬洗涤，随后离心（300 × g，5分钟）。
- 通过以下两种方法之一制备用于DNA分析的细胞
- 一种用于分析未固定的细胞的方法10
注意：本方法可使用市售的细胞周期分析试剂盒进行。采用本方法制备的样品应立即进行分析，因为该操作步骤中细胞未经过固定，染色后的细胞核会随着时间推移而受损。- 用含250 mM蔗糖的40 mM柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞。随后在室温下用250 µL含0.1% (v/v) Nonidet P40和30 µg/mL胰蛋白酶的200 µL含250 mM蔗糖的40 mM柠檬酸盐缓冲液处理细胞10分钟。
- 在含有250 mM蔗糖的40 mM柠檬酸盐缓冲液中加入200 µL浓度为0.5 µg/mL的胰蛋白酶抑制剂和0.1 µg/mL的RNase A，室温孵育细胞10分钟。
- 加入200 µL含250 mM蔗糖的40 mM柠檬酸盐缓冲液中配制的0.4 mg/mL碘化丙啶（PI），室温孵育细胞10分钟，以染色细胞核。
- 一种用于分析固定细胞的方法
- 用80%乙醇固定细胞：将细胞重悬于1 mL PBS中，边混合细胞悬液边逐滴加入4 mL 100% EtOH，室温放置30分钟。固定后的细胞可在-20 °C保存数周。
- 将细胞重悬于5 mL PBS中洗涤，随后离心（300 × g，5 min）。用0.5 mg/mL RNase A和50 µg/mL碘化丙啶（PI）处理细胞（加入475 µL 0.5 mg/mL RNase A和25 µL 1 mg/mL PI），室温避光孵育30 min。
- 一种用于分析未固定的细胞的方法10
- 使用配备488 nm激光器和红色通道发射滤光片（长通）的流式细胞仪分析细胞的DNA含量 > 610 nm）。同时分析由真实二倍体细胞制备的参考样品，以评估目标细胞的倍性。
- 或者，加入荧光标准微球以评估二倍体细胞的荧光强度比 与 微珠。使用流式细胞仪的“脉冲高度 vs. 脉冲宽度”选项来区分单个四倍体细胞与二倍体细胞团块11.
4. 染色体计数与核型分析的检测
注意：这些均为成熟的标准操作流程，具体操作步骤和技术提示请参考技术手册或制造商提供的操作方案。
- 用 0.1 µg/mL 的 DC 处理对数生长期的细胞 4 小时，以将细胞阻滞在中期。
- 制备染色体玻片。
- 收获细胞（至少 5 x 105 通过胰蛋白酶消化法收集细胞，并悬浮于含胎牛血清（FBS）的培养基中。
- 将细胞连同培养基一起离心（300 × g，5 分钟），并在 37 °C 下用低渗溶液（5 mL 0.075 M KCl）处理 10 分钟。
- 用卡诺固定液（甲醇:乙酸 = 3:1）固定并悬浮细胞。
- 将细胞悬液少量（25 - 35 µL）滴加到玻璃载片上以铺展细胞。可能需要额外步骤，例如暴露于热蒸汽，以改善染色体铺展效果。
- 对细胞进行染色以进行染色体计数、核型分析或多重荧光检测 原位 多重荧光原位杂交（mFISH）
- 染色体计数
- 用5%吉姆萨染液（或含0.5 mg/mL RNase A的5 µg/mL PI溶液用于荧光显微镜观察）染色15–20分钟。
- 至少对50个中期细胞进行数字化拍照。
- 使用图像分析软件对经过图像编辑软件手动分离的接触和重叠染色体进行每细胞染色体计数。尽管染色体数目可人工计数，但建议采用计算机辅助计数。
- 核型分析
注意：该分析应由经过培训的技术人员或专业公司进行。- 根据标准的G显带技术对细胞进行染色12.
- 分析染色体以制备标准核型图12.
- mFISH
注意：此步骤为可选操作，必要时应执行。- 根据制造商方案，使用人染色体多重荧光原位杂交（FISH）探针对细胞进行染色13.
- 使用配备合适滤光片的荧光显微镜及mFISH分析软件进行染色体分析13.
- 染色体计数
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结果
根据我们的经验，TIG-1 细胞通过 0.1 µg/mL DC 连续处理 4 天即可几乎完全转变为四倍体（图 2A）。相比之下，其他成纤维细胞株，如 BJ 或 IMR-90 细胞，以及 TIG-hT 细胞，在相同处理条件下会形成二倍体与四倍体细胞的混合群体，因此需要在 DC 处理过程中（通常在处理开始后 16 - 18 小时）采用振落法分离有丝分裂细胞（图 2B、C）。在继续使用 DC 处理 3 天后，细胞进入生长停滞状态，并在数天内表现出体积增大、扁平化的形态特征。通常在一周内，大量扁平细胞中开始出现少量增殖性细胞（图 3）。DC 处理后 2 - 3 周，细胞几乎完全转变为四倍体。大多数已建立的四倍体细胞株的众数染色体数目为 92，仅有一株由 TIG-hT 细胞建立的四倍体细胞系在多数细胞中染色体数目为 91（图 4）。已建立的四倍体细胞的生长速率与二倍体细胞几乎相同（图 5）。由非永生化细胞建立的四倍...
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讨论
通过化学试剂（无论是细胞质分裂抑制剂还是纺锤体抑制剂）诱导二倍体细胞产生四倍体时，一个主要问题是细胞常常成为二倍体与四倍体细胞的混合群体，因此必须将四倍体细胞从二倍体细胞中分离出来。目前分离不含二倍体细胞的四倍体细胞群体最常用的方法是荧光激活细胞分选（FACS）或有限稀释克隆。然而，这些方法操作繁琐且不易实施。在本报告中，我们提出一种新方案，可从正常人成纤维细胞中建立不含二倍体细胞群体的增殖性四倍体细胞。该方案利用纺锤体毒物DC使二倍体细胞停滞于有丝分裂期，再通过振摇法将停滞的有丝分裂细胞从贴附于培养皿表面的二倍体间期细胞中分离出来。收集的细胞再用DC处理额外3天，通过这种长期DC处理，二倍体有丝分裂细胞可能通过检查点适应（亦称有丝分裂逃逸）转化为四倍体G1期细胞。在药物去除后经过数天的生长停滞，这些细胞以四倍体细胞的形式重新开始细胞增殖。
该方法的一个优势在于，与采用FACS或克隆技术分离四倍体细胞的方法相比，其操作步骤相对简单且可行。该方法的局限性如下：目前尚不清楚该方法是否适用于成纤维细胞以外的其他细胞类型（如上皮细胞），这有待未来研究进一步验证。在某些情况下，可能会残留少量...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢松本女士提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| 去甲秋水仙碱溶液（10 μg/mL，溶于HBSS） | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTEST Plus DNA 试剂盒 | BD Biosciences | #340242 | 用于通过流式细胞术检测DNA倍性 |
| 人类染色体多色FISH探针24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | 进行mFISH分析需配备专用滤光片组和软件 |
| 配备mFISH 软件 的Isis成像系统 | MetaSystems | 需配备专用探针试剂盒 |
参考文献
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