蜜蜂及其他昆虫的腹部背血管起到类似于哺乳动物心脏的功能，在营养物质运输、废物清除、免疫功能等方面发挥着重要作用。本文介绍了一种用于观察和进行药理学操控蜜蜂心率的实验方案。
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摘要
摘要
欧洲蜜蜂（Apis mellifera L.）是一种重要的农业和商业资源，以其产蜜能力和为农作物提供授粉服务而著称，同时也是研究记忆与学习、衰老等过程的重要社会性昆虫模型。本文介绍了一种详细的蜜蜂背腹部体壁解剖方案，以观察其作为昆虫心脏功能的背血管。成功的解剖可暴露出具有功能的心脏，在适当条件下，该心脏可长时间维持稳定的搏动。这使得研究者可通过向背血管施加心脏调节化合物来调控心率。使用数字显微镜或配备数字相机的显微镜，研究者可在施加待测化合物前后对背血管进行视频记录。随后，用户可在方便的时间对视频进行分析，以确定处理后心率以及心跳模式的变化。本方案的优点在于设备成本较低、易于掌握、所需空间和仪器少，且操作耗时极短。
引言
本方法学的总体目标是使研究人员能够快速、简便地观察和量化药理学试剂对蜜蜂心率的影响。蜜蜂与其他昆虫一样，具有开放式的循环系统，可将血淋巴（即昆虫的血液等效物）分散至整个体腔，该体腔称为血腔。血淋巴的循环对于营养物质、免疫因子、代谢废物以及神经激素和其他信号分子的运输至关重要1。循环由背血管推动，背血管沿昆虫背部中线延伸，并辅以附属搏动器官。背血管分为两个功能不同的部分：腹部部分称为心脏，胸部和头部部分称为大动脉。心脏的传导性收缩将血淋巴泵向胸部和头部，而附属搏动器官则确保血淋巴流向各末端结构。
根据昆虫的体型、生理特征或发育阶段，可采用多种方法观察其心脏功能。观察幼虫或小型昆虫心率的常用方法是活体成像2。然而，该方法在成年蜜蜂中的应用价值有限，因为难以透过腹部壁清晰观察到背血管。一种已建立的方法是接触式热成像技术，可用于记录包括蜜蜂在内的多种昆虫的心率，该技术利用贴附在昆虫体表的热敏电阻检测心脏搏动3,4。成年蜜蜂的心率也可通过电生理技术测量电阻抗信号来记录4,5。该技术需要将电极插入动物体内心脏附近，并使用阻抗转换器记录心跳信号4。类似地，心电图技术已被用于检测心脏产生的电信号，并结合蜜蜂的视频记录以观察心脏活动的变化6。这些方法的一个显著优势在于，心率是在完整、存活的蜜蜂个体中进行评估，而非解剖后的标本，这有助于确保受试个体具备完整的生理反应能力。这些方法面临的挑战包括需考虑实验对象的固定或麻醉影响、需要控制可能改变心率的外界变量和刺激，以及在测试药理学试剂时确定合适的给药方式。
另一种用于研究蜜蜂心脏活动的方法是部分解剖昆虫以暴露心脏，然后使用力-位移换能器测量背血管的收缩7。在本实验方案中，心脏持续用流动的生理盐水灌注，测试化合物可溶解于该溶液中并施加于受试样本7。该方法与前述方法的一个显著区别在于腹神经索被移除，从而消除了中枢神经系统在调节心率方面所起的作用5。其结果是，原本通常极为不规则的基础心率会稳定下来，其频率和振幅均显著低于活体昆虫中通常观察到的水平5,7。这些方法的共同之处在于，实施时不仅需要高度专业且往往昂贵的设备，还需要具备一定的专业技术水平。或许最大的缺点是，这些方法均不太适用于需要检测大量样本的实验，例如对可能具有心脏调节作用的化合物库进行筛选。
本文所述方法的最大优势在于其简便性。该方案相对容易掌握，实验装置占用空间小，且仅需极少的资金投入。该方法所需材料不过是一些蜜蜂、几件外科手术器械、一种等渗溶液，以及一台数码显微镜或配备数码相机的传统显微镜。通过解剖蜜蜂以观察其背血管，并利用数字视频记录给药前后的心率变化。尽管实际观察心率变化并不必须进行视频录制，但视频记录将显著提高实验通量（即，在特定时间内可处理的样本数量）。研究者可通过一次性录制大量视频，随后在更合适的时间进行分析评分，从而最大化实验效率。该方法的另一优势在于，若评分过程被打断，研究者可随时重新开始；同时，视频记录也有助于观察者在不知晓处理分组的情况下进行盲法评估，从而减少偏倚。
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方案
1. 受试对象的采集与制备
- 从蜂群中采集所需数量的蜜蜂。
注意：所需蜜蜂数量不仅取决于实验的规模和范围，还取决于操作人员的技术水平。例如，若实验包含2个处理组，每组需要10只蜜蜂，则技术较为熟练的操作人员可能需要至少采集30只蜜蜂，以弥补解剖失败的情况，最终获得20段可用于评分的有效视频。 - 尽量缩短采集与解剖之间的时间间隔。
注意：尽管蜜蜂可在实验室中饲养数天后再进行解剖，但观察发现，蜜蜂离开蜂群后在实验室中饲养的时间越长，解剖成功率（即解剖后背血管保持稳定心率的可能性）越低。- 在实验室饲养期间，应为蜜蜂提供水源和食物。例如，至少应提供50%（w/v）的蔗糖水溶液（适用于不足6小时的短期饲养）；对于更长时间的饲养，应提供蜂蜜供蜜蜂取食。
- 若需在实验室中过夜饲养，应将环境温度控制在约32 °C、相对湿度60–80%，以减少蜜蜂应激并防止脱水。
- 在解剖前，应对蜜蜂进行短暂麻醉以方便操作。
注意：此步骤可能降低解剖成功率并减少处理通量。- 可通过将蜜蜂置于冰上或冰箱中短暂冷却，使其活动减弱，从而便于操作。
- 或者，可短暂暴露于CO2中以辅助操作。
注意：长时间低温处理会降低解剖成功率；长时间或反复暴露于CO2同样会降低解剖成功率。
2. 背侧腹壁的解剖
注意：蜜蜂在解剖时应保持存活状态。
- 使用镊子和/或显微解剖剪，去除蜜蜂的腿和翅膀，以便于解剖腹部。在解剖过程中，准备一个小烧杯或类似的容器，盛装蒸馏水，用于在每次解剖之间冲洗器械。
- 用镊子固定蜜蜂，使用显微解剖剪沿腹部背壁的第一和第二背板之间横向剪开（见图1）。
图1：蜜蜂腹部背侧视图。 初始切口应位于第一与第二背板之间，如红线所示。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 用镊子轻轻夹住第二背板的后缘，沿蜜蜂身体两侧从初始切口纵向剪至螫针处（见图2）。剪切时需小心，避免刺破胃肠道。
图 2：蜜蜂腹部的侧面观。 第二和第三次切口应沿腹部两侧进行，如红线所示。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将剪刀更换为第二把精细镊子，用其小心地将背腹部壁与腹部其余部分分离。轻轻移除毒刺以及仍附着在背腹部壁上的任何胃肠道组织。避免刺破肠道，因为其内容物可能覆盖腹部壁，影响对背血管的观察。
图3：背血管的观察。 移除肠道和螫针后，可在解剖的背腹壁中线处观察到背血管。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将背侧腹壁置于显微镜下所需的方向，使背血管清晰可见（见图3）。使用显微解剖剪去除任何妨碍观察背血管的多余腹壁组织。当背侧腹壁正确放置时，其形状应类似于一个浅杯或碗状。
- 由于背血管并不延伸至蜜蜂最末端的腹节，因此去除最后一节背板以改善背血管的可视性。
- 使用可调体积微量移液器，在背血管上覆盖10 µl等渗溶液，以维持生理条件并促进心跳稳定。
注意：推荐使用四分之一浓度的林格氏液（0.120 g/L 氯化钙、0.105 g/L 氯化钾、0.050 g/L 碳酸氢钠和2.250 g/L 氯化钠），该溶液已被证实可维持稳定且持续的心跳。
3. 心率的观察与调控
- 让背血管保持静止，直至出现稳定且持续的心跳（通常在300秒内）。
注意：心跳表现为背血管的节律性收缩。最初可能看似没有心跳，尤其是蜜蜂经过麻醉后，但心脏通常在等渗溶液中静置数分钟后会恢复搏动，并可在溶液持续浸泡的条件下维持搏动数小时。 - 以每分钟心跳次数（BPM）为单位测量心率。
- 记录在60秒时间段内观察到的收缩次数。使用手持计数器和计时器以方便此过程。
- 通过记录使用心脏调节化合物前后观察到的每分钟心跳次数（BPM），测量心率的变化。
注意：尽管观察心率变化所需的时间可能因被测化合物的不同而有所差异，但心率的变化通常在数分钟内即可观察到。- 在加入任何测试化合物之前，立即测定基础心率。
注意：处理后的心率通常可在 90 至 120 秒后测定。 - 制备潜在的心脏调节剂（例如， 通过将化合物溶解于用于灌注背血管的相同等渗溶液中来施加章鱼胺（octopamine）。
- 使用微量移液器将待测化合物加入 dorsal vessel 周围的溶液中。
- 在加入任何测试化合物之前，立即测定基础心率。
- 为提高准确性和通量，应对每位受试者进行视频录制，随后通过回放视频来测定心率。
注意：这允许单个研究人员错开解剖时间，以便几乎连续地生成视频。录制视频时，建议最短时长约为 240 秒，并在第 60 秒时加入待测化合物。这可确保研究人员有 60 秒的时间段用于记录基础心率，随后在处理后 120 秒处再有 60 秒的时间段用于记录处理后的心率。
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结果
由于许多可能通过本方案测试的药理活性化合物在水中不溶，因此需要一种可靠的溶剂，以便通过用于灌注背血管的等渗溶液递送待测化合物。二甲基亚砜（DMSO）是一种常用于在动物体内递送实验药物及其他化合物的溶剂8，并且已在研究杀虫剂对蜜蜂心脏活动影响的实验中成功应用9。因此，本研究选择DMSO作为向背血管递送待测化合物的潜在载体，但需首先验证其是否具有心脏调节活性。在本方案中，先将分离的背血管置于10 µl四分之一浓度的任氏液中孵育，随后在添加待测化合物前测定心率。待测化合物以已知浓度溶于10 µl DMSO中，再加入四分之一浓度的任氏液进行递送，然后观察背血管心率的后续变化。
在测试任何化合物之前，需先检测不同浓度的DMSO对心率的影响，以不含DMSO的四分之一强度林格氏液作为对照。将DMSO以0.2%、2%、10%和20%（v/v）的浓度溶解于四分之一强度林格氏液中，以便在等体积加入已灌流背血管的溶液后，终浓度分别...
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讨论
本文所述方案提供了一种简单有效的方法，用于检测药理学化合物对蜜蜂心率的影响。如先前实验所观察到的，无论是切断活体昆虫的腹神经索5，还是在暴露背血管时将腹神经索解剖移除7，中枢神经系统调控的丧失均会导致心跳频率稳定且较低。这种低频心跳使得研究者能够通过肉眼直接评估心率，而无需依赖精密或昂贵的仪器。已有研究表明，溶剂DMSO可在低浓度下用于溶解药理学试剂，并通过等渗溶液灌流背血管进行给药。此外，本方法中可使用无脊椎动物神经调质章胺来加快心率，此前已有研究证实章胺在蜜蜂中具有促心脏加速作用7。尽管该方案设计初衷是用于测量心率变化，但也可用于观察其他更为定性的搏动特征，例如收缩模式的改变。无论所关注的终点指标为何，该方案主要依赖于研究者完成干净、快速解剖的能力。使用本方案时最常见的挑战是解剖失败，其结果是所分离的腹壁无法使用，原因可能是无心跳，或背血管不可见。
由于解剖操作不当，背血管可能很容易被遮挡。刺破或撕裂肠道会导致肠内容物溢出到腹壁上，通常表现为黄色或棕色的排泄物，与灌流液混合后会遮蔽背血管。尽管可以用等渗溶液冲洗腹...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Jeffrey Bloomquist 博士和 Daniel Swale 博士提供的技术意见和建议。本项目部分由弗吉尼亚理工学院昆虫学系及农业与生命科学学院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dino-Lite Edge 数字 USB 显微镜 | Dino-Lite | AM4815ZT | 任何数字显微镜或类似装置均可满足要求 |
| 显微镜支架 | Dino-Lite | RK-10 | 适用于该数字显微镜的任意支架均可 |
| 笔记本电脑或台式机 | 数字显微镜必需设备 | ||
| 显微解剖剪刀（Vannas 型，8 cm，直型，5 mm 刀头） | World Precision Instruments | 14003 | 任何适用于显微解剖的类似剪刀均可满足要求 |
| 显微解剖镊子，10.2 cm，弯型（2 把） | World Precision Instruments | 504482 | 任何适用于显微解剖的类似镊子均可满足要求 |
| 1/4 浓度 Ringers 溶液片剂 | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| 解剖托盘 | 任何适用于显微解剖的操作表面均可 | ||
| 单通道 10 µl 移液器 | 任何能够精确移取 10 µl 体积的设备均可 | ||
| 移液器吸头 | |||
| 小型烧杯或盛水容器 | 用于在不同样本间冲洗器械 | ||
| 手动计数器 | Office Depot | 295033 | 任何类似产品均可满足要求 |
| 计时器 | Office Depot | 644219 | 任何类似产品均可满足要求 |
| 去离子水 | 用于配制 Ringers 溶液及冲洗器械 |
参考文献
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重印与许可
