本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。
本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。
胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）具有生成多种细胞类型的潜能，这为再生医学领域开辟了新的途径。然而，尽管这些细胞具有诸多优势，ESCs 和 iPSCs 的致瘤性长期以来一直是其临床应用的主要障碍。有趣的是，已有研究表明，ESCs 可分泌多种可溶性因子，能够促进组织再生并延缓细胞衰老，提示 ESCs 和 iPSCs 也可作为无细胞干预手段加以利用。因此，如何获得小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），同时最大限度减少血清成分（胎牛血清，FBS）和饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）的污染，已成为迫切需求。本文展示了一种在无血清且无饲养层条件下收集 mESC-CM 的优化方法，并利用与细胞衰老相关的多种检测指标对 mESC-CM 进行表征。该实验方案将提供一种在无血清和无饲养层污染的情况下，纯化收集 mESC 特异性分泌因子的方法。
本实验方案的目的是从无血清且无饲养层的培养条件下收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），并对其生物学功能进行表征。
一般来说，由于胚胎干细胞（ESCs）具有多能性和自我更新能力，因此在再生医学和细胞治疗方面具有巨大潜力1-3。然而，干细胞的直接移植存在多种局限性，例如免疫排斥和肿瘤形成4,5。因此，无细胞治疗方法可能为再生医学和抗衰老干预提供一种替代性治疗策略6,7。
衰老被视为组织和器官老化的细胞对应状态，其特征是永久性的生长停滞、细胞生理状态改变以及行为变化。老化是多种常见疾病的主要风险因素，包括癌症、心血管疾病、2型糖尿病和神经退行性疾病8。老化的一个显著特征是组织再生潜能的下降，这由干细胞的老化和耗竭所导致9。许多重要研究表明，某些药物分子（如雷帕霉素9、白藜芦醇10和二甲双胍11）以及血液中的系统性因子（即GDF1112）具有持续延缓老化进程并延长寿命的能力。
在本研究中，收集小鼠胚胎干细胞条件培养基（mESC-CM）时未使用血清（胎牛血清，FBS）和饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs），以排除血清因子及MEFs分泌因子的污染。这些条件使得....
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注意：血清和饲养层细胞无CM收集方案的示意图见图1。
1. 材料（MEF 的制备、培养基、培养板和溶液）
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最初，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在含有胎牛血清（FBS）及其他补充成分的mESC培养基中，以MEF饲养层进行维持培养（图1A 和 图2A）。条件培养基（CM）则从小鼠胚胎干细胞在无饲养层、无FBS及其他补充成分的低血清培养基中收集获得（图1B 和 图2B）。该培养条件使我们能够收集到特异于mESCs的条件培养基，避免了饲养层、FBS或其他补充成分来源因子的潜在污染。对照培养基则在相同培养条件下但不含有mESCs的情况下收集。
mESCs 在两种培养基中的形态不同：i) 正常 mESC 培养条件（图 2A）和 ii) 无血清且无饲养层的培养条件（图 2B）。在正常 mESC 培养条件下，mESC 克隆生长在 MEF 层上，呈椭圆形且具有光泽的外观（<.......
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为了成功收集无血清且无饲养层的mESC-CM，应考虑以下建议。最关键的因素是使用早期传代的mESC来收集mESC-CM。此前已有研究表明，与晚期传代的mESC相比，早期传代的mESC-CM具有更佳的抗衰老效果。已有报道指出，mESC的传代次数会影响其发育潜能16和多能性17。
尽管仍需进一步研究以分析mESC分泌组中诱导抗衰老效应的具体因子，但目前我们可以得出结论：mESC-CM足以在细胞水平上降低衰老程度。
鉴定能够将衰老细胞逆转为年轻细胞的小鼠胚胎干细胞（mESC）特异性分泌因子，对未来的研究至关重要。对于分泌分子的高质量分析（如抗体芯片15和分泌组分析），在培养基收集过程中的洗涤步骤（步骤3）尤为关键。若洗涤步骤操作不当，分泌分子将被胎牛血清（FBS）成分污染18,19。
在无血清且无饲养层的培养条件下，孵育时间（24小时）对于培养基收集过程（步骤3）非常关键，因为更长的孵育时间.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的基础科学研究中心项目（2013R1A1A2060930）和医学研究中心项目（2015R1A5A2009124）资助，上述项目由韩国科技、信息通信及未来规划部提供资金支持。本研究还得到了多伦多病童医院的启动运营资助（H. K. Sung）。我们衷心感谢Laura Barwell和Sarah J. S. Kim在修改本稿件过程中提供的出色帮助，同时感谢Dr. Andras Nagy提供了G4小鼠胚胎干细胞系。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%，胚胎干细胞级 |
| 青霉素和链霉素 | Invitrogen | #15140 | 50 单位/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素 |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-巯基乙醇 | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| 白血病抑制因子 | Millipore | #ESG1107 | 100 单位/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | 3.70% |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma | #D4551 | |
| 铁氰化钾 | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| 亚铁氰化钾 | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| 丝裂霉素 C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| 碘化丙啶 | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV 逆转录酶 | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR 主混合液 | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs，NHDF-Ad-Der-成纤维细胞 | LONZA | #CC-2511 | |
| 瓶顶滤器 | Corning | #430513 | 0.2 μm |
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