无血清无饲养层小鼠胚胎干细胞条件培养基的收集：一种无细胞方法

摘要

本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。

摘要

胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）具有生成多种细胞类型的潜能，这为再生医学领域开辟了新的途径。然而，尽管这些细胞具有诸多优势，ESCs 和 iPSCs 的致瘤性长期以来一直是其临床应用的主要障碍。有趣的是，已有研究表明，ESCs 可分泌多种可溶性因子，能够促进组织再生并延缓细胞衰老，提示 ESCs 和 iPSCs 也可作为无细胞干预手段加以利用。因此，如何获得小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），同时最大限度减少血清成分（胎牛血清，FBS）和饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）的污染，已成为迫切需求。本文展示了一种在无血清且无饲养层条件下收集 mESC-CM 的优化方法，并利用与细胞衰老相关的多种检测指标对 mESC-CM 进行表征。该实验方案将提供一种在无血清和无饲养层污染的情况下，纯化收集 mESC 特异性分泌因子的方法。

引言

本实验方案的目的是从无血清且无饲养层的培养条件下收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），并对其生物学功能进行表征。

一般来说，由于胚胎干细胞（ESCs）具有多能性和自我更新能力，因此在再生医学和细胞治疗方面具有巨大潜力^1-3。然而，干细胞的直接移植存在多种局限性，例如免疫排斥和肿瘤形成^4,5。因此，无细胞治疗方法可能为再生医学和抗衰老干预提供一种替代性治疗策略^6,7。

衰老被视为组织和器官老化的细胞对应状态，其特征是永久性的生长停滞、细胞生理状态改变以及行为变化。老化是多种常见疾病的主要风险因素，包括癌症、心血管疾病、2型糖尿病和神经退行性疾病⁸。老化的一个显著特征是组织再生潜能的下降，这由干细胞的老化和耗竭所导致⁹。许多重要研究表明，某些药物分子（如雷帕霉素⁹、白藜芦醇¹⁰和二甲双胍¹¹）以及血液中的系统性因子（即GDF11¹²）具有持续延缓老化进程并延长寿命的能力。

在本研究中，收集小鼠胚胎干细胞条件培养基（mESC-CM）时未使用血清（胎牛血清，FBS）和饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs），以排除血清因子及MEFs分泌因子的污染。这些条件使得能够获得无血清且无饲养层的条件培养基，从而准确定位小鼠胚胎干细胞特异性的分泌因子。

本方案效率高、成本相对较低且易于操作。该技术有助于阐明小鼠胚胎干细胞衍生的可溶性因子的特性，这些因子可介导抗衰老效应，未来或可用于开发安全且具有潜在优势的无细胞治疗方法，以干预衰老相关疾病及其他再生医学治疗。

方案

注意：血清和饲养层细胞无CM收集方案的示意图见图1。

1. 材料（MEF 的制备、培养基、培养板和溶液）

1. 准备500 ml用于培养MEF的培养基。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS，胚胎干细胞级）、50单位/ml青霉素和50 mg/ml链霉素。
2. 按照既定的常规方案¹³从胚胎中分离MEF，并在MEF培养基中维持培养。
3. 准备500 ml用于培养小鼠胚胎干细胞（mESC）的培养基。在DMEM中添加15% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM非必需氨基酸（NEAA）、100 µM β-巯基乙醇、100单位/ml白血病抑制因子（LIF）、50单位/ml青霉素和50 mg/ml链霉素。
4. 通过将5 ml 0.1%明胶溶液涂布于10 cm细胞培养皿中，制备明胶包被的培养板（每1块mESC培养板需准备5块明胶包被板）。室温孵育至少10分钟。
5. 准备500 ml低血清培养基，用于mESC的无血清培养条件。在低血清培养基中加入1.2 g碳酸氢钠（pH 7.0），并通过0.2 µm瓶顶滤器过滤。
6. 制备衰老相关β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色液以检测衰老细胞：1 mg/ml X-gal（溶于二甲基甲酰胺DMF）、40 mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液（pH 6.0）、5 mM铁氰化钾、5 mM亚铁氰化钾、150 mM NaCl和2 mM MgCl₂¹⁴。
   注意：（危险）DMF为有毒且具腐蚀性的溶液。操作时应穿戴个人防护装备（例如，腈类或乳胶手套、实验服和护目镜），并在通风橱中使用。
7. 准备500 ml用于培养人真皮成纤维细胞（HDF，NHDF-Ad-Der-Fibroblast）的培养基。在DMEM中添加10% FBS、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。

2. 小鼠胚胎干细胞的培养（图1A和2A）

注意：所有步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行。

1. 在15 cm细胞培养皿中，加入20 ml含有10 µg/ml丝裂霉素C的MEF培养基处理MEF细胞。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
2. 吸除MEF细胞的培养基，用PBS洗涤细胞三次。加入3 ml胰蛋白酶-EDTA（TE，1×），于37 °C、5% CO₂条件下孵育3分钟。3分钟后，加入6 ml MEF培养基中和TE，以300 × g离心3分钟。
3. 用5 ml MEF培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定所得细胞悬液中的细胞数量。将失活的MEF细胞（饲养层）以每10 cm细胞培养皿2 × 10⁶个细胞的密度接种于MEF培养基中。于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
4. 接种饲养层24小时后（次日），将MEF培养基更换为mESC培养基。
5. 将mESC细胞（G4 F1杂交ES细胞）以每皿2 × 10⁶个细胞的密度接种至饲养层上，并加入mESC培养基。于37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。
   注意：使用较低传代次数的mESC细胞时，mESC-CM的抗衰老效应可能更强^15-17。本研究所用G4 mESC细胞系由加拿大安大略省多伦多市奥德街25号，西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所Dr. Andras Nagy提供，邮编M5T 3H7。
6. 保持细胞相对较高的密度，于70–80%汇合状态进行传代。每天更换新鲜的mESC培养基。

3. 收集无血清且无饲养层的条件培养基（图1B和2B）

注意：所有步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行。

1. 用 5 ml PBS 清洗 mESC 培养板。加入 1 ml TE（2.5×），在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 3 分钟。3 分钟后，加入 2 ml mESC 培养基中和 TE，并在 300 × g 条件下离心 3 分钟。
2. 用 5 ml mESC 培养基重悬细胞，将 1 ml 细胞悬液接种至每个明胶包被的培养皿中（1 个 mESC 培养板接种 5 个明胶化培养皿），置于 mESC 培养基中培养。在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养至细胞融合度达到 80–85%。
3. 用足量 PBS 清洗 mESC（每 10 cm 培养皿使用 8 ml），每次清洗 10 分钟，共清洗三次。在低血清培养基中于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
   注意：清洗步骤对于防止 FBS 污染至关重要。必须严格遵守孵育时间^18,19。
4. 将 mESC-CM 收集至 50 ml 锥形管中，在 2,500 × g 条件下离心 20 分钟。离心后收集上清液（CM），并通过 0.2 µm 瓶顶滤器过滤。

4. 小鼠胚胎干细胞条件培养基（mESC-CM）的作用

注意：通过多种方法验证了 mESC-CM 的作用，例如 SA β-半乳糖苷酶染色实验、细胞周期分析和定量反转录 PCR（qRT-PCR）。

1. SA β-半乳糖苷酶检测（图3A）
   1. 将人真皮成纤维细胞（HDFs）以每孔2 × 10⁴ 个细胞的密度接种于6孔板中，加入HDF培养基，于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
   2. 过夜培养后，弃去一半HDF培养基，分别加入mESC-CM和对照培养基，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养72小时。对照培养基来源于未接种mESCs的明胶包被培养皿中的无血清培养基（Reduced Serum Media）。
   3. 用足量PBS（每孔6孔板加2 ml）洗涤细胞，每次30秒，共洗两次。加入3.7%多聚甲醛（PFA）进行固定，室温孵育5分钟。
      注意：（危险）多聚甲醛为有毒且具腐蚀性的溶液，操作时需穿戴个人防护装备（例如，腈类或乳胶手套、实验服和护目镜），并在通风橱中操作。
   4. 吸除固定液，按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤固定后的细胞两次。
   5. 每孔加入1–2 ml SA β-半乳糖苷酶染色液，于37 °C孵育17.5小时。
      注意：不可在含CO₂的培养箱中孵育。
   6. 吸除SA β-半乳糖苷酶染色液，按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤细胞两次。
   7. 加入伊红溶液进行复染，室温孵育5分钟，再按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤细胞两次。
   8. 使用光学显微镜在100倍放大下观察细胞，并通过连接的数码相机采集图像以供后续分析。
      注意：可采用盲法计数总细胞数，并计算SA β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞所占百分比。
2. 细胞周期分析（图3B）
   1. 将HDFs以每6 cm细胞培养皿8 × 10⁴ 个细胞的密度接种于HDF培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
   2. 过夜培养后，弃去一半HDF培养基，分别加入mESC-CM和对照培养基，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养24小时。
   3. 按照步骤3.1所述方法进行胰酶消化，300 × g离心5分钟。用冷PBS溶液（含0.5 mM CaCl₂和2% FBS的PBS，每1.5 ml离心管加1 ml）洗涤细胞两次，每次2,500 × g离心3分钟。最后将细胞重悬于100 µl冷PBS溶液中。
   4. 在涡旋振荡的同时逐滴加入200 µl冷乙醇以固定细胞，4 °C保存至少1小时。
   5. 按照步骤4.2.3所述方法，用冷PBS溶液洗涤细胞两次。
   6. 将细胞重悬于250 µl含50 µg/ml RNase的柠檬酸钠缓冲液（1.12%，pH 8.5）中，37 °C孵育30分钟。
   7. 加入250 µl含50 µg/ml碘化丙啶的柠檬酸钠缓冲液，室温孵育20分钟。
   8. 使用流式细胞术²⁰检测每个样品中的10,000个细胞。
3. qRT-PCR（图3C）
   1. 按照步骤4.1.1和4.1.2所述方法接种HDFs并加入mESC-CM。
   2. 根据试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒从HDFs中提取总RNA，并使用分光光度计²¹对提取的总RNA进行定量。
   3. 根据制造商说明书²⁰，将1 µg总RNA加入含oligo (dT)引物和M-MLV逆转录酶的20 µl反应体系中，合成cDNA。
   4. 使用Green PCR预混液和特异性基因引物（补充表1），在实时荧光定量PCR仪上检测cDNA扩增情况。以GAPDH表达水平作为内参进行数据归一化。PCR程序如下：95 °C预变性10分钟；95 °C 15秒、55 °C 20秒、72 °C 35秒，共45个循环；熔解曲线阶段：95 °C 15秒、60 °C 1分钟、95 °C 30秒、60 °C 5秒¹⁵。

结果

最初，mESC 在含有 FBS 及其他补充成分的 mESC 培养基中，于 MEF 饲养层上进行培养（图 1A 和 图 2A）。CM 是从无饲养层、无 FBS 及其他补充成分的低血清培养基中培养的 mESC 收集而来（图 1B 和 图 2B）。该培养条件使我们能够收集到特异于 mESC 的条件培养基，避免了饲养层、FBS 或其他补充成分所释放因子的潜在污染。对照培养基则在相同培养条件下但不含有 mESC 的情况下收集。

mESCs 在两种培养基中的形态有所不同：i) 正常 mESC 培养条件（图 2A）和 ii) 无血清且无饲养层的培养条件（图 2B）。在正常 mESC 培养条件下，mESC 克隆生长在 MEF 层上，呈现出椭圆形且有光泽的外观（

讨论

为了成功收集无血清且无饲养层的mESC-CM，应考虑以下建议。最关键的因素是使用早期传代的mESC来收集mESC-CM。此前已有研究表明，与晚期传代的mESC相比，早期传代的mESC-CM具有更佳的抗衰老效果。已有报道指出，mESC的传代次数会影响其发育潜能¹⁶和多能性¹⁷。

尽管仍需进一步研究以分析mESC分泌组中诱导抗衰老效应的具体因子，但目前我们可以得出结论：mESC-CM足以在细胞水平上降低衰老程度。

鉴定能够将衰老细胞逆转为年轻细胞的小鼠胚胎干细胞（mESC）特异性分泌因子，对未来的研究至关重要。对于分泌分子的高质量分析（如抗体芯片¹⁵和分泌组分析），在培养基收集过程中的洗涤步骤（步骤3）尤为关键。若洗涤步骤操作不当，分泌分子将被胎牛血清（FBS）成分污染^18,19。

在无血清且无饲养层的培养条件下，孵育时间（24小时）对于培养基收集过程（步骤3）非常关键，因为更长的孵育时间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	#11960-044
FBS	Invitrogen	#30044333	20%，胚胎干细胞级
青霉素和链霉素	Invitrogen	#15140	50 单位/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素
L-谷氨酰胺	Invitrogen	#25030	2 mM
非必需氨基酸（NEAA）	Invitrogen	#11140	100 µM
β-巯基乙醇	Sigma	#M3148	100 µM
白血病抑制因子	Millipore	#ESG1107	100 单位/ml
OPTI-MEM	Invitrogen	#22600
X-gal	Sigma	#B4252	1 mg/ml
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148	3.70%
二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma	#D4551
铁氰化钾	Aldrich	#455946	5 mM
亚铁氰化钾	Aldrich	#455989	5 mM
NaCl	Sigma	#S7653	150 mM
MgCl2	Sigma	#M2393	2 mM
丝裂霉素 C	Sigma	#M4287	10 µg/ml
碘化丙啶	Sigma	#P4170	50 µg/ml
TRIzol	Ambion	#15596018
M-MLV 逆转录酶	Promega	#M170B
Power SYBR Green PCR 主混合液	Applied Biosystems	#4367659
HDFs，NHDF-Ad-Der-成纤维细胞	LONZA	#CC-2511
瓶顶滤器	Corning	#430513	0.2 μm