方法文章

人子宫颈管γδ T细胞的分离与流式细胞术分析

8.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55038

⸱

2017年2月6日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

本文内容

摘要

本文介绍一种分离人子宫颈管上皮内淋巴细胞的方法，用于分析上皮内的γδ T细胞。该方案可通过磁珠或细胞分选技术进一步扩展，以纯化子宫颈管γδ T细胞。

摘要

女性生殖道（FRT）黏膜免疫系统是抵御病原体的第一道防线。因此，深入了解生殖道黏膜对于理解包括HIV在内的多种病原体的致病机制至关重要。γδ（GD）T细胞是“非常规”T细胞的典型代表，是一类相对较少的T细胞亚群，其特征是表达由γ链和δ链组成的异源二聚体T细胞受体（TCRs）。这使得它们不同于经典的、更为人熟知的CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞，后者的特征是表达αβ型TCRs。GD T细胞常表现出组织特异性定位，富集于上皮组织中。GD T细胞在炎症、肿瘤监视、感染性疾病以及自身免疫中协调免疫应答。

本文介绍了一种可重复分离和分析人子宫颈管上皮内γδ T淋巴细胞的方法。我们采用了来自“妇女间HIV感染研究”（Women's Interagency HIV Infection Study, WIHS）项目女性参与者的子宫颈管细胞刷样本。有关γδ T细胞在阴道黏膜受到损伤等条件下相互作用的知识，可应用于任何涉及黏膜易感性问题的临床研究，包括阴道微杀剂的开发。此外，关于黏膜γδ T细胞应答的知识，有望推动基于γδ T细胞的免疫疗法在感染性疾病治疗中的应用。

引言

我们建立了利用宫颈管刷取样本评估上皮内γδ T细胞的方法。宫颈管内壁由单层柱状上皮构成。上皮内淋巴细胞是驻留在上皮层内的前线淋巴细胞，当遇到病原微生物时可迅速启动免疫应答7,8。了解宫颈管上皮内免疫微环境的免疫学事件，对于设计有效的感染预防策略（包括HIV感染）具有重要意义。

我们的方法可用于新鲜采集的人类子宫颈管样本以及冻存的子宫颈管细胞，以进一步探究上皮内γδ T细胞在感染HIV或具有HIV感染风险女性中的作用。本方案的主要目标是发现子宫颈管上皮内 compartment 中的新型免疫学事件，并评估γδ T细胞反应作为HIV感染女性黏膜易感性标志物的价值。

关于女性生殖道免疫的知识存在显著空白，部分原因在于成功采集和处理黏膜样本的难度较大。此外，黏膜免疫细胞具有复杂的异质性，并且彼此之间存在紧密的相互联系，这为确定能够反映免疫系统状态和功能的临床相关指标带来了重大挑战。我们开发了一种方法，可获得高度纯化的上皮内γδ T细胞，并可进一步利用高通量单细胞技术进行分析，这些技术可能对揭示女性生殖道免疫的潜在机制至关重要。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

研究活动在迈阿密大学艾滋病研究单位进行，并与迈阿密妇女艾滋病协作研究项目（WIHS）及迈阿密艾滋病研究中心（CFAR）合作完成。在招募参与者及开展任何评估或与研究相关的操作程序之前，已获得机构审查委员会（迈阿密大学米勒医学院）的批准。

1. 宫颈管刷样本采集

注意：参与者接受了由受过培训的医生或妇科医生进行的阴道检查，并在窥器检查下通过插入细胞刷收集上皮内淋巴细胞。

  1. 参与者特征
    1. 招募年龄在18至45岁之间、性生活活跃、未怀孕、未使用避孕药物且未放置宫内节育器的女性参与者。
    2. 在进行阴道检查前，采集参与者10 mL血液样本至绿色头盖的肝素真空采血管中，用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，作为宫颈管上皮内分析的对照9。
  2. 宫颈管样本的采集
    1. 将适当尺寸的无菌窥器无润滑条件下插入阴道。可用温水润滑以方便插入，并使用无菌纱布清除黏液。窥器的位置应确保宫颈外口及宫颈阴道部完全可视。
    2. 将宫颈管刷插入宫颈管内，直至仅可见靠近手部的刷毛部分。顺时针旋转刷子360°。随后将刷子转移至含有5 mL IMDM培养基的15 mL离心管中。
    3. 样本采集后立即置于冰上。为获得较高活性的上皮内细胞，应在1小时内将细胞刷运送至实验室并完成处理。

2. 宫颈管细胞刷样本处理

  1. 涡旋含有 宫颈管细胞刷的离心管，进行4次短促（10秒）的振荡操作。
  2. 将含有细胞刷的离心管以250 × g离心10分钟。
  3. 小心地从离心管中取出细胞刷（不要扰动管底的沉淀物），加入1 mL IMDM培养基，并将离心管置于冰上。
  4. 将细胞刷放置在置于50 mL离心管上方的100 mm细胞筛网上。
  5. 用20 mL IMDM冲洗细胞刷。
  6. 将离心管以250 × g离心10分钟。
  7. 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于1 mL IMDM中，并与步骤2.3中已重悬的沉淀细胞合并。
  8. 使用自动细胞计数仪10进行细胞计数，或通过将10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝染料混合后使用血细胞计数板进行计数。轻轻吹打混合液上下10次，使细胞与染料充分混匀。取10 µL混合液加入血细胞计数板两个计数室中的任意一个加样口。计数五个网格区域内的所有细胞，分别记录活细胞与死细胞的数量。使用以下公式计算细胞活力：活细胞百分比 =（非活细胞数 / 总细胞数）× 100%。
    使用以下公式计算每毫升的细胞浓度（及总细胞数）：每毫升总细胞数 =（计数的总细胞数 × 稀释倍数 / 计数的方格数）× 10,000 个细胞/mL。
  9. 使用含10% DMSO和90% FBS的冻存液冷冻保存分离的宫颈管细胞。

3. 流式细胞术

  1. 将1-3 × 105个宫颈管细胞重悬于100 μL FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白的PBS）中。
  2. 每106个细胞加入1 μL LIVE/DEAD可固定黄色死细胞染色试剂以及表面标志物抗体，抗体浓度见表1。
  3. 在+4 °C避光孵育30分钟。
  4. 加入1 mL FACS缓冲液，将细胞转移至离心管中，在350 × g离心5分钟。
  5. 将细胞沉淀重悬于300 μL 1%多聚甲醛中。
  6. 使用染色所用的微珠和抗体制备补偿对照：加入100 μL FACS缓冲液、一滴微珠以及与样本染色相同浓度的抗体。
  7. 在配备405 nm、488 nm和635 nm激光器的流式细胞仪上检测染色后的微珠和样本。

4. 子宫颈管γδ T细胞的分离

  1. 磁珠分离
    1. 将2.6节所述的宫颈管细胞沉淀（总细胞数≤107）重悬于40 µL材料与试剂表中所列TCR γδ微珠试剂盒提供的缓冲液中。
    2. 按照试剂盒说明书进行两步染色：首先使用抗TCR γδ半抗原抗体，然后使用抗半抗原微珠-FITC进行染色。
    3. 在4–8 °C孵育15分钟后，加入1 mL缓冲液洗涤细胞，并在300 × g下离心10分钟。 将管子倒置弃去上清液，并借助一张纸轻拍管壁使其干燥。
    4. 将细胞沉淀重悬于500 μL提供的缓冲液中，并根据供应商的方案，将磁性分离柱置于相应的磁性分离器中进行预处理。
    5. 将细胞悬液加至分离柱上，收集未标记细胞的穿流液，并用适量缓冲液（500 µL）洗涤分离柱3次。每次在柱储液腔排空后加入缓冲液，共洗三次。收集全部流出液。此即为未标记的阴性细胞组分。
    6. 将分离柱从磁性分离器上取下，用移液器加入1 mL缓冲液，然后迅速用随柱提供的推杆用力冲洗，以洗脱磁性标记的细胞。
      注意：分离得到的γδ T细胞已带有荧光标记，可直接用于流式细胞分析，因为磁性标记的抗半抗原微珠已偶联荧光染料FITC。
  2. 细胞分选
    1. 进行细胞分选时，按照第3节所述方法，使用活细胞染料和抗体组合对宫颈管细胞进行标记。
    2. 在活细胞、CD45+ CD3+ 以及γδ阳性细胞群上设置电子门控，进行细胞分选。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

近期，我们分析了宫颈管上皮内的γδ T细胞，并首次报道了HIV感染女性中宫颈管γδ T细胞的丢失现象9,11。本文中，我们描述了分离和分析宫颈管γδ T细胞亚群的实验方案。如图1所示，可在人宫颈管细胞样本中 readily 检测到γδ T细胞。

利用基于多参数流式细胞术的免疫表型分析方法，描述了一群独特的宫颈管γδ V1（GD1）T细胞（图1）。图1展示了HIV未感染个体宫颈管样本的代表性设门策略。首先在前向散射/侧向散射图上设定电子门以分析全部宫颈管细胞（图1A），随后排除细胞双联体（图1B）。通过LIVE/DEAD可固定黄色胺类死细胞染料排除死细胞，从而确定活细胞（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

评估女性下生殖道黏膜的易损性是研究HIV感染与传播风险的临床研究中的关键组成部分。通常通过检测生殖道分泌物中的可溶性免疫调节因子（如细胞因子、趋化因子和抗菌肽）来评估女性生殖道（FGT）对HIV感染的易感性12,13。然而，这些生物标志物仅能提示阴道炎症状态，且受生理和病理事件的影响，并不能始终反映直接的黏膜损伤。为了更深入理解黏膜因素如何增加HIV感染与传播的风险，有必要开发用于评估黏膜损伤的细胞标志物。γδ（GD）上皮内T细胞存在于女性生殖道中，位于上皮细胞之间，被认为在维持稳态以及抵御外界环境挑战的第一道防线中发挥重要作用。GD T细胞有望成为评估女性生殖道黏膜易损性的另一项生物标志物。

本方案展示了如何从人子宫颈管细胞刷样本中制备上皮内淋巴细胞，该方法易于掌握。此过程最关键的步骤是通过快速处理样本以及在整个操作过程中将细胞置于冰上，以维持细胞活性。细胞得率将取决于细胞刷采集技术、操作技巧以及感染状态（如HIV感染或其他病毒感染、细菌或真菌感染）。我们课题组及...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者不存在可能构成利益冲突的商业或其他关联（例如，持有制药公司股票、担任顾问、参与咨询委员会、拥有相关专利或获得研究资助）。

致谢

我们感谢迈阿密妇女跨机构艾滋病研究（WIHS）的参与者愿意参与本项工作。本论文中的数据由迈阿密妇女跨机构艾滋病研究（WIHS）收集。本出版物的内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。本研究由美国过敏与传染病研究所和妇女跨机构艾滋病感染研究（WIHS）[资助号 U01 AI103397]、美国过敏与传染病研究所、美国国立卫生研究院（NIH）[资助号 P30AI073961]、转化科学促进中心及少数族裔健康与健康差异研究所、美国国立卫生研究院（NIH）[资助号 UL1TR000460 和 1KL2TR000461]，以及美国儿童健康与人类发展研究所、美国国立卫生研究院（NIH）[资助号 K23HD074489] 提供支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞刷 Plus GT （CareFusion，美国加利福尼亚州圣迭戈
IMDM，Iscove 改良 Dulbecco 培养基 赛默飞世尔科技12440061
Beckman Coulter 自动细胞计数仪（Vi-CELL 系列细胞活力分析仪Beckman Coulter496178
DMSO，二甲基亚砜 Sigma-Aldrich D2650
FBS，胎牛血清Invitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigma-AldrichA-9647
LIVE/DEAD 可固定黄色死细胞染色试剂盒 Life Technologies,L349S9
1% 多聚甲醛Sigma-Aldrich D6148
Fortessa 流式细胞仪 贝克顿·迪金森
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC 胺反应性补偿微珠（Life Technologies，美国纽约州格兰岛）Life TechnologiesA10346
抗 TCR γ/δ 微珠试剂盒 Miltenyi Biotec 公司130-050-701
MS 柱103-042-201
MACS 分离器4124

参考文献

  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

TCR CD45 CD3

相关文章