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使用单核细胞单层法评估Fcγ受体介导的吞噬作用

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DOI：

10.3791/55039

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2017年1月2日

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

本文内容

摘要

单核细胞单层试验（MMA）是一种 体外 利用从哺乳动物外周全血中分离的原代单核细胞来评估Fcγ受体（FcγR）介导的吞噬作用的检测方法。

摘要

尽管最初是为预测血清学上不相容血液的输血结果而开发，单核细胞单层试验（MMA）具有高度的多功能性 体外 一种可进行修饰以在科研和临床环境中研究抗体及Fcγ受体（FcγR）介导的吞噬作用不同方面的检测方法。该检测利用从哺乳动物全血中分离的外周血单个核细胞中的贴壁单核细胞。MMA已报道可用于人和小鼠的相关研究。这些单核细胞表达Fcγ受体（FcγR）例如， FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB 和 FcγRIIIA）参与免疫应答。MMA 利用了 FcγR 介导的相互作用机制，特别是吞噬作用，其中抗体致敏的红细胞（RBCs）与 FcγR 结合并/或激活 FcγR，随后被单核细胞吞噬。 体内主要存在于脾脏和肝脏的组织巨噬细胞通过FcγR介导的吞噬作用清除抗体包被的红细胞，导致血管外溶血。通过MMA评估吞噬作用水平，可研究该过程的不同方面 体内 可通过该方法研究FcγR介导的过程。MMA的一些应用包括：预测输血环境中同种或自身抗体的临床相关性，评估促进或抑制吞噬作用的候选药物，以及将该检测与荧光显微镜或传统Western免疫印迹相结合，以研究FcγR结合类药物或抗体的下游信号转导效应。该方法的一些局限性包括操作较为繁琐，整个流程从开始到结束需耗时一整天，以及操作哺乳动物血液需要获得研究伦理审批。然而，通过认真操作和充分培训，MMA的结果可在24小时内获得。

引言

单核细胞单层试验（MMA）是一种 体外 最初开发该检测方法旨在更好地预测患有红细胞（RBCs）自身抗体或同种抗体的患者的输血效果1-5通过使用该方法评估抗红细胞抗体在介导Fcγ受体（FcγR）依赖性吞噬作用中的效应 体外 检测，可以预测临床结果 体内事实上，MMA 已被成功用于避免抗体结合的红细胞发生免疫破坏，即使在输注血清学上不相容的血液时也是如此5典型的输血前相容性检测程序，也称为交叉配血，包括血清学方法，即对患者的血液进行ABO和Rh抗原分型，并筛查患者体内是否存在抗红细胞抗体6选择与患者ABO/Rh血型相匹配的血液，若存在抗体，则尝试鉴定其特异性，以便进一步筛选输血用血以避开这些抗原。理想的交叉配血结果是所有供体血液在血清学上均与患者血液相容，从而降低输血后溶血反应的风险。7然而，对于因反复输血或妊娠而产生同种免疫的少数患者，该系统存在不足。这些患者会产生针对特定红细胞抗原的同种抗体。其中一些患者产生的抗体靶向的是在普通人群中频率极高的抗原，因此使其交叉配血变得越来越困难8,9复杂性在于，并非所有同种抗体都具有临床意义；换句话说，在输注抗原阳性且配型不相容的血液时，血清学检测所发现的同种抗体与红细胞的结合并不一定会导致溶血。多中心单抗评估法（MMA）最初即为评估在输血情况下血清学上不相容血液的潜在临床意义而开发。1-5.

由于已知抗体结合的红细胞的血管外溶血由单核吞噬细胞系统介导，因此在诊断检测方法的开发中常使用原代单核细胞/巨噬细胞。首个用于研究单核细胞、红细胞和抗体之间相互作用的检测方法发表于1975年，但由于采用了次优条件，仅观察到花环形成（即红细胞结合于单核细胞周边），未观察到吞噬作用10。此后多个研究团队对该检测方法进行了重要改进，建立了一种可将同种抗体结合的红细胞吞噬程度与溶血临床结局相关联的检测方法1-5。最近，研究人员进一步考察了临床样本的最佳储存条件以及检测条件的进一步优化，以提高利用患者自体样本进行临床MMA交叉配血试验的实用性11。

除了MMA外，还有三种诊断技术被用于预测输血结果： 51Cr释放试验、玫瑰花结试验和化学发光试验（CLT）。在 51Cr释放试验，患者被注射 51用Cr标记的供体红细胞，通过监测标记红细胞的半衰期，可预测输血后的存活或清除情况12,13由于该方法使用放射性物质，现已很少采用。花环试验包括将单核细胞与红细胞混合孵育，并定量花环形成水平（无吞噬作用）。14. 抗体的临床意义 体内 涉及脾脏和/或肝脏中巨噬细胞的主动吞噬作用；因此，该方法无法提供吞噬作用的相关读数。CLT 利用鲁米诺监测单核细胞吞噬红细胞过程中产生的氧化爆发，因为鲁米诺在吞噬体中被氧化时会发出蓝色荧光15该方法效果良好，但中性粒细胞的污染可能干扰检测结果。已有研究对四种可用方法的灵敏度、实用性和可重复性进行了平行比较，结果显示CLT和MMA两种方法更为优越。16然而，CLT 主要被用于评估胎儿和新生儿溶血病（HDFN），且该检测在最适pH值为8.0的条件下进行，可能会影响吞噬作用的程度。11.

除了其诊断和临床应用价值外，MMA 已被改良用于其他研究目的。事实上，MMA 不仅可作为功能检测手段以解决血清学与生物学结果之间的不一致，还可用于回顾性分析静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗后发生溶血的原因。17它还被用于研究化学抑制剂对FcγR介导的吞噬作用的结构-功能关系。18-20 并研究FcγR介导的吞噬作用的下游信号传导21在我们的实验室中，除了使用人源MMA外，我们还正在利用小鼠原代外周血单个核细胞（PBMCs）和自体红细胞开发一种小鼠MMA。其原理是筛选能够诱导FcγR介导的吞噬作用的抗体，作为开发相关疗法的中间步骤 体内 自身免疫性溶血性贫血（AIHA）小鼠模型（未发表数据）。这些不同修饰主要针对IgG抗体与FcγR相互作用中诱导吞噬作用的不同方面。

方案

获得研究伦理委员会/机构审查委员会对使用人源样本的批准，并获取所有人类供体的书面知情同意。在获得动物使用伦理批准后，小鼠外周血单个核细胞（PBMCs）也可采用与人源检测类似的方法进行MMA。MMA采用无菌组织培养技术。

注意：参见图1。

注意：尽管我们建议在检测过程中使用二级生物安全柜以维持无菌操作技术，但由于该方法仅为“短期”培养方法，细菌污染检测的时间实际上并不充足。因此，如果缺乏二级生物安全柜，不必仅为本检测购置设备，可在开放实验台面上进行检测。然而，使用37 °C、5% CO2的培养箱是必需的，无法替代，以获得最佳结果。

1. 外周血单个核细胞分离

  1. 通过使用含有酸性枸橼酸葡萄糖抗凝剂（ACD，黄头管）的真空采血管，从健康供体或患者处采集全血。
    注意：全血可在室温（18–22 °C）下用 ACD 保存最多 36 小时，然后再进行下一步操作11。通常，1–2 支 10 mL 真空采血管的全血量足以满足检测需求。
  2. 用预热的完全 RPMI 培养基（RPMI-1640，添加 10% 胎牛血清、20 mM HEPES 和 0.01 mg/mL 庆大霉素）将全血按 1:1 体积比稀释。
  3. 按照制造商推荐的方法（参见材料列表），通过密度梯度离心法从稀释后的全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。将稀释后的血液缓慢地分层加在已预温至室温（18–22 °C）的密度梯度液上。
    注意：为获得最佳分离效果，应尽量减少两相界面处的混合，可通过逐滴加入或使用移液器小心分层实现。
    1. 将移液管尖端靠近密度梯度液表面，使血液混合物沿管壁极缓慢地流下，从而实现血液混合物在密度梯度液上方的缓慢分层。
    2. 根据实验规模，在 3 mL 密度梯度液（置于 15 mL 管中）上方加入 10 mL 血液混合物，或在 15 mL 密度梯度液（置于 50 mL 管中）上方加入 35 mL 血液混合物。通常情况下，10 mL 全血可获得约 1000 万个 PBMCs，但不同供体之间存在一定差异。
      注意：必须确保血液混合物与密度梯度液之间不发生混合。血液混合物应完整地覆盖在密度梯度液上方，并缓慢上浮，直至所有血液均位于密度梯度液之上。
    3. 将分层后的混合物以 700 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。离心后混合物应分为五层（从上至下依次为）：血浆层、白膜层（含 PBMCs）、密度梯度介质层、粒细胞层和红细胞层。
    4. 用巴斯德移液管和吸球去除大部分血浆，并小心收集白膜层（PBMCs）至新的 15 mL 管中。
      注意：可通过将移液管尖端紧贴管壁，并围绕白膜层外缘做环形移动的同时施加负压，有效吸取白膜层。
  4. 用 pH 7.3 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤分离得到的 PBMCs 三次，每次洗涤之间以 350 × g 离心 10 分钟（启用全刹车）。将 PBMC 沉淀重悬于完全 RPMI 培养基中。根据沉淀体积大小，加入 3–7 mL 培养基即可。
  5. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对 PBMCs 进行计数，仅计数未被台盼蓝染色的活细胞。将 PBMCs 重悬于完全 RPMI 培养基中，调整细胞浓度至 1,750,000 个细胞/mL。
  6. 向 8 孔载玻片的每个孔中接种 400 µL（含 700,000 个细胞）。将载玻片置于 37 °C、完全湿润的组织培养孵箱中（含 5% CO2），孵育 1 小时，使单核细胞/巨噬细胞贴壁。

2. 贴壁单核细胞的预处理

注意：仅在寻找抑制或增强吞噬作用的方法时，此步骤才必要。

  1. 用感兴趣的药物或化合物对贴壁的单核细胞进行预处理。使用完全RPMI培养基将药物或其他待测物质重悬至所需浓度。
    注意：例如，当使用人单核细胞时，通常使用200 µg/mL的静脉注射免疫球蛋白（IVIG）可实现95–100%的吞噬作用抑制。
  2. 在37 °C孵育1小时后（即步骤1.6之后），吸除并弃去8孔载片中含非贴壁细胞的上清液。每孔加入400 µL药物或其他处理溶液，并在37 °C孵育1小时。
    1. 在向8孔载片中吸除和更换溶液时，需控制液体流速，防止弱贴壁细胞脱落。同时，每次仅处理2–3个孔，避免孔内干燥。
      注意：通常每种处理均设置技术重复三孔。

3. R2R2 红细胞的调理作用

注意：此处使用的 R2R2 红细胞来自血液采集中心（加拿大血液服务中心），但也可通过商业途径获得。经调理的 R2R2 红细胞用作 FcγR 介导吞噬作用的阳性对照。未处理的 R2R2 红细胞应保存于阿氏液（Alsever's 溶液）中（以延长保存期限），于 4 °C 保存不超过 1 个月。阿氏液为实验室自制，其成分为 0.8% w/v 枸橼酸三钠（二水合物）、1.9% w/v 葡萄糖、0.42% w/v 氯化钠和 0.05% w/v 枸橼酸（一水合物）。若无法获得 R2R2 红细胞，也可使用其他 Rh 表型的红细胞，例如 R1R2、R1R1、R1r 或 R2r。

  1. 将 R2R2 (cDE/cDE) 红细胞用 PBS 洗涤共三次，每次以 350 × g 离心 5 分钟。
    注意：所需红细胞的数量取决于实验规模，可进行反向计算。每次洗涤过程中由于溶血或去除上清液时会造成红细胞损失，因此应始终洗涤过量的红细胞。例如，在包含 5 个处理组和 2 个对照组、每组设技术重复三次的实验中，共有 21 个孔。每个孔加入 400 µL 的 1.25% 红细胞混合液，则共需要 105 µL 压积的已致敏红细胞。初始应洗涤 200 µL 红细胞，并对其中 150 µL 进行致敏处理，以确保吞噬实验步骤中有足够的红细胞量。
  2. 用体积比为 1:1 的人血清多克隆抗-D 抗体对洗涤后的 R2R2 沉淀进行致敏，并在 37 °C 下孵育 1 小时，期间间歇性混匀。
    注意：若无法获得多克隆抗-D 抗体，可使用市售的单克隆抗-D 抗体，或从血库或输血服务机构获取常规用于 Rh 免疫预防的抗-D 抗体替代。在建立该检测方法之初，或每次更换未标定效价的多克隆抗体批次、或更换为单克隆抗体时，均应进行优化测试。目的是确定获得间接抗球蛋白试验（IAT）结果在 3+ 至 4+ 之间、且每计数 100 个单核细胞时吞噬红细胞数达到 70–90 个所需的最优抗-D 抗体浓度或体积。
  3. 将致敏后的 R2R2 用 PBS 洗涤共三次，每次以 350 × g 离心 5 分钟。
    注意：可通过间接抗球蛋白试验（IAT）验证 R2R2 是否成功致敏。简而言之，加入第二代多克隆抗人抗体以结合红细胞表面的初级致敏抗体，通过血凝现象观察信号放大结果。详细的试剂盒操作流程见补充材料文件。
  4. 用完全 RPMI 培养基将洗涤后的 R2R2 沉淀重悬至 1.25% v/v 浓度。
    注意：多余的已致敏 R2R2 可保存于 Alsever 溶液中，置于 4 °C 最长可保存一周。

4. Fc 受体介导的吞噬作用

  1. 从8孔载玻片中吸除药物或培养基上清液，加入400 µL 1.25% v/v R2R2混合液。在37 °C下孵育2小时。
  2. 孵育2小时后，使用厂家提供的适配器移除小室。用纸巾轻轻吸去多余的R2R2液体，注意避免载玻片干燥。
  3. 取一个100 mL烧杯，装入PBS。将载玻片浸入其中，并缓慢前后移动（约30–40次），以洗去大部分未被吞噬的R2R2颗粒。
  4. 从PBS中取出载玻片，用纸巾或滤纸吸去多余液体，然后在空气中自然干燥。
  5. 将风干的载玻片置于100%甲醇中固定45秒，随后再次空气干燥。
    注意：也可采用其他更适合后续染色步骤的固定方法，例如Grünwald-Giemsa染色法21或Wright-Giemsa染色法22。
  6. 使用实验室自制的Elvanol封片剂（或其他市售封片剂）对载玻片进行封片，并加盖盖玻片。
    注意：Elvanol封片剂由15% w/v聚乙烯醇树脂和30% v/v甘油溶于PBS中制成，加热至树脂完全溶解且甘油均匀分散。此封片剂可替换为其他商业产品。
  7. 封片后静置过夜，待其完全干燥后再进行定量分析。

5. 吞噬作用的定量分析

  1. 使用相差显微镜和40倍物镜，通过计数至少200个单核细胞及其内吞噬的R2R2数量，手动量化吞噬事件的数量。每只手使用一个计数器，同时记录单核细胞数量和被吞噬的R2R2数量。
  2. 通过将吞噬的R2R2数量除以单核细胞数量再乘以100，计算平均吞噬指数。数据以均值（平均吞噬指数）± 均值标准误（SEM）表示。

结果

按照图1中的关键步骤及上述操作流程，可重复性地完成MMA实验。在图2中，以静脉注射免疫球蛋白（IVIG）为例，展示其对吞噬作用的抑制效果。已知IVIG能够结合并阻断Fc受体，从而抑制吞噬作用的下游效应。通过滴定所用IVIG的剂量，可观察到剂量依赖性的抑制作用：当浓度高于200 µg/mL时，抑制率接近100%；而浓度低于0.5 µg/mL时则无任何抑制作用（图2A）。当将吞噬指数转换并以R2R2阳性对照组归一化为0%抑制率时，可获得一条IC50为3 µg/mL的抑制曲线（图2B）。

除了保持实验操作的一致性外，该实验的定量分析有时也较为困难。图3展示了多种MMA玻片的相差显微镜图像。具备显微镜操作经验者可区分单核细胞与污染的红细胞（图3D），或区分空泡与被吞噬的红细胞（图3B）。在定量分析过程中，应避免细胞和/或碎片的密集区域（图3E和图3F）。此外，应避免对R2R2红细胞过度调理，否则会导致吞噬作用增强，使单核细胞内部过度拥挤，从而干扰准确的定量分析（图3C）。

密度梯度法和PBMC过程分离血液单核细胞及吞噬作用方法示意图。
图1. MMA示意图。 MMA关键步骤的逐步示意图：从全血中分离PBMC，用调理过的R2R2喂养贴壁的单核细胞，以及洗涤腔室载玻片。请点击此处查看该图的放大版本。

显示吞噬指数和IVIG抑制分析结果的柱状图与折线图。
图2. 静脉注射免疫球蛋白（IVIG）抑制吞噬作用 体外 使用 MMA。 已知IVIG可抑制吞噬作用，因此在人源MMA中用作抑制对照。A静脉注射免疫球蛋白（IVIG）的滴定结果显示，与未经处理的对照组相比，其对吞噬作用的抑制呈剂量依赖性2R2 对照组。结果表示为 n = 3 次实验的均值 ± 均值标准误（SEM）。统计分析采用 Student t 检验进行 t-test：** P≤0.01 且 *** P≤0.001。 (B) IVIG 的抑制曲线，其 IC50 的 3 µg/mL （虚线）。结果展示的是相对于未经处理的R组归一化后的数据2R2 （0% 抑制率）；n = 3 次实验的平均值 ± 标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显微镜下的细胞聚集；实验结果；显微分析；细胞簇。
图3. 40倍放大下样本载玻片的相差显微镜图像。（A）理想载玻片，其中单核细胞平均吞噬了1-2个R2R2（黑色箭头指示，具有明显晕圈状发光），背景中未被吞噬的R2R2污染极少（白色箭头）。（B）如本图所示，单核细胞有时会出现扩大的空泡（白色箭头），可能被误认为是吞噬的R2R2。（C）当R2R2过度调理时，每个单核细胞吞噬的R2R2超过4-5个（黑色箭头），导致准确计数困难，因为R2R2在单核细胞内过于密集，无法分辨清晰的细胞边界。（D）载玻片洗涤不充分会导致大量R2R2污染（白色箭头），可能被误认为是黏附的红细胞。（E）有时单核细胞与污染的红细胞可能形成簇状结构。簇状结构也可能提示细菌污染，应予以避免。（F）单核细胞可能形成更大的聚集体，在定量分析时应避免。若 MMA 操作正确，通过随机选择视野观察，通常所见为 A 图所示情况。比例尺为 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

MMA 是一种费时的技术，要求操作者同时具备组织培养和显微镜技术方面的专业知识。为确保实验成功，需注意以下几个关键步骤：1）单核细胞单层的制备；2）红细胞的调理致敏；3）人工定量分析。单核细胞单层与腔室载玻片的黏附性较弱，因此在整个实验过程中必须维持生理 pH 值。11 应接种足够数量的PBMCs。应避免剧烈吹打，以免扰动已贴壁的细胞。一种有效的方法是从培养腔的同一角落缓慢而稳定地移除和添加溶液。同样，在最后一步洗去多余红细胞（RBCs）时，操作动作也应保持缓慢平稳。这样可以在最大程度去除未被吞噬的RBCs的同时，将对单层细胞的扰动降至最低。洗涤不充分会导致残留大量污染性RBCs，增加人工定量的难度。其次，R2R2 红细胞必须经过充分的调理，以获得80-120的平均吞噬指数作为吞噬作用对照。该理想的吞噬指数范围在计数便捷性与例如， 吞噬了5个以上红细胞的单核细胞难以准确定量，同时需维持足够的吞噬数量以满足统计分析要求。可通过间接抗人球蛋白试验（IAT）确认致敏程度，读数需在3+至4+之间。红细胞2R2 当洗涤过程中出现过度裂解、上清液变为深红色，或因储存过程中细胞老化导致吞噬作用显著下降时，应弃用红细胞。最后，使用显微镜进行人工计数可能存在一定难度，尤其是在不同实验人员之间或不同实验之间进行细胞计数比较时。通过在每孔中观察相同视野，或简单地增加计数细胞数量，可获得更一致的结果。建议由经验丰富的技术人员进行并行培训，并使用一套指定的培训玻片。

对巨噬细胞迁移抑制试验（MMA）的一个主要批评在于其手动定量步骤的主观性。然而，经过充分培训后，不同计数者之间可以获得一致的结果。另一个局限性在于单核细胞的吞噬能力以及R2R2表面抗原表达水平在不同供体之间存在固有差异，这在处理人源样本时会导致数据变异。

目前已有其他替代技术可用于检测FcγR介导的吞噬作用。大多数商业试剂盒利用荧光信号来监测吞噬作用（例如：生物颗粒、pH敏感型荧光蛋白或IgG标记的荧光乳胶微球）。虽然荧光信号检测能够提供更为客观的定量结果，但使用者还需考虑荧光显微镜或流式细胞仪的可及性、成本及操作培训要求，以及对商业试剂盒的后续依赖性。

最后，该检测方法可根据具体研究问题进行调整。例如，在检测药物对吞噬作用的抑制效果时，可将单核细胞预先处理，或在同时加入药物和调理过的红细胞的情况下进行共孵育。即， 竞争性实验）。不同亚型抗体、嵌合抗体或重组构建体的下游信号传导也可通过该方法进行检测。随着通用无抗原血液研发领域的最新突破24MMA可用于初步筛选这些抗原阴性红细胞与各种抗体的反应，以评估其在触发吞噬作用方面是否确实存在效能降低。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢加拿大血液服务中心为 T.N.T. 提供的研究生奖学金项目资助。本研究获得了由加拿大联邦政府（加拿大卫生部）以及各省和地区卫生部门资助的加拿大血液服务中心创新中心的财政支持。本文所表达的观点并不代表加拿大联邦、省或地区政府的观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）真空采血管BDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
胎牛血清Multicell 080150
庆大霉素Gibco15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
磷酸盐缓冲液SigmaD8537
8孔载玻片Lab-Tek-ll154534
R2R2 (cDE/cDE) 红细胞加拿大血液服务中心可商业获得（例如，http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells）
人血清来源的多克隆抗-D抗体Gamma BiologicsDIN 02247724可用市售单克隆抗-D抗体或Rh免疫球蛋白替代
100% 甲醇Caledon6700-1-42
聚乙烯醇树脂SigmaP8136可用市售封片剂替代
UltraPure 甘油Invitrogen15514-011
盖玻片VWR48366 067
Novaclone 抗-IgG抗体Immucorgamma5461023间接抗球蛋白试验（IAT）可选（http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf）

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Fc 受体吞噬作用抗体介导的吞噬作用外周血单个核细胞红细胞调理作用相差显微镜荧光显微镜蛋白质印迹静脉注射免疫球蛋白抑制输血医学检测
使用单核细胞单层法评估Fcγ受体介导的吞噬作用
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