方法文章

原位检测与利用核微探针分析对金属氧化物纳米颗粒进行单细胞定量

DOI：

10.3791/55041

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2018年2月3日

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1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们描述了一种用于检测存在的化学元素的方法 原位 在人类细胞中以及它们的 体外 定量分析。该方法适用于任何细胞类型，尤其适用于单细胞水平的定量化学分析。 体外 金属氧化物纳米颗粒暴露

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于化学元素成像的微区分析技术能够实现细胞水平上化学成分的定位与定量。这些技术为生命系统的表征提供了新的可能性，尤其适用于检测、定位和定量生物样本及环境中金属氧化物纳米颗粒的存在。事实上，这些技术均满足以下关键要求：（i）灵敏度高（干重检测限为1至10 µg·g-1）；（ii）空间分辨率达到微米量级；（iii）具备多元素同时检测能力。基于这些特性，微束化学元素成像可有效补充光学显微镜和荧光显微镜等常规成像技术。本实验方案描述了如何对暴露于二氧化钛纳米颗粒的培养细胞（U2OS）进行核微探针分析。细胞必须生长并直接暴露于一种特制的样品 holder 中，该 holder 可用于光学显微镜以及核微探针分析阶段。采用浸入式冷冻固定法对样品进行低温固定，可同时保持细胞结构和化学元素分布的原始状态。在样品上同步开展的核微探针分析（包括扫描透射离子显微技术、卢瑟福背散射谱以及粒子激发X射线发射）可提供有关细胞密度、化学元素局部分布以及细胞内纳米颗粒含量的信息。生物学领域对这类分析工具的需求日益增长，尤其是在纳米毒理学和纳米医学迅速发展的背景下，亟需加深对纳米颗粒与生物样本之间相互作用的理解。特别是，由于核微探针分析无需对纳米颗粒进行标记，因此可在细胞群体中独立于其表面状态，实现单个细胞水平上的纳米颗粒丰度定量。

引言

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细胞稳态由不同微量元素（离子、金属、外源性无机化合物）的摄取调控、同化及细胞内定位所决定。这些成分常以痕量形式存在，但仍可能对系统生理产生显著影响。因此，在正常及病理/应激状态下研究细胞生物化学，是全面理解细胞代谢机制的关键步骤。为此，开发能够检测细胞内化学物质丰度、结构组织及其相关代谢功能的成像与分析技术变得十分必要。目前仅有极少数方法能够提供 原位 关于给定样品整体化学性质的定量信息。除了分析块体样品的方法外， 原位 分析在不损失质量与结构信息的前提下，对生物样本进行整体性考察，从而保留其含有的化学成分（微量元素和离子）及蛋白质。此外，随着纳米科学的不断发展，有必要开发更先进的成像与分析方法，以在细胞尺度上实现对纳米物体行为与相互作用的观测和量化，用于环境监测。1

纳米颗粒（NPs）被定义为至少在一个维度上尺寸介于1至100 nm之间的物体。2 由于其独特的理化性质，纳米颗粒在工业中被广泛应用。纳米颗粒也被用于生物应用和纳米医学领域。3,4 尽管纳米颗粒具有多种理化特性，但其可能对人类健康和环境产生不良影响的风险。这种风险可能由不同浓度水平下的长期或重复暴露引起，但目前尚未明确证实。5

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方案

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1. 样品 holder 的制备

  1. 样品 holder 的设计与制备
    1. 通过在1 mm厚的PEEK框架上钻出一个5 mm × 5 mm的方孔来制造样品 holder。
    2. 用70%（v/v）乙醇冲洗清洗，并在无菌培养板中保存，直至使用前。
      注：需要一种适用于细胞培养和细胞操作的样品 holder。该 holder 需适用于细胞培养、体外光学显微镜观察以及核微探针分析与成像。此 holder 由PEEK框架制成13。
  2. 样品 holder 的准备
    1. 通过将1 mg的Formvar粉末溶解于100 mL氯仿中，制备Formvar溶液。
    2. 将聚碳酸酯薄膜拉伸在金属框架上，确保无褶皱。
    3. 使用无菌枪头将Formvar溶液均匀涂布于样品 holder 的孔周围。
    4. 小心地将样品 holder 用胶水粘附到已拉伸的聚碳酸酯薄膜上（5 mm × 5 mm方块）。
    5. 重复上述步骤，为每个重复样品制备一个样品 holder。
      注：聚碳酸酯（PC）薄膜具有生物相容性，足够厚且能耐受各种实验流程和分析条件。
      注意— 氯仿有毒。避免吸入、摄入或皮肤接触。务必在通风良好的....

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结果

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荧光标记的TiO2纳米颗粒的细胞培养与荧光成像

我们设计了一种适用于细胞培养、细胞操作以及多模式分析的样品 holder。具体而言，该 holder 需能够支持常规光学显微镜观察以及核微探针分析与成像。此样品 holder 采用沉积在 PEEK 框架上的 2-µm 厚聚碳酸酯膜制成。细胞在无菌培养条件下直接生长于聚碳酸酯膜上，培养数天后可用于不同的实验设置，例如纳米颗粒（NPs）暴露实验。

采用荧光染料（TRITC）对 TiO2 纳米颗粒（NPs）进行化学表面修饰，使其可通过荧光显微镜在活细胞或经多聚甲醛固定的细胞中实现原位（in situ）和体外（in vitr.......

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讨论

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我们介绍一种方法，可提供超越其他成像技术所能实现的信息，尤其在亚细胞水平上具有显著优势。除了成像能力外，核微探针分析还能够对构成生物样品的化学元素进行定量分析。在本研究中，我们分析了人类细胞群体，并进一步聚焦于单个暴露于TiO2纳米颗粒的细胞中特定感兴趣区域的分析。该技术与其他方法相结合，可同时提供细胞形态学成像以及关于元素化学组成的精确定量数据。

为了成功应用核微探针分析，必须遵守以下要点，以避免潜在的陷阱。首先，必须采用低温固定方案来固定细胞，以保持其超微结构和生物化学完整性。其次，必须对厚度低于 20 µm 的薄样品进行分析。如有需要，可对冷冻固定的样品进行切片。样品必须始终保持冷冻状态。第三，还需注意，核微探针分析呈现的是生物样品的二维图像，因此所获得的化学元素分布是二维投影，可能引起误判。这一局限性未来将通过采用断层扫描采集技术得以克服。

核微探针分析也存在局限性。必须强调的是，其主要限制在于需要在真空条件下进行分析。因此，必须采用能够保持细胞超微结构和生物化学完整性的细胞固定.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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We thank Serge Borderes for directing and editing of the video. The French National Research Agency supports the research program TITANIUMS (ANR CES 2010, n° CESA 009 01). The CNRS and the European Community as an Integrating activity provided the "Support of Public and Industrial Research Using Ion Beam Technology (SPIRIT)" under the EC contract n° 227012. This work has been supported by Marie Curie Actions - Initial Training Networks (ITN) as an "Integrating Activity Supporting Postgraduate Research with Internships in Industry and Training Excellence" (SPRITE, D1.3) under EC contract no. 317169. The C'NANO Grand Sud Ouest and the Region Aquitaine support ....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养
U2OSATCC，LGC 标准品ATCC HTB-96
不含L-谷氨酰胺的MCCOY 5A培养基Dominique DUTSCHERL0211-500
FBS 500 mLDominique DUTSCHER500105U
青霉素/链霉素 赛默飞世尔科技11548876
 L-谷氨酰胺 200 mM，100 mL Invitrogen25030024
遗传霉素，  20 mL赛默飞世尔科技10092772
0.25% (v/v) 胰蛋白酶-EDTA  500 mL赛默飞世尔科技11570626
Viromer Red脂萼VR-01LB-01
Matrix-roGFP 质粒AddGene#49437
Hoechst 33342赛默飞世尔科技H3570小心操作
<强>纳米颗粒制备
TiO2 P25 AEROXIDE德固赛/赢创
四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）SIGMA-ALDRICHT3163纳米颗粒表面修饰
<强>样品制备
聚碳酸酯箔古德费洛CT301020
聚醚醚酮支架（PEEK）MatechplastA-239-4047
乙醇，ACS 级，纯度 99.5%SIGMA-ALDRICH02860-6x1L
氯仿，无水，99%SIGMA-ALDRICH372978-1L 注意：有毒
Formvar 100 gAgar ScientificAGR1201有害。使用浓度为10 µ克每毫升氯仿
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
<强>样品固定
粉末，95% 多聚甲醛SIGMA-ALDRICH158127-500G注意：有毒性。使用 PBS 中的 4% 溶液
PBS（pH 7.4，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）赛默飞世尔科技11503387
Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂赛默飞世尔科技P36934
Triton X-100SIGMA-ALDRICH93443有害的
<强>样品冷冻固定
液氮液化空气医疗有害的
甲基丁烷 >=99%SIGMA-ALDRICH M32631-1L注意：有毒
铝制转移板自制
蒸馏去离子水自制使用 Barnstead Smart2Pure 系统在实验室中制备
ParafilmVWR52858-000
<强>仪器设备
Barnstead Smart2Pure赛默飞世尔科技50129870
II级生物安全柜赛默飞世尔科技MSC-Advantage
TC20 自动细胞计数仪伯乐（Bio-Rad）145-0102SP
计数板 2 个孔伯乐（Bio-Rad）1450016
PIPS探测器，25 mm²，12 keV能量分辨率 @5.5 MeV堪培拉 PD25-12-100AM
高分辨率Si(Li)固态探测器，145 eV能量分辨率（@Mn-K）αOxford Instruments
Everhart-Thornley型二次电子探测器（SED） 奥赛物理学1-SED
XRF校准标准品 钠或氯化物（以NaCl计）微物质34381
XRF校准标准品 镁以氟化镁（MgF2）形式存在微尺度物质34382
XRF校准标准 铝作为铝金属微物质34383
XRF校准标准硅（以SiO₂计）微物质34384
XRF校准标准 硫以CuSx形式存在微物质34385
XRF校准标准品 钙以CaF2形式存在微尺度物质34387
XRF校准标准品 钛作为Ti金属微物质34388
XRF校准标准品 铁（以Fe金属形式）微物质34389
750W 超声波破碎仪声学材料11743619
3MM 微探针生物阻断科技220-05
真空冷冻干燥机ElexienceEK3147
光学显微镜 Zeiss AxioObserver Z1卡尔·蔡司显微成像有限公司431006-9901
电动载物台 xy卡尔·蔡司显微成像有限公司432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X，NA 0.50 Ph2 M27 物镜卡尔·蔡司显微成像有限公司420351-9910
Plan-Apochromat 63X，NA 1.40 Ph3 M27 物镜卡尔·蔡司显微成像有限公司420781-9910
蔡司滤光片组 02卡尔·蔡司显微成像有限公司488002-9901
蔡司滤光片组 38HE卡尔·蔡司显微成像有限公司489038-9901
蔡司滤光片组 31卡尔·蔡司显微成像有限公司000000-1031-350
化学通风橱ErlabCaptair SD321
粒子加速器HVEE单电子
<强>软件
ImageJ 软件美国国立卫生研究院ImageJ 1.51
SimNRA 软件马克斯·普朗克研究所ü德国，马克斯·普朗克等离子体物理研究所SIMNRA 6.06
Gupix 软件加拿大圭尔夫大学GUPIXWIN 2.2.4

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H.

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