头颈部鳞状细胞癌中神经周围浸润的模型

摘要

神经周围侵袭（PNI）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的常见特征，与较低的生存率相关。其发生机制尚不明确。通过利用在半固体基质中培养的小鼠背根神经节所生成的神经突，可研究HNSCC细胞系中参与PNI的相关通路。

摘要

神经周围浸润（PNI）在约40%的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中被发现。尽管采用手术、放疗和化疗的多模式治疗，与无PNI的HNSCC相比，此类患者局部区域复发和远处转移的发生率更高，总体生存率降低40%。 体外 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中神经周围浸润（PNI）相关通路的研究历来面临挑战，主要由于缺乏一种一致且可重复的检测方法。本文所述为背根神经节（DRG）检测法的改良应用，用于HNSCC中PNI的研究。在该模型中，DRG取自安乐死后的裸鼠脊柱，并置于半固体基质中。随后数天内，DRG细胞体向外呈放射状生长出神经突。将HNSCC细胞系接种于基质周围区域，这些细胞会优先沿神经突向DRG方向侵袭。该方法可快速评估多种处理条件，具有极高的实验成功率和可重复性。 关键词：头颈部鳞状细胞癌，HNSCC，神经周围浸润，PNI，背根神经节，DRG，侵袭，体外模型

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是美国第六大常见癌症，每年全国死亡人数达10,000人，全球每年死亡人数达300,000人¹。过去几十年来，HNSCC的总体预后一直维持在50%左右，未见改善。神经周围浸润（PNI）是预测HNSCC患者预后不良的最重要病理特征之一。遗憾的是，PNI在HNSCC中发生率较高，可在高达40%的HNSCC患者中观察到^2,3。

神经周围浸润（PNI）是指恶性细胞沿神经追踪至邻近组织的过程，从而导致局部和远处扩散的发生率升高。因此，PNI阳性的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤具有更高的局部区域复发率和远处转移率，与无PNI的HNSCC患者相比，总体生存率更低^4-8。

尽管通过手术、放疗和化疗联合治疗伴有神经周围浸润（PNI）的患者，其疗效已达到最大化，但与无PNI的患者相比，这些患者的总体生存率仍降低高达40%^9-11。因此，显然目前针对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的治疗手段在改善与PNI相关的不良预后方面效果有限。开发针对HNSCC中PNI的靶向治疗策略，受到对该过程调控因素认知不足的限制。部分原因在于目前尚缺乏一种稳定可靠的体外（in vitro）模型用于研究HNSCC中的PNI。

近年来，已有多个研究团队开始采用一种 体外 用于研究胰腺癌和前列腺癌中神经浸润的模型^12-19该模型利用从小鼠或大鼠分离的背根神经节所生成的神经突作为大神经侵袭的替代指标。背根神经节被固定于一种因子耗竭的半固体基质中，该基质为Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的可溶性基底膜蛋白混合物。该基质可支持神经突的生长，并允许追踪单个癌细胞沿神经突的迁移过程。本文所述即为该模型在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中用于研究神经周围侵袭（PNI）的改良应用。

方案

1. 培养基与培养皿的准备（10 分钟）

1. 向96孔V型底培养板的孔中加入100 µL含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 从-20 °C冰箱中取出一管预先分装的约100 µL半固体基质，直接置于冰上。
   注意：应在背根神经节（DRG）分离前完成此步骤，因为半固体基质在冰上约需30分钟才能完全融化为液态，这是后续步骤所必需的。若未始终将半固体基质保持在冰上，将导致基质液滴质量不佳。
3. 使用永久性墨水在玻璃底培养皿的四个角下方标记唯一编号。将培养皿正面向上放置于冰上，以冷却皿表面。
   注意：每只小鼠可获得32–40个DRG，因此编号应从1至40。无需预先冷却移液器吸头，因为预冷的吸头在点加基质液滴过程中会逐渐升温，可能导致基质一致性出现差异。

2. 小鼠背根神经节的解剖（45 分钟）

1. 根据特定实验室规程处死一只裸鼠，例如使用 CO₂ 室和胸腔切开术。
2. 准备解剖区域和显微镜。使用 15 或 50 mL 锥形管用的聚苯乙烯容器的洁净、灭菌且平坦的底面。
   注：此外，该底面适合作为解剖平台，因其价格低廉、可一次性使用，并允许使用大头针或针头固定脊柱。仅使用已灭菌的器械和针头。
3. 在自然视野下，用直剪或弯剪沿脊柱从尾根部至小鼠头部做纵向切口。
4. 用同一把剪刀在骶椎下方横向剪断。用剪刀沿脊柱两侧一直解剖至颅底。此时应确保尽可能向前方剪断颈椎。
5. 在手术显微镜低倍镜下观察脊柱的颈段末端。白色的脊髓位于骨环中央，周围包裹着数量不等的椎旁肌和软组织。
6. 用显微弹簧剪将前 2–3 个椎体的背侧或上部切开。利用剪刀的弹力打开最初的骨切口，以确认椎体解剖位于中线。然后以小步进方式继续向骶椎方向进行，并在椎体的腹侧或下部完成相同的切割，从而将脊柱一分为二。
   注：若未能确保骨性脊柱的中线解剖，将导致背根神经节（DRG）收获量降低。
7. 此时脊柱已被分为两半。将其中一半脊柱（半侧脊柱）放置一旁，保持脊髓原位并朝下置于无菌培养皿上。
   注：保留脊髓原位可防止背根神经节（DRG）干燥，因为 DRG 位于脊髓深部。
8. 在聚苯乙烯解剖平台上，用两根 18 号针固定另一侧半脊柱的两端。从颈段端开始（此处因脊柱较窄、DRG 间距更近且有肋骨附着而易于识别），轻轻将脊髓从约 4 个椎体水平处剥离。
9. 观察连接 DRG 的感觉神经（通常为两条）。在神经插入 DRG 的区域，用显微镊子轻轻夹住周围筋膜。用显微弹簧剪解剖并修剪该筋膜及其他神经组织，以游离 DRG。轻柔牵拉可使 DRG 从其在骨性脊柱内的位置中脱出。
   注：此步骤中提高显微镜放大倍数是有益的。对 DRG 造成挤压损伤将显著限制神经突的生长。应避免直接夹持 DRG，而应仅夹持其周围筋膜。
10. 用显微弹簧剪切断外周神经（DRG 通常具有一条外周神经，相对于解剖视野而言位置较深），以释放 DRG。
    注：在张力作用下最容易判断神经末端与 DRG 起始处的界限，因此此时应尽可能靠近 DRG 进行切割。一旦切断该远端分支，也应修剪近端分支。
11. 用显微弹簧剪修剪 DRG 上任何散在的神经纤维或筋膜附着物。充分分离后，将 DRG 置于 96 孔 V 型底板中室温培养基内。
    注：在板下方放置深色背景有助于更清晰地观察亚毫米级的白色 DRG。每个孔仅放置一个 DRG，以便在后续步骤中更易于追踪计数。
12. 重复此过程，依次处理一侧半脊柱，再处理另一侧。每侧可获得 16–20 个 DRG，总计 32–40 个。
    注：若 DRG 数量少于上述范围，则需进一步向头侧和/或尾侧延伸脊柱解剖。随着向尾侧推进，DRG 的形态逐渐变得不明显。

3. 半固体基质液滴的制备（< 1 分钟/板）

1. 从冰上取一个玻璃底共聚焦培养皿，放置在体视显微镜下的冰块上。确保基质始终置于冰上。
2. 使用2 µL或10 µL微量移液器，将1.5 µL基质液滴分别加入玻璃底培养皿的四个角落，液滴与玻璃孔边缘的距离至少应等于液滴本身的直径。
   1. 将移液器枪头以45度角直接接触玻璃表面，缓慢移取基质；待基质在培养皿表面附着后，再缓慢移开枪头。
      注意：基质与玻璃之间的表面张力应每次形成一个完美的半球形液滴。
   2. 当枪头即将排空时即停止移液，避免将空气意外注入基质液滴中，否则会导致液滴直径显著增大且难以去除。
      注意：用另一只手稳定持枪手可提高移液位置的准确性。

4. 将背根神经节插入半固体基质液滴（每块培养板 < 2 分钟）

1. 将含有基质液滴的培养板在室温下短暂放置（约 1 分钟）。这会使基质略微变硬，便于背根神经节（DRG）的精确定位。
2. 用左手持闭合的显微镊子轻轻舀取（不要夹取）DRG。同样，深色背景有助于观察微小的白色 DRG。将 DRG 转移至右手持有的 21 号针头尖端。此转移过程会在镊子上留下残留液体。
3. 使用 21 号针头将 DRG 轻柔地插入基质液滴中央（图 1）。大多数情况下，DRG 会顺利脱离针头进入基质中，随后可用针头将其调整至中心位置。
   1. 如果 DRG 粘附在针头上，可用显微镊子轻轻推动 DRG，使其从针头脱离并进入基质液滴中。用实验室擦拭纸吸去显微镊子上的多余液体。
      注意：将液体引入基质会改变检测体系的直径、体积和一致性。使用带有颜色或彩色书写的冰块作为背景可提供对比度，有助于观察这一精细操作过程。
4. 当培养板中所有四个 DRG 均放置完毕后，进行最终检查，确保每个 DRG 位于基质液滴的中心位置。如有需要，使用 21 号针头进行调整。
5. 将完成操作的培养板转移至 37 °C 培养箱中。这将使半固态基质凝固，从而固定 DRG 的位置。
6. 对所有 DRG 重复上述操作。设置不含 DRG 的空白基质液滴作为阴性对照。
7. 在所有培养板操作完成后，将其置于 37 °C 培养箱中至少 3 分钟，随后向每块玻璃底培养板中加入 4 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。将培养板倾斜一定角度，缓慢加入培养基，使其逐渐接触基质-DRG 单元。
   注意：若培养基添加过快或过于剧烈，可能导致基质和/或 DRG 移位。
8. 将检测样品在 37 °C 培养箱中继续培养 48 至 72 小时。
   注意：定期观察可发现神经突以 DRG 为中心呈环状向外生长，延伸至基质边缘（图 2）。当神经突生长长度超过基质半径的四分之三时，即可进行细胞接种。

5. 头颈部癌细胞的制备

注意：除头颈部鳞状细胞癌细胞外，其他细胞系也可用于本实验设计。

1. 在37 °C培养箱中，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基维持鳞状细胞癌细胞系于适宜的培养瓶或培养皿中。实验前，吸除培养瓶或培养皿中的全部培养基，并用PBS洗涤两次。加入适量0.025%胰蛋白酶消化5分钟，使细胞悬浮，随后加入含10% FBS的DMEM终止消化。将4 mL细胞与培养基混合液接种至6 mL培养皿中。
   注：即使细胞融合度低于50%，一个6 mL培养皿所提供的细胞数量也已足够。
2. 在进行DRG实验染色和接种前24小时，将头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系暴露于不同处理条件下。细胞接种后再次施加相应处理，以维持稳定的实验环境。
   注：在小鼠解剖并完成背根神经节（DRG）分离及植入基质后1至2天，向细胞培养皿中添加抗体、生长因子、细胞因子或其他分子。
3. 在细胞接种前1小时（即DRG收获并植入基质后2至3天）加入荧光细胞染料。
   注：此处使用的特定染料可自由穿过细胞膜；然而，其与细胞内巯基发生反应后即滞留在细胞内，并可传递至子代细胞。染色显著增强了实验过程中的细胞可视化效果。这类临时性染料非常适合本实验，因为其荧光可持续2至3天，恰好覆盖实验所需的时间范围。此外，该方法支持多种不同颜色的染料联合使用，避免了构建稳定表达荧光蛋白的转染细胞系的需要。
   1. 每种细胞处理条件均需配制10 µM染料溶液：取2 µL 10 mM储存液，加入2 mL无血清DMEM中混匀。使用前将溶液预热至37 °C。
   2. 移除6 mL培养皿中的培养基，使贴壁的HNSCC细胞保留在皿内。加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），随后吸除；再向每孔加入2 mL 10 µM染料溶液（溶于无血清DMEM）。
   3. 将含染料的6 mL培养皿放回37 °C培养箱中孵育40分钟。
   4. 40分钟后，吸除培养基，加入2 mL PBS，随后再次吸除。向每孔加入1 mL 0.025%胰蛋白酶，并将培养皿放回37 °C培养箱。
   5. 3至5分钟后，加入2 mL含10% FBS的DMEM终止消化，将悬浮细胞转移至15 mL锥形离心管中。离心收集细胞，并重悬于1 mL含10% FBS的DMEM中。
   6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，随后用含10% FBS的DMEM调整细胞浓度至每毫升300,000个细胞。

6. 接种头颈部癌细胞

1. 从培养箱中取出带有基质-背根神经节（DRG）实验的玻底培养板。
   注意：当神经突延伸至基质边缘的75%以上时，通常在培养2至3天后，即可进行下一步操作。使用至少10倍物镜观察效果最佳。
2. 吸除玻璃底培养板中的培养基。彻底吸除玻璃小室内的培养基，但不得移除基质-背根神经节（DRG）单元。
3. 使用200 µL移液器吸取200 µL浓度为300,000个细胞/mL的培养基。在每份基质-DRG检测区域上滴加两滴细胞悬液。对每一份基质液滴均执行此操作，使每种细胞条件在一块培养板上形成四个重复。
   注意：基质的半球形结构可使细胞沿检测孔周边呈环状分布图3a，图3b使用带有顺滑按压手柄的移液器可显著简化均匀液滴的放置操作。
4. 在4倍显微镜下确认不同细胞处理组的细胞数量和分布相似。
5. 将玻璃底培养板放入37 °C培养箱中孵育约60分钟。注意：尽管细胞和培养基的体积较小（约150 µL），但在培养箱中孵育数小时之前，检测体系不会干燥。
6. 孵育60分钟后，沿玻璃底培养板的孔壁轻轻加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。
   注意：随着时间的推移，细胞会部分贴附于培养板底部，添加培养基的方法应避免扰动细胞。不同类型的细胞开始贴附于玻底培养板所需的时间可能较长或较短。
7. 此时更换任何外源性药物或生长因子，以维持先前的浓度水平。
8. 将检测样品放回37 °C培养箱中孵育，仅在进行显微镜观察时取出。通过显微成像对本实验结果进行定量分析。简言之，使用4倍显微镜图像，在四个象限内分别计数神经周围浸润的条索结构。
   注意：使用配备4倍物镜且具有荧光功能的显微镜足以对实验进行拍照记录。实验体系的尺寸恰好适合4倍物镜的视野范围，其分辨率足以捕捉到神经周围侵袭的各个独立区域。神经周围侵袭在24小时内即可显现，但超过48小时后，由于肿瘤细胞在基质边缘分裂并发生侵袭，实验体系的完整性开始下降。此外，超过48小时后，背根神经节（DRG）中的成纤维细胞会大量流出，干扰明场显微镜下的观察效果。因此，建议在此时间窗口内至少使用4倍物镜进行两次显微拍照记录例如， 在接种肿瘤细胞后24小时和48小时进行观察。需注意，这些是三维实验体系，难以对整个实验区域进行完整成像。大多数神经周围侵袭发生在培养板底部平面，细胞嵌入基质中的位置略高于培养板底部。由于该平面接近水平方向，因此在4倍镜下单层图像即可捕获绝大多数含有肿瘤细胞的神经突。

结果

背根神经节（DRG）解剖并置于基质液滴后，实验的外观应类似于图1。请注意，DRG并非完全圆形，但应位于基质液滴中央。这使得神经突能够在360度方向上生长，部分生长情况如图2所示。需注意的是，DRG的某些区域比其他区域更快且更多地发出神经突，通常对应于传出和传入神经分支分别进入和离开DRG的位置。为消除这种不均一性以及不同DRG之间的大小差异，我们将DRG以每组4个的方式随机铺板，并将各培养板随机分配至不同的细胞处理条件。

如上所述，当神经突延伸至基质边缘距离的至少3/4时（通常在第3天），我们开始接种HNSCC细胞系。所添加的细胞在基质周围形成一个环状结构（图3a）。随后我们在第4天（图3b）和第5天（图3c）对实验进行拍照。此处展示的细胞系（FaDu）表现出高于平均水平的沿神经突迁移...

讨论

方案中的关键步骤

本方案中最关键的步骤是背根神经节的精确解剖与提取。正确横断脊柱，并沿中线纵向分离为两半脊柱，对于获得大量背根神经节（DRG）至关重要。在分离单个DRG时，切勿直接接触神经节本身，而应使用显微镊夹持其周围的筋膜组织。若未遵循此操作，将可能导致DRG受压损伤，这很可能是神经突向外生长失败的主要原因。在解剖过程中，宁可保留较多的周围神经组织，也不应过度操作DRG，以免导致实验中完全无法观察到神经突生长。

修改与故障排除

上述实验方案反映了多年来经过大量程序调整所建立的最佳方法。在方案部分相应步骤的正下方，列出了作者在使用该方法过程中所积累的一些注意事项和常见问题。鉴于本方案涉及的步骤较多，今后的研究人员确实可以对此方案进行多种修改。随着对这些修改经验的积累，预计各研究团队将根据自身偏好发展出更多的故障排除方法。

技术的局限...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12 50/50 培养基（含 L-谷氨酰胺） & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	弗吉尼亚州马纳萨斯
胎牛血清	亚特兰大生物制品公司	S11150	美国佐治亚州弗劳里布兰奇
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）	Life Technologies Corporation	25200056	纽约州格兰德岛
1×磷酸盐缓冲液	康宁	21-040-CM	弗吉尼亚州马纳萨斯
Matrigel hESC-Qualif 小鼠	康宁公司	354277	马萨诸塞州贝德福德
经γ射线辐照的35 mm玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	马萨诸塞州阿什兰
SteREO Discovery.V8 手术显微镜	卡尔·蔡司显微成像	495015-0021-000	纽约州索恩伍德
Schott ACE I 光源	Schott	A20500	德国
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	加利福尼亚州卡尔斯巴德
BD PrecisionGlide 针头 18 G 和 21 G	BD	305195	新泽西州富兰克林湖
高级显微解剖镊	哈佛仪器	60-3851	马萨诸塞州霍利斯顿
高级精细手术剪	哈佛仪器公司	52-2789	马萨诸塞州霍利斯顿
高级弹簧剪	哈佛仪器	60-3923	马萨诸塞州霍利斯顿
持针钳	哈佛仪器公司	72-8949	马萨诸塞州霍利斯顿
裸鼠（002019）	杰克逊实验室	002019	缅因州巴港