尿液样本中游离DNA完整性分析

摘要

提出了一种用于分析尿液样本无细胞上清液组分中DNA完整性的方法。该方法适用于泌尿系统恶性肿瘤的早期检测，并已证实对膀胱癌的早期诊断具有较高的准确性。

摘要

尽管已有大量研究证实血浆或血清中的循环游离DNA可作为多种癌症的合适生物标志物来源，但针对尿液游离（UCF）DNA潜在应用的研究却较少。基于正常凋亡细胞产生高度片段化的DNA，而癌细胞释放较长DNA的假设，本研究评估了UCF DNA完整性的潜在作用，旨在将其作为能够区分前列腺癌或膀胱癌患者与健康个体的早期诊断标志物。

基于对四个长度超过 250 bp 的序列——c-MYC、BCAS1、HER2 和 AR——进行的四重定量实时 PCR，提出了一种尿游离 DNA（UCF DNA）完整性分析方法。所选序列在膀胱癌和前列腺癌中常出现 DNA 拷贝数增加，因此适用于该分析；但该方法具有灵活性，这些基因可根据研究需求替换为其他感兴趣的基因。UCF DNA 作为生物标志物来源的潜在价值已在泌尿系统恶性肿瘤中得到证实，这为后续开展 UCF DNA 特征研究奠定了基础。UCF DNA 完整性检测具有非侵入性、快速且操作简便的优势，仅需数毫升尿液即可完成分析。

引言

细胞游离DNA可通过细胞凋亡或坏死机制在血液和尿液中被检测到。血液中的细胞游离DNA已在多种疾病尤其是癌症的诊断和预后评估中得到广泛研究。¹然而，关于尿液游离DNA（UCF DNA）的作用，目前了解较少。UCF DNA可能来源于经过肾小球滤过系统的血液，或直接与该体液接触的细胞 ² (例如， 尿路上皮细胞或前列腺细胞）。由于尿游离DNA中有很高比例直接来源于泌尿道细胞，因此其作为生物标志物来源主要用于肾癌、膀胱癌和前列腺癌的早期诊断研究^3,4.

关于尿游离DNA（UCF DNA）及其最佳分离与表征方法，目前所知甚少。鉴于肿瘤细胞比正常细胞释放更长的DNA片段这一假设，研究人员已对游离细胞DNA的完整性进行评估，以期阐明血液中循环DNA的来源⁵。一些研究表明，血液中游离细胞DNA的完整性可作为多种癌症的良好诊断指标⁶，该假设同样已被提出用于尿液中的相关研究^7-9。

本文介绍了一种用于UCF DNA完整性分析的新方法，该方法在膀胱癌和前列腺癌检测中具有潜在应用价值。具体而言，在已知实体瘤（包括前列腺癌和膀胱癌）中DNA拷贝数增加的4个区域，检测了长度超过250 bp的UCF DNA片段的完整性：c-MYC（8q24.21）、HER2（17q12.1）、BCAS1（20q13.2）和AR（Xq12）^10-14。选择特定的癌基因而非随机序列，旨在提高在癌症患者游离DNA组分中检测到这些序列的概率。该方法的主要优势之一在于其灵活性，可根据肿瘤类型和特征选择其他基因区域进行分析。

方案

该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指导原则。

注意：本方案中，我们从尿液样本中分离DNA，以进行UCF DNA完整性分析。使用Lncap和MRC细胞系构建标准品。实验操作包括DNA提取、DNA定量（分光光度计及针对对照基因STOX1的实时PCR）以及特定癌基因的实时PCR（图1）。

1. 尿液采集与处理

1. 使用洁净、干燥的塑料杯采集清洁中段晨尿样本，尿液采集量至少为 50 mL。
2. 将尿液样本在 4 °C 条件下保存，最长不超过 3 小时，并在此温度下送至实验室。
3. 样本到达实验室后，立即轻轻倒置混匀两次，然后转移至两个 50 mL 锥底聚丙烯管中。
4. 在 4 °C 或室温条件下，以 850 × g 离心 10 分钟。
5. 小心吸取上清液上部 10 mL，分别转移至两个 5 mL 管中，注意在细胞沉淀上方至少保留 2 mL 上清液。
   注意：吸取上清液上部可降低细胞或细胞碎片污染的风险。上部与下部之间无明显分界。
6. 弃去沉淀物，将上清液立即于 -80 °C 冻存，直至使用。

2. 从尿液上清液和细胞系中分离DNA

注意：使用商业试剂盒并按照制造商说明书，从细胞系（例如，前列腺癌的Lncap或膀胱癌的MRC）中分离DNA。从尿液上清中分离DNA时，应采用以下修改后的商业试剂盒方案进行：

1. 在室温下解冻一份尿液上清液 aliquot。
2. 涡旋混匀尿液样本，并将 1 mL 尿液上清液转移至一个透明的 5 mL 管中。将剩余尿液在 -80 °C 冻存。
3. 直接向样本中加入 100 µL 蛋白酶 K。
4. 向样本中加入 1 mL AL 缓冲液，并用移液器充分混匀。
5. 盖紧管盖，将样本在 56 °C 孵育 15 分钟。
6. 孵育期间，为每个样本准备一个离心柱，并按照制造商说明配制洗涤缓冲液 AW1 和 AW2（加入指定体积的 100% 乙醇）。
7. 将样本恢复至室温，加入 1 mL 无水乙醇，用移液器充分混匀。
8. 取 650 µL 步骤 2.7 所得混合液加入离心柱中，于 6,000 × g 离心 1 分钟。
9. 弃去含有穿流液的收集管，将离心柱置于新的洁净收集管上。重复步骤 2.8 和 2.9，直至全部样本混合液用完（共 5 次）。
10. 加入 500 µL AW1 缓冲液，注意不要润湿柱边缘，于 6,000 × g 离心 1 分钟。
11. 弃去含有穿流液的收集管，更换为新的洁净收集管。
12. 加入 500 µL AW2 缓冲液，注意不要润湿柱边缘，于最大转速（20,000 × g）离心 3 分钟。
13. 弃去含有穿流液的收集管，更换为新的洁净收集管。
14. 重复步骤 2.12，以去除残留的洗涤缓冲液。
15. 将离心柱放入一个洁净的 1.5 mL 管中，加入 50 µL 洗脱缓冲液 AE，静置 7 分钟，确保缓冲液充分润湿柱基质。
16. 于 8,000 × g 离心 1 分钟。
17. 将步骤 2.15 所得洗脱液用移液器转移至同一离心柱中，于最大转速离心 1 分钟，以确保 DNA 的最大回收率。

3. DNA 定量与稀释

1. 使用分光光度计对细胞系和尿液上清样本的DNA进行定量。按照制造商说明书，取2 µL样本在台式分光光度计上进行测定。
2. 将UCF DNA样本稀释至浓度为1 ng/µL，并于-20 °C保存，直至进行DNA完整性分析。
   注意：若DNA量不足以进行实时PCR（至少需要100 ng），则需重新进行DNA提取。
3. 将细胞系样本的DNA稀释，配制六种不同浓度的标准品：0.001、0.01、0.1、1、0.5和2 ng/µL，每种浓度体积为100 µL（分别标记为st1、st2、st3、st4、st5和st6）。将细胞系DNA标准品于-20 °C保存，直至进行DNA完整性分析。

4. DNA 完整性检测——PCR

1. 将引物（浓度取决于检测类型）、绿色预混液、细胞系DNA标准品以及稀释后的UCF DNA样品置于冰上解冻。
2. 为72孔转子盘准备条状管。每种标准品和稀释样品各取10 µL，设两个复孔；阴性对照加入10 µL无RNase的水。
3. 为每个样品配制混合液：每种引物各取1 µL（浓度见表1），加入12.5 µL绿色预混液和6.5 µL无RNase的水。配制混合液时，样品总数应包括：6个标准品（双复孔）、所有待测样品（双复孔）、阴性对照（双复孔）以及额外2个样品。
4. 将15 µL混合液分装至各孔中。分装后不得移液或离心管子。
5. 按照表1中指定的PCR条件启动程序。
   注意：对于UCF DNA值，在每次实时实验中使用72孔转子盘处理29个DNA样品：29 × 2 样品 + 6 × 2 标准品 + 阴性对照 × 2 = 72（UCF DNA值）。
   注意：UCF DNA完整性分析的实验方案也可使用其他实时PCR仪器进行（若使用其他设备，可能需要添加ROX染料）。

5. DNA 完整性检测——数据分析与解释

注意：每个样本的UCF DNA值是通过实时仪器检测系统软件获得的，该软件针对每个单独的PCR基因评估，采用标准曲线构建和标准曲线插值法，如先前所述^7-9（图2）。

1. 评估重复样本；若重复样本之间的差异 ≥1 Ct，则必须舍弃，并在第二次实验中重新评估。
2. 计算每个样本的中位数 Ct 值，并考虑 Ct 值 ≤ 36 的样本。
3. 通过熔解曲线分析评估 PCR 产物的特异性。
4. 通过标准曲线插值法评估每个扩增子的浓度；获得每个扩增子的浓度值（ng/µL）。

结果

所有分析样本的总游离DNA浓度均可通过分光光度法测定，浓度范围为1.51至138 ng/µL。为验证数据的可重复性，共使用了五个对照样本：针对这些样本独立进行了两次实时实验。 c-MYC, HER2, BCAS1, 雄激素受体，以及 STOX1 然后计算每个基因的变异系数（CV）表2），两次独立实验之间具有良好的可重复性（表2).

对125 bp的STOX1序列进行分析，以排除PCR抑制物的存在。若样本显示出STOX1的扩增，则进行UCF DNA完整性检测。若未出现扩增，说明DNA量不足以进行UCF DNA完整性检测，需重新采集尿液样本并重复分析。由于目前关于膀胱癌和前列腺癌中STOX1基因扩增或缺失的信息较少，该基因可作为此类肿瘤类型的对照序列。最后，通过将三...

讨论

尿液游离DNA完整性分析是一种评估尿液中DNA完整性的新型无创方法，最近被提出用于膀胱癌⁹和前列腺癌^7,8的早期诊断。本文讨论了该检测方法的若干优势与局限性，并展望了其未来应用前景。

该方法的主要优势在于提供了一种经济、无创且操作简便的方案，可用于研究尿液作为潜在生物标志物来源，仅需掌握基本的分子生物学技术知识即可开展。检测操作快速，结果在两个工作日后即可获得 (图1），无需医生协助即可轻松解读。该方法仅包含DNA提取步骤和2次实时PCR，具有良好的成本效益比。在准确性方面，UCF DNA完整性在有症状患者中检测膀胱癌的敏感性较高（73%），特异性为84%⁹最后，该方法具有灵活性，只要目的基因长度超过250 bp，即可轻松替换为其他感兴趣的基因。

该检测还存在一些局限性。首先，DNA分光光度法定量方法通常不够精确，可被其他更准确的荧光定量方法所取代（例如， qubit 或 pi...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR Green Supermix，100 × 50 µL 反应，2.5 mL（2 × 1.25 mL）	Biorad	1708880
IDT 定制 DNA 寡核苷酸	IDT		HPLC 纯化，100 nmol DNA 寡核苷酸
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Scientific		也可使用其他分光光度法测定 DNA 浓度
Rotor-Gene 6000	Corbett		也可使用其他实时荧光定量 PCR 仪
微量离心机
用于 50 mL 离心管的离心机
恒温培养箱
-80 °C 冰箱
-20 °C 冰箱
10 μL 移液器
20 μL 移液器
200 μL 移液器
1,000 μL 移液器
移液器吸头（10；20；200；1,000）
1.5 mL 离心管
50 mL 离心管
15 mL 离心管
Rotor-Disc 72 转子	Corbett	9018899
条形管及管盖，0.1 mL（250 个）	Qiagen	981103
收集管（2 mL）	Qiagen	19201
缓冲液 AL（264 mL）	Qiagen	19075
蛋白酶 K（10 mL）	Qiagen	19133