尿液样本中游离DNA完整性分析

摘要

提出了一种用于分析尿液样本无细胞上清液组分中DNA完整性的方法。该方法适用于泌尿系统恶性肿瘤的早期检测，并已证实对膀胱癌的早期诊断具有较高的准确性。

摘要

尽管已有大量研究证实血浆或血清中的循环游离DNA可作为多种癌症的合适生物标志物来源，但针对尿液游离（UCF）DNA潜在应用的研究却较少。基于正常凋亡细胞产生高度片段化的DNA，而癌细胞释放较长DNA的假设，本研究评估了UCF DNA完整性的潜在作用，旨在将其作为能够区分前列腺癌或膀胱癌患者与健康个体的早期诊断标志物。

基于对四个长度超过 250 bp 的序列——c-MYC、BCAS1、HER2 和 AR——进行的四重定量实时 PCR，提出了一种尿游离 DNA（UCF DNA）完整性分析方法。所选序列在膀胱癌和前列腺癌中常出现 DNA 拷贝数增加，因此适用于该分析；但该方法具有灵活性，这些基因可根据研究需求替换为其他感兴趣的基因。UCF DNA 作为生物标志物来源的潜在价值已在泌尿系统恶性肿瘤中得到证实，这为后续开展 UCF DNA 特征研究奠定了基础。UCF DNA 完整性检测具有非侵入性、快速且操作简便的优势，仅需数毫升尿液即可完成分析。

引言

细胞游离DNA可通过细胞凋亡或坏死机制在血液和尿液中被检测到。血液中的细胞游离DNA已在多种疾病尤其是癌症的诊断和预后评估中得到广泛研究。¹然而，关于尿液游离DNA（UCF DNA）的作用，目前了解较少。UCF DNA可能来源于经过肾小球滤过系统的血液，或直接与该体液接触的细胞 ² (例如， 尿路上皮细胞或前列腺细胞）。由于尿游离DNA中有很高比例直接来源于泌尿道细胞，因此其作为生物标志物来源主要用于肾癌、膀胱癌和前列腺癌的早期诊断研究^3,4.

关于尿游离DNA（UCF DNA）及其最佳分离与表征方法，目前所知甚少。鉴于肿瘤细胞比正常细胞释放更长的DNA片段这一假设，研究人员已对游离细胞DNA的完整性进行评估，以期阐明血液中循环DNA的来源⁵。一些研究表明，血液中游离细胞DNA的完整性可作为多种癌症的良好诊断指标⁶，该假设同样已被提出用于尿液中的相关研究^7-9。

本文介绍了一种用于UCF DNA完整性分析的新方法，该方法在膀胱癌和前列腺癌检测中具有潜在应用价值。具体而言，在已知实体瘤（包括前列腺癌和膀胱癌）中DNA拷贝数增加的4个区域，检测了长度超过250 bp的UCF DNA片段的完整性：c-MYC（8q24.21）、HER2（17q1....

方案

该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指导原则。

注意：本方案中，我们从尿液样本中分离DNA，以进行UCF DNA完整性分析。使用Lncap和MRC细胞系构建标准品。实验操作包括DNA提取、DNA定量（分光光度计及针对对照基因STOX1的实时PCR）以及特定癌基因的实时PCR（图1）。

1. 尿液采集与处理

1. 使用洁净、干燥的塑料杯采集清洁中段晨尿样本，尿液采集量至少为 50 mL。
2. 将尿液样本在 4 °C 条件下保存，最长不超过 3 小时，并在此温度下送至实验室。
3. 样本到达实验室后，立即轻轻倒置混匀两次，然后转移至两个 50 mL 锥底聚丙烯管中。
4. 在 4 °C 或室温条件下，以 850 × g 离心 10 分钟。
5. 小心吸取上清液上部 10 mL，分别转移至两个 5 mL 管中，注意在细胞沉淀上方至少保留 2 mL 上清液。
   注意：吸取上清液上部可降低细胞或细胞碎片污染的风险。上部与下部之间无明显分界。
6. 弃去沉淀物，将上清液立即于 -80 °C 冻存，直至使用。

2. 从尿液上清液和细胞系中分离DNA

注意：使用商业试剂盒并按照....

结果

所有分析样本的总游离DNA浓度均可通过分光光度法测定，浓度范围为1.51至138 ng/µL。为验证数据的可重复性，共使用了五个对照样本：针对这些样本独立进行了两次实时实验。 c-MYC, HER2, BCAS1, 雄激素受体，以及 STOX1 然后计算每个基因的变异系数（CV）表2），两次独立实验之间具有良好的可重复性（表2).

对125 bp的STOX1序列进行分析，以排除PCR抑制物的存在。若样本显示出STOX1的扩增，则进行UCF DNA完整性检测。若未出现扩增，说明DNA量不足以进行UCF DNA完整性检测，需重新采集尿液样本并重复分析。由于目前关于膀胱癌和前列腺癌中STOX1基因扩增或缺失的信息较少，该基因可作为此类肿瘤类型的对照序列。最后，通过将三.......

讨论

尿液游离DNA完整性分析是一种评估尿液中DNA完整性的新型无创方法，最近被提出用于膀胱癌⁹和前列腺癌^7,8的早期诊断。本文讨论了该检测方法的若干优势与局限性，并展望了其未来应用前景。

该方法的主要优势在于提供了一种经济、无创且操作简便的方案，可用于研究尿液作为潜在生物标志物来源，仅需掌握基本的分子生物学技术知识即可开展。检测操作快速，结果在两个工作日后即可获得 (图1），无需医生协助即可轻松解读。该方法仅包含DNA提取步骤和2次实时PCR，具有良好的成本效益比。在准确性方面，UCF DNA完整性在有症状患者中检测膀胱癌的敏感性较高（73%），特异性为84%⁹最后，该方法具有灵活性，只要目的基因长度超过250 bp，即可轻松替换为其他感兴趣的基因。

该检测还存在一些局限性。首先，DNA分光光度法定量方法通常不够精确，可被其他更准确的荧光定量方法所取代（例如， qubit 或 pi.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR Green Supermix，100 × 50 µL 反应，2.5 mL（2 × 1.25 mL）	Biorad	1708880
IDT 定制 DNA 寡核苷酸	IDT		HPLC 纯化，100 nmol DNA 寡核苷酸
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Scientific		也可使用其他分光光度法测定 DNA 浓度
Rotor-Gene 6000	Corbett		也可使用其他实时荧光定量 PCR 仪
微量离心机
用于 50 mL 离心管的离心机
恒温培养箱
-80 °C 冰箱
-20 °C 冰箱
10 μL 移液器
20 μL 移液器
200 μL 移液器
1,000 μL 移液器
移液器吸头（10；20；200；1,000）
1.5 mL 离心管
50 mL 离心管
15 mL 离心管
Rotor-Disc 72 转子	Corbett	9018899
条形管及管盖，0.1 mL（250 个）	Qiagen	981103
收集管（2 mL）	Qiagen	19201
缓冲液 AL（264 mL）	Qiagen	19075
蛋白酶 K（10 mL）	Qiagen	19133