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一种快速、可扩展的细胞来源细胞外基质分离、功能研究与分析方法

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DOI：

10.3791/55051

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2017年1月4日

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1School of Biochemistry, University of Bristol

本文内容

摘要

细胞外基质在决定细胞微环境以及调控细胞行为和表型方面起着重要作用。本文介绍一种快速分离细胞来源的细胞外基质的方法，该方法可适用于不同规模的显微、生化、蛋白质组学或功能研究。

摘要

细胞外基质（ECM）被认为是一个多样、动态且复杂的环境，参与多种细胞生理和病理过程。然而，从组织或细胞培养物中分离ECM的过程因组装后的ECM具有不溶性和交联特性，以及ECM提取物可能被细胞表面和细胞内蛋白污染而变得复杂。本文介绍一种适用于培养细胞的方法，该方法快速且能可靠地去除细胞，从而分离出可用于后续实验的细胞来源ECM。

通过使用该方法，可对分离的细胞外基质及其组分进行可视化观察 原位 免疫荧光显微镜。通过荧光显微镜追踪标记蛋白的沉积情况，可在细胞去除前后监测特定细胞外基质（ECM）蛋白的动态变化。 Alternatively，可提取分离的ECM进行生化分析，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹。在更大规模上，可对分离的ECM进行质谱分析，开展全面的蛋白质组学研究。通过在无菌条件下进行ECM分离，可获得无菌的ECM层，用于与任何目标细胞的功能性或表型研究。该方法适用于任何贴壁细胞类型，操作相对简便，并可与多种实验设计相结合。

引言

在过去的几十年中，细胞外基质（ECM）已被认为是一个多样化、动态且复杂的环境，参与多种细胞生理和病理过程。在组织层面，ECM 影响细胞信号传导、运动性、分化、血管生成、干细胞生物学、肿瘤发生、纤维化 等等。1,2因此，对细胞外基质（ECM）结构及其依赖性过程的研究在细胞生物学和组织生理学中具有广泛意义。要深入理解ECM的组成、结构及其功能特性的作用机制，需要采用能够精确分离ECM的方法。早期对ECM蛋白的鉴定依赖于从组织中进行分离3如今，从培养细胞中制备细胞外基质（ECM）已变得更加普遍。

细胞来源的细胞外基质（ECM）的分离与分析主要存在两个难点。首先，细胞及其丰富的细胞内蛋白的存在使得难以将ECM作为独立的细胞外结构进行分离。事实上，某些ECM蛋白不仅存在于细胞外基质中，也在细胞内发挥功能4；因此，若要避免将ECM内蛋白的功能与它们在细胞内的作用相混淆，高效去除细胞来源ECM中的细胞内蛋白至关重要。其次，细胞来源的ECM由许多大分子寡聚蛋白组成，这些蛋白在ECM组装过程中常通过共价交联形成网络结构，因而不溶于常规去垢剂。这些特性给ECM的提取及其后续分析带来了困难。为解决上述问题，需要一种能够有效将ECM蛋白与细胞组分分离的方法。

文献中已描述了多种从细胞培养物或组织提取物中分离细胞外基质（ECM）的方法。其中许多方法旨在从组织中提取丰富的ECM蛋白——胶原蛋白，包括使用中性盐3、酸性条件5,6或胃蛋白酶7。从组织提取物中分离总ECM通常需要在ECM分离前对组织进行脱细胞处理。例如，已有研究描述了一种可从人心脏组织中分离ECM的逐级提取法8。首先，使用0.5 M NaCl提取松散结合的ECM蛋白，然后使用十二烷基硫酸钠（SDS）去除细胞。最后，利用4 M盐酸胍提取剩余的ECM蛋白8。此外，也可使用8 M尿素从脱细胞样品中溶解ECM9。其他技术则使用去垢剂（如脱氧胆酸钠10）同时提取细胞和ECM，再通过离心将不溶性的ECM蛋白与可溶性细胞裂解液分离。

本报告中所述的细胞来源ECM分离与分析方法提供了一种可重复的方法，用于去除细胞成分，保留细胞来源的ECM，以便对其进行分析 原位 免疫荧光检测或提取用于进一步的生化分析。该方法可适用于任何贴壁细胞类型，并可扩大规模以用于后续实验，如免疫印迹、质谱分析，或利用分离的细胞外基质（ECM）进行功能研究。该方法也可与活细胞共聚焦显微镜结合使用，通过标记目的蛋白实时追踪其在ECM中的沉积情况。此过程借助带网格的玻璃底培养皿实现。总体而言，该技术能够准确分离细胞来源的ECM，并具备识别和监测单个ECM蛋白沉积及其动态变化的能力。

方案

1. 使用氢氧化铵溶液去除细胞

  1. 以适当的密度接种细胞，制备贴壁细胞。
    注意：可使用任何能够产生足够细胞外基质（ECM）用于分析的贴壁细胞类型。本文中描述使用COS-7细胞（一种含有SV-40病毒DNA序列的非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系）、RCS细胞（一种大鼠软骨肉瘤细胞系）或来自幼儿包皮的正常人真皮成纤维细胞（HDF）株系。HDF仅使用第1至第8代的细胞。
    1. 为活细胞及细胞外基质（ECM）成像、固定ECM的荧光显微镜研究或小规模功能检测用细胞来源ECM的制备，将细胞接种于盖玻片上；为进行SDS-PAGE分析、免疫印迹或蛋白质组学研究，将细胞接种于细胞培养皿中。
      注意：细胞培养条件（接种细胞数量和培养基）取决于细胞类型。具体细胞系或细胞株的接种数量需通过实验经验确定。
    2. 给予细胞足够时间沉积ECM，通常为>16小时。注意：所需时间取决于细胞类型，需通过实验经验确定。若进行异位表达，应给予足够时间以表达转染的目标蛋白并完成ECM的沉积。
  2. 在通风橱中，通过将浓氨水原液用去离子H2O按1:14稀释，在合适的容器中配制20 mM氢氧化铵溶液。
    1. 从培养箱中取出细胞，轻轻移除培养基。沿培养皿壁轻轻加入不含Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动培养皿两次后，用塑料移液管吸出液体。重复此洗涤步骤两次。
  3. 在通风橱中，倾斜每个培养皿，用塑料移液管吸除步骤1.2中的PBS。每100 mm培养皿加入3 mL氢氧化铵，室温孵育5分钟。在5分钟孵育期间，每隔1分钟轻轻晃动培养皿一次，以确保所有细胞完全裂解。步骤1.4–1.7也需在通风橱中进行。
    注意：替代的细胞去除试剂包括2 M或8 M尿素溶液，需与细胞孵育10分钟。
  4. 向每个培养皿中加入大量去离子H2O（每100 mm培养皿至少20 mL），并轻轻晃动。用移液管抽吸去除溶于氢氧化铵的物质（包含氢氧化铵、裂解的细胞和去离子H2O），并将该废液转移至液体废弃物容器中。
  5. 用大量去离子H2O对不溶性ECM层再清洗四次，以确保完全去除所有溶于氢氧化铵的物质。
  6. 若需通过免疫荧光检测ECM，可在室温下加入2%多聚甲醛（PFA；每100 mm培养皿3 mL）固定ECM，固定10分钟。
    警告：PFA在接触皮肤或眼睛时具有高度危险性，严重暴露可能导致肺损伤、窒息、意识丧失甚至死亡。PFA只能在通风橱中操作，并必须佩戴个人防护装备。
  7. 参照步骤1.2，用PBS清洗每个固定后的样品两次，并将PFA溶液弃入适当的液体废弃物容器中。如有需要，可在4 °C条件下将ECM样品保存于PBS中，待后续进行荧光显微镜制样。

2. 通过共聚焦显微镜成像活细胞追踪细胞外基质蛋白的沉积

  1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于COS-7细胞，将250,000个细胞接种至60 mm细胞培养皿中用于转染。
    注意：进行活细胞成像时，必须将细胞转染表达目标细胞外基质（ECM）蛋白的载体，该载体所编码的蛋白需与一种遗传编码的荧光标签在阅读框内融合。此步骤旨在活细胞成像过程中实现对目标ECM蛋白的识别。
  2. 在适当的蛋白质表达时间后（例如， 16 h后，用胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养皿中消化下来，用血细胞计数板计数，并将约150,000个细胞接种至35 mm带网格的玻璃底培养皿中用于成像。让细胞复附2 h并开始细胞外基质（ECM）沉积（具体时间取决于细胞类型，需通过实验确定）。
    注意：使用不含酚红的细胞培养基，因为酚红可能产生红色调，影响图像质量。
  3. 在上述2小时期间，设置配备37 °C培养箱腔室和CO₂2 供电。成像前让培养 chamber 和培养皿内的温度稳定至 37 °C，此过程可能需要长达 1 小时。
  4. 将细胞接种至35 mm带网格培养皿中，加入荧光细胞标记物孵育30分钟。成像前用不含酚红的培养基洗涤细胞两次。
    注意：可使用细胞质荧光标记物来观察细胞体积，或使用膜整合标记物来观察细胞边界。
  5. 使用共聚焦显微镜的20倍物镜和相差成像模式，确定一个包含适量细胞的合适网格区域>3）选择贴壁良好且状态健康的细胞。在荧光显微镜下，使用63X或100X物镜以及相应的激发波长，确认所选网格方格内细胞中目标蛋白的表达情况。
  6. 使用z轴堆栈软件设置荧光和相差时间序列成像。设定 "开始" 堆叠至细胞外基质层正下方 "结束" 将z轴扫描范围设置在细胞体稍上方。z轴步长设为0.3 µm，z轴扫描总深度根据细胞类型在5至10 µm之间选择，可获得每个时间点15至30个z层面图像。
  7. 定期在设定的时间段内捕获荧光（对于红色荧光蛋白（RFP），激发波长 = 555 nm，发射波长 = 584 nm）和相差图像。例如，使用延时成像软件将时间间隔设置为 2 min，持续时间为 2 h。选择 "开始" 单击按钮，开始在设定的时间段内采集Z轴层析图像。
  8. 在规定时间结束后，按照步骤 1.1–1.5 所述方法将细胞从培养皿中取出，以确认荧光标记的目的蛋白在细胞外基质（ECM）中的定位。
  9. 使用相差成像和20倍物镜重新定位相关网格方格。
  10. 切换至63倍物镜，通过荧光显微镜识别细胞外基质层。将此图像与提取前的图像进行比较

3. 细胞功能性实验用细胞来源细胞外基质的无菌制备

  1. 培养一组细胞（该 "基质生产者" 细胞）置于盖玻片上，另一群（即 "测试" 在标准培养条件下，于100 mm细胞培养皿中培养细胞至少24小时。
    注意：这两种细胞可以是任意两种不同的贴壁细胞，实验设计可包括对其中一种或两种细胞群体进行转染，以表达带荧光标记的细胞外基质蛋白。
  2. 在用于细胞培养的超净工作台中，制备不含 Ca 的无菌 PBS 溶液2+/毫克2+，20 mM 氢氧化铵（见步骤 1.3），以及去离子 H2O 通过无菌的0.2 µm滤器过滤，收集到适当的无菌容器中。
  3. 保持无菌操作，轻柔冲洗 "基质生成者" 用无菌 PBS 将盖玻片上的细胞洗涤三次（见步骤 1.2）。
  4. 用无菌移液管吸除 PBS，并将其弃置于合适的液体废弃物容器中。加入 20 mM 无菌氢氧化铵（3 mL/100 mm 培养皿），间歇摇动孵育 5 分钟。
  5. 加入大量无菌去离子 H2O 到 "基质产生者" 培养皿，每100 mm培养皿至少20 mL，摇动后将细胞裂解液倒入合适的废液容器中。
  6. 重复步骤 3.5 四次，以确保完全去除氨水溶解的物质。
    注意：由细胞沉积的 ECM "基质产生菌" 盖玻片上的细胞随后可为任何目标测试细胞的功能检测提供无菌的细胞外基质。
  7. 将细胞储存皿中的待测细胞与1.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（每100 mm培养皿，含0.05% w/v胰蛋白酶和0.02% w/v EDTA的Hank's平衡盐溶液）共同孵育，直至待测细胞从培养皿上脱落。加入细胞培养基，以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  8. 将待测细胞重悬于新鲜的无菌培养基中，使用血细胞计数板进行计数。取适量数量的待测细胞接种至载玻片上无菌分离的细胞外基质（ECM）表面。在合适的细胞培养基中培养2–3小时，或根据实验设计要求的时长进行培养。
  9. 为观察肌动蛋白细胞骨架的结构，用2% PFA固定待测细胞，并使用异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽（FITC-phalloidin；激发波长 = 490 nm，发射波长 = 525 nm）染色以显示F-actin，同时使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；激发波长 = 358 nm，发射波长 = 461 nm）染色以显示细胞核11.
    注意：将接种于异源细胞来源的细胞外基质上的待测细胞与接种于自身来源细胞外基质上的待测细胞进行形态学及肌动蛋白组织结构的比较。

4. 用于 SDS-PAGE、免疫印迹分析或蛋白质组学的细胞外基质分离

  1. 将目标贴壁细胞接种于100 mm细胞培养皿中（蛋白质组学实验使用5至10个培养皿，免疫印迹实验使用1至2个培养皿），根据细胞类型选择适宜的培养时间（24–96小时），以促进细胞外基质（ECM）的分泌与沉积。
  2. 按照步骤 1.1–1.5 所述去除细胞。
  3. 将每块培养皿倾斜一定角度，以沥去残留的 H2O至培养皿底部，并小心移除任何残留的H2用 p200 移液器吹打至孔板完全干燥。
  4. 同时，将含有100 mM二硫苏糖醇（DTT）的SDS-PAGE上样缓冲液置于加热块中95 °C加热2 min，随后加入培养板中。每100 mm培养板加入200 µL上样缓冲液，适用于后续进行免疫印迹检测的样品。
    1. 通过质谱分析细胞外基质（ECM）时，可收集培养皿中的SDS-PAGE样品缓冲液（如下文步骤4.5和4.6所述），将其重新加热至95 °C，并在2-3个额外的培养板中使用相同等分试样，以获得更浓缩的样品。
  5. 使用细胞刮刀彻底刮取培养皿上的细胞外基质，确保培养皿的所有区域均已被刮取。
  6. 用细胞刮将样品刮至培养皿的一侧，并用200 µL移液器吸头将其转移至离心管中。
  7. 将细胞刮刀尖端残留的SDS-PAGE上样缓冲液提取物转移至离心管中，以尽量减少细胞外基质材料的损失。对于需要浓缩的样品，可将同一份SDS-PAGE上样缓冲液重新加热至95 °C，并在2–3个额外的培养板中重复使用。
  8. 通过SDS-PAGE分离ECM蛋白12，使用7%或4-7%的梯度聚丙烯酰胺凝胶。
    注意：使用预染蛋白质标记物较为方便。
  9. 为提高高分子量ECM蛋白的分辨率，延长凝胶电泳时间，使37 kDa分子量标记物迁移至凝胶底部附近，且分子量标记物 <37 kDa 的蛋白已跑出凝胶。
  10. 用于细胞外基质蛋白的蛋白质组学分析时，用蛋白质染色剂对凝胶染色并采集图像。从凝胶中切下目标条带，用胰蛋白酶消化，然后通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-质谱进行分析。13.
  11. 或者，为了对细胞外基质提取物进行更全面的分析，以及分析整个样品，可将凝胶条带切成若干片段，用胰蛋白酶消化后，进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析14.
  12. 或者，进行免疫印迹检测15将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用半干转法，15 V条件下至少转膜1小时10分钟，以确保高分子量细胞外基质（ECM）蛋白的有效转移。使用Ponceau S染色法对膜上转移的总蛋白进行可视化检测。
  13. 在完成步骤4.11后，使用抗体检测细胞外基质（ECM）蛋白的存在和/或对其进行半定量分析15.
    1. 用含2%（w/v）脱脂奶粉的TBS-Tween 20缓冲液（封闭缓冲液）在4 °C下封闭膜过夜。将针对细胞外基质蛋白的特异性抗体用封闭缓冲液稀释后，室温孵育膜1.5小时（纤连蛋白抗体按1/600稀释，血小板反应蛋白-1抗体按1/150稀释）； 补充表1).
    2. 通过使用针对丰富细胞内蛋白（如肌动蛋白或微管蛋白）的抗体（抗肌动蛋白抗体按1/10,000稀释，抗微管蛋白抗体按1/5,000稀释）对同一印迹膜重新孵育，检测ECM分离的质量。

结果

步骤 1.1-1.5 中所述方案旨在去除细胞，从而保留细胞来源的细胞外基质（ECM）。该方案应用于在玻璃盖玻片上培养 96 小时的 COS-7 细胞，并通过荧光显微镜分析细胞来源的 ECM。根据 DAPI 和鬼笔环肽染色结果，氢氧化铵处理能有效去除细胞，表现为细胞核和肌动蛋白细胞骨架的消失（图 1）。使用 2 M 尿素提取细胞的效果不如氢氧化铵，处理后仍可检测到 DAPI 和鬼笔环肽染色的残留信号。8 M 尿素的处理效果与氢氧化铵相似（图 1）。接下来，对氢氧化铵处理前后细胞来源的 ECM 进行可视化观察（步骤 2.1-2.11）。将编码单体红色荧光蛋白（mRFP）标记的血小板反应蛋白-1 C 末端三聚体（mRFPovTSP1C）11 的质粒转染至 COS-7 细胞，并将细胞培养于底部带有网格的 35 mm 玻璃底培养皿中。

铺板后2小时，在共聚焦显微镜下观察到一个含有多个健康细胞且表达mRFPovTSP1C的合适网格区域。首先对该区域采集参考的相差图像，随后每1分钟进行一次荧光延时成像，持续2小时（图2A）。然后使用氢氧化铵去除细胞，并在相差显微镜下重新定位培养皿上同一网格区域，再通过荧光显微镜重新分析。此时网格区域内已无细胞存在，但荧光显微镜检测显示mRFPovTSP1C仍保留在细胞外基质（ECM）中，表现为特征性的点状信号（图2A）。通过比较细胞去除前后荧光信号的分布模式，可识别出细胞去除前已在ECM中沉积的mRFPovTSP1C。在两幅图像中均能观察到的荧光点状结构（图2A，示例以箭头标出）被推断为与ECM相关联。

随后采用氢氧化铵处理，从培养的贴壁细胞中分离天然细胞外基质（ECM）。人真皮成纤维细胞（HDF）在玻璃盖玻片上培养96小时后，用氢氧化铵去除细胞，并使用抗胶原蛋白I抗体对ECM进行检测，结果显示典型的纤维状和网状染色模式16（图2B）。在固定但未透化的鼠软骨肉瘤细胞（RCS）周围以及去除RCS细胞后的ECM中，观察了纤连蛋白的分布模式（图2C）。此外，氢氧化铵法分离ECM也在无菌条件下进行，以便将“测试”细胞重新接种至ECM上，用于表型或功能研究。例如，将“测试”COS-7细胞接种于RCS细胞产生的无菌ECM上培养2小时，随后固定、透化，并通过FITC-鬼笔环肽染色分析F-肌动蛋白的排列情况，同时与自身产生ECM的COS-7细胞进行比较（步骤3.1–3.9）（图3）。

在更大规模上，该方法可用于分离细胞外基质（ECM），以进行生化实验。例如，将RCS细胞在两个100 mm的细胞培养皿中培养7天，然后按照步骤4.1–4.7进行操作。通过将细胞来源的ECM刮入热的SDS-PAGE上样缓冲液中收集蛋白质，并在还原条件下使用7%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分离。对凝胶进行蛋白质染色后，将四条主要条带分别切下，并通过质谱分析（图4A）。鉴定出多种ECM蛋白，包括纤连蛋白（fibronectin）、血小板反应蛋白1（thrombospondin 1, TSP1）、血小板反应蛋白5/软骨寡聚基质蛋白（thrombospondin 5/cartilage oligomeric matrix protein, TSP5 / COMP）以及基底膜蛋白聚糖matrilin-1（图4B）。

或者，可通过免疫印迹法检测小规模制备的细胞外基质（ECM）。例如，将异位表达mRFPovTSP1C的COS-7细胞来源的ECM通过SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜上，并使用抗RFP抗体对RFP进行检测（图4C）。该技术的灵敏度足以检测TSP1天然三聚体（mRFPovTSP1C）与工程化五聚体TSP1 C末端区域（mRFP-TSP-5-1C）17在沉积量上的差异（图4C）。为研究人真皮成纤维细胞（HDF）内源性ECM，通过免疫印迹法检测了细胞裂解物或分离ECM中特定蛋白的存在情况。特征性ECM蛋白纤连蛋白（fibronectin）和血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1）在ECM中被检测到，而丰富的细胞内蛋白α-微管蛋白（α-tubulin）和β-肌动蛋白（β-actin）则在分离的ECM中未检出（图4D）。

不同处理条件下的F-肌动蛋白；显微图像；DAPI染色；PFA、尿素、NH4OH处理条件。
图1：细胞去除方法的比较。COS-7细胞在盖玻片上高密度培养96小时，用2% PFA固定，并用0.5% Triton X-100透化，或按所示条件进行细胞去除处理。随后用FITC-鬼笔环肽染色以显示F-肌动蛋白，用DAPI染色以显示细胞核。比例尺 = 25 µm。本图改编自《细胞科学杂志》的原始发表文献11。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞和细胞外基质分析；相差和荧光；去细胞前后。
图 2： 分离的细胞外基质中细胞外基质蛋白的鉴定。（A）在底部为玻璃、带网格标记的35 mm培养皿中培养2小时的表达mRFPovTSP1C的COS-7细胞的相差和荧光图像。图像显示了用氢氧化铵去除细胞前后的结果。相差图像中以虚线标示出网格字母的边缘。白色箭头指示在去细胞前后均存在的荧光点状结构示例。（B）通过间接免疫荧光法检测HDF细胞外基质中的I型胶原。HDF培养96小时后用氢氧化铵去除细胞，并对细胞外基质进行人纤维性I型胶原染色。同时仅用FITC标记的抗兔二抗对细胞外基质进行染色。（C）通过间接免疫荧光法检测RCS细胞周围或分离的RCS细胞外基质中纤连蛋白的定位。RCS细胞培养48小时后，用2% PFA固定，并对纤连蛋白和DAPI进行染色。在平行的培养皿中，使用20 mM氢氧化铵去除细胞，然后对细胞外基质进行纤连蛋白和DAPI染色。同时仅用FITC标记的抗小鼠IgG抗体对细胞进行染色。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜；经FITC-Phalloidin和DAPI染色的COS-7细胞；细胞骨架可视化。
图3： 无菌细胞外基质（ECM）在功能研究中的应用。 RCS“基质生成”细胞在玻璃盖玻片上培养48小时，随后在无菌条件下用20 mM氢氧化铵处理以去除细胞。将COS-7“测试”细胞接种于含有或不含分离RCS细胞外基质（ECM）的盖玻片上培养2小时，用2%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100透化，然后用FITC-Phalloidin染色以显示F-肌动蛋白，DAPI染色以显示细胞核。接种于RCS细胞外基质上的COS-7细胞铺展更充分，并形成较大的微丝束（示例以箭头标示）和边缘皱褶。请点击此处查看该图的放大版本。

SDS-PAGE 蛋白条带，包括纤连蛋白和 TSP1 在内的细胞外基质成分的 Western 印迹分析。
图 4： 通过 SDS-PAGE、质谱或免疫印迹鉴定分离的细胞外基质中的蛋白质。（A）RCS 细胞培养 7 天后，用 20 mM 氢氧化铵去除细胞，将细胞外基质（ECM）刮入含 100 mM DTT 的热 SDS-PAGE 上样缓冲液中。在还原条件下，使用 7% 聚丙烯酰胺凝胶对 ECM 样品进行 SDS-PAGE 分离。通过蛋白质染色鉴定了四个显著条带（箭头 1–4）。（B）RCS 细胞 ECM 中条带 1–4 的蛋白质通过 MALDI 质谱进行鉴定。（C）表达 mRFPovTSP1C（三聚体）或 mRFP-TSP-5-1C（五聚体）的 COS-7 细胞培养 48 小时后，用 20 mM 氢氧化铵处理以去除细胞，并将 ECM 收集至含 100 mM DTT 的热 SDS-PAGE 上样缓冲液中。ECM 样品在还原条件下经 7% 聚丙烯酰胺凝胶 SDS-PAGE 分离后，转移至 PVDF 膜，并用抗 RFP 抗体进行探针检测。该图板修改自《Bioscience Reports》17 的原始出版物。（D）人真皮成纤维细胞（HDF）培养 96 小时后，分别用 PBS 中含 2% 脱氧胆酸钠（细胞裂解物）或 20 mM 氢氧化铵处理以去除细胞。将 ECM 刮入热 SDS-PAGE 上样缓冲液中。两种组分在还原条件下经 10% 聚丙烯酰胺凝胶进行 SDS-PAGE 分离，转移至 PVDF 膜，并按指示使用相应抗体进行探针检测。各图中，分子量标记物的位置以 kDa 表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

方案中的关键步骤

该方法包含一些关键步骤，必须严格遵循，以确保细胞外基质（ECM）的成功分离与分析。例如，需使用氢氧化铵去除细胞，从而分离出用于分析的ECM。尽管氢氧化铵在避光的水溶液中较为稳定，并可在室温下保存，但每次使用后必须将瓶盖 tightly 重新密封。由于气体可能从溶液中挥发，导致浓度降低，我们强烈建议每6至8周更换一瓶新的氢氧化铵。此外，工作液应每次实验前新鲜配制。使用大量去离子水充分洗涤以彻底去除细胞也至关重要。若这些步骤执行不充分，细胞残留物可能仍附着于培养皿上，进而污染后续分析。若细胞培养时间达到或超过10天，可能需要增加去离子水的洗涤次数。需要注意的是，与细胞层相比，分离得到的ECM层通常非常薄11，因此在成像过程中识别ECM时需格外小心。为了有效地将分离的ECM提取至SDS-PAGE上样缓冲液中，上样缓冲液中必须含有还原剂。为最有效地剥离ECM，必须使用煮沸温度的上样缓冲液。在通过SDS-PAGE电泳对ECM样品进行蛋白染色或蛋白质组学分析的实验中，关键是要将多个培养皿量的ECM刮入同一份上样缓冲液中，以获得浓缩的样品。

修改与故障排除

不同细胞类型的细胞外基质（ECM）蛋白的产生和分泌可能存在显著差异，因此应确定ECM分泌和沉积所需的时间周期 从头合成 对于每种细胞类型均是如此。还需要注意，细胞外基质（ECM）的组成会随着培养过程中细胞密度和培养时间的变化而动态改变。18在设计实验时应考虑到这一因素。显然，细胞类型的选择对于该方法至关重要，尤其是在通过质谱分析提取细胞外基质（ECM）时，可能需要较大量的总ECM蛋白。

该技术的局限性

分泌细胞外基质（ECM）蛋白水平极低的细胞在使用该方法时将更具挑战性。目前，非贴壁细胞、三维细胞培养或细胞侵袭实验均不适用于该方法进行ECM的分离。该方法最适合用于标准的"二维"细胞培养。由于氢氧化铵提取法会完全去除细胞，因此与细胞上表面相关联以及已分泌但未交联的ECM蛋白也会被一并去除，仅在培养皿上留下位于细胞底部及周围组装形成的薄层ECM11,17。要定量测定氢氧化铵提取所释放的ECM含量较为复杂，因为所释放的物质还包括在分泌前或从细胞表面摄取后存在于细胞内的ECM蛋白。

该技术相对于现有/替代方法的重要性

利用分离的细胞外基质（ECM）开展多种实验，在细胞生物学和组织生理学研究中具有重要意义，同时也对组织再生和组织工程领域具有深远影响。与使用纯化的胶原蛋白或其他纯化ECM蛋白所形成的凝胶相比，该方法的优势在于细胞能够以其天然大小组装复杂的ECM结构，并通过天然的交联机制形成，且各ECM蛋白的比例与其来源细胞类型相匹配。例如，对RCS细胞来源ECM的蛋白质组学研究显示，富含matrilins以及COMP/TSP5，这与软骨样ECM的预期组成一致19,20（图4）。总体而言，细胞来源ECM的分析因其本身是一种广泛而复杂的多蛋白网络而受到限制，这种网络导致共价交联以及许多ECM蛋白不溶，同时还可能因ECM提取物中混杂细胞内蛋白而造成污染。一项旨在从组织中分离ECM组分用于蛋白质组学分析的多步骤流程，仅在鉴定出的全部蛋白质中获得了8%的ECM蛋白21；然而，来自ECM蛋白的肽段占鉴定总肽段的73%。本ECM分离与分析方法能够快速、可靠地去除细胞成分，同时保留ECM蛋白。该方法适用于多种细胞类型及后续应用，有助于在细胞培养体系中对ECM生物学特性及细胞-ECM相互作用进行深入分析。我们的实验方案详细说明了如何在不同规模上应用该方法，以探究ECM的结构组织、动态变化或成分组成，以及分离ECM对细胞产生的功能影响等广泛的科学问题。

掌握该技术后的未来应用或发展方向

展望未来，该方法可被改进用于三维细胞培养，从而提升其生理相关性。脱细胞化的天然组织作为支架，在修复缺失或受损组织以及作为移植替代方案（例如在心力衰竭后）方面具有巨大潜力22。这种方法有望克服供体来源不足和免疫排斥等问题。本报告所述方法的未来应用可探索其在三维细胞培养或组织脱细胞化中的使用，这将进一步拓展该技术的应用范围。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们非常感谢克利夫兰诊所勒纳研究所蛋白质组学与代谢组学实验室的 Belinda Willard 博士，感谢其完成了 RCS 细胞外基质的蛋白质组学分析。我们感谢英国医学研究理事会（资助编号 K018043）对 JCA 提供的经费支持。

材料

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COL1A1 抗体NovusNB600-408兔多克隆抗体。可与纤维状胶原蛋白及其他 I 型胶原蛋白发生反应。免疫荧光（IF）：1/200
纤维连接蛋白抗体SigmaF3648兔多克隆抗体。Western 印迹（WB）：1/600，孵育 1.5 小时。免疫荧光（IF）：1/200
血小板反应蛋白 1 抗体ThermoFisher MA5-13398小鼠单克隆抗体 A6.1。Western 印迹（WB）：1/150，孵育 1.5 小时
RFP 抗体Abcamab62341兔多克隆抗体。Western 印迹（WB）：1/2,000，孵育 2 小时
β-肌动蛋白抗体SigmaA1978小鼠单克隆抗体 AC-15。Western 印迹（WB）：1/10,000，孵育 1.5 小时
α-微管蛋白抗体SigmaT9026小鼠单克隆抗体 DM1A。Western 印迹（WB）：1/5,000，孵育 1.5 小时
Cell Tracker GreenThermoFisher C2925荧光细胞标记物。使用浓度为 1 µM，孵育 30 分钟
异硫氰酸荧光素（FITC）-鬼笔环肽SigmaP-5282储存液 = 50 mg/mL 溶于 DMSO。使用稀释比例为 1/50，孵育 45 分钟
FITC 标记的山羊抗小鼠 IgGSigmaF8771免疫荧光（IF）：1/50，孵育 1 小时
FITC 标记的绵羊抗兔 IgGSigmaF7512免疫荧光（IF）：1/50，孵育 1 小时
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgGLI-COR926-80010Western 印迹（WB）：1/50,000，孵育 1 小时
HRP 标记的山羊抗兔 IgGLI-COR926-80011Western 印迹（WB）：1/100,000，孵育 1 小时
含 DAPI 的 Vectorshield 封片剂VectorH-1200避光，4 °C 保存
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）SigmaD6429使用前预热
成纤维细胞生长培养基PromoCellC-23010使用前预热，添加 50 µg/mL 抗坏血酸
酚红-free DMEMThermoFisher21063-029使用前预热
胰蛋白酶-EDTA 溶液SigmaT3924使用前预热
带网格的玻璃底培养皿MatTekP35G-2-14-C-GRID
NH4OH，28-30% 溶液Sigma221228用去离子水稀释至 20 mM。开封后避光、密封保存。
多聚甲醛，16% 溶液Alfa Aesar43368用 PBS 稀释至 2%（v/v）
脱氧胆酸SigmaD2510终浓度为 2%（v/v）
Triton X-100SigmaT8787稀释至终浓度 0.5%（v/v）
GelCode Blue 染色试剂ThermoFisher 24590用于 SDS-PAGE 凝胶的蛋白质染色
Precision Plus 蛋白质标准品Biorad161-0374SDS-PAGE 凝胶用蛋白质标准品
Trans-Blot SD 半干式转膜仪Biorad1703940高效转移高分子量蛋白质
PVDF 转膜膜MilliporeISEQ00010Immobilon-PSQ 
丽春红 S 染色液SigmaP7170PVDF 膜用可逆性蛋白质染色
WesternSure 增强型化学发光（ECL）底物LI-COR926-80200
高性能化学发光胶片GE Healthcare28906837
无菌过滤装置，MILLEX-GVMilliporeML481051
SP8 AOBS 共聚焦激光扫描显微镜Leica需配备环境控制室以调节温度和 CO2 浓度（Life Imaging Services）
缩略语说明：IF，免疫荧光；WB，Western 印迹

参考文献

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