使用GFP标记的TMEM184A构建体验证肝素受体身份

摘要

采用一种编码C端带有GFP标签的TMEM184A的表达载体，用于真核表达，该载体被应用于相关实验，以验证TMEM184A在血管细胞中作为肝素受体的身份。

摘要

通过基于亲和力的分离方法和生物信息学分析鉴定出新蛋白质后，这些蛋白质通常尚未得到充分表征。针对预测序列内特定肽段的抗体可用于部分定位实验，但往往无法排除抗体与其他分子发生非特异性相互作用的可能性。这一现状促使我们开发一系列依赖于蛋白质序列的检测方法。具体而言，我们获得并使用了一种在目标蛋白的C末端融合了绿色荧光蛋白（GFP）编码序列的表达载体来实现这些目的。最初设计并实施了用于表征蛋白质定位、配体亲和性及功能获得的实验，以确证TMEM184A为肝素受体¹。此外，该表达载体还可用于研究膜拓扑结构问题以及蛋白质与配体之间相互作用的细节。本报告介绍了一系列基于在血管细胞中表达的GFP-TMEM184A融合蛋白的实验方案，这些方法可轻松适用于其他新发现的蛋白质。

引言

通过亲和力为基础的分离方案结合部分序列测定，常用于鉴定具有新功能的候选蛋白质。近期新鉴定出的蛋白质实例包括跨膜蛋白184A（TMEM184A），该蛋白是通过肝素亲和相互作用鉴定出的一种肝素受体。¹，以及TgPH1，一种可结合磷脂酰肌醇PI(3,5)P₂的pleckstrin同源结构域蛋白₂²其他新蛋白质的鉴定涉及对肽段进行直接序列分析，例如由Vit所采用的方法。 等 利用跨膜肽段鉴定先前未表征基因的蛋白质产物³同样，可通过生物信息学方法搜索已知的蛋白质家族来鉴定新的蛋白质序列，例如鉴定新的4TM蛋白。⁴水通道蛋白家族基因序列的分析也促成了具有新功能的新成员的发现⁵鉴定后，通常下一步是分析蛋白质功能，有时可通过特定的蛋白质功能检测方法进行分析，例如水通道蛋白的情况。

在可能的情况下，可利用特定的酶学或其他类似方法来检测新发现蛋白质的功能 体外 功能检测。由于许多新蛋白质的功能依赖于仅在完整细胞或生物体内发生的复杂相互作用， 体外 检测方法并不总是有效的。然而，该 体内 检测方法的设计必须依赖于基因序列。在细胞培养和/或简单模式生物中，基因敲低可为蛋白....

方案

1. GFP-蛋白表达载体的设计

1. 购买或设计并构建一个基于目标蛋白的GFP标签表达载体。
   注意：对于购买的构建体，可从商业实验室获得标准载体，这些载体包含部分或全部以下建议：对于膜蛋白，选择将GFP定位在C末端，因为这样更不容易干扰膜蛋白的转运。如果认为目标蛋白的C末端紧密折叠形成蛋白结构域，则应在目的基因与GFP之间考虑加入一段间隔序列。选择适用于真核细胞广泛表达的构建体，但同时允许在细菌系统中进行构建体的扩增。包含一个切割位点（例如TEV蛋白酶识别位点），以便在某些实验中若GFP可能干扰蛋白活性时可将其切除。可添加其他插入片段，例如用于定位或亲和相互作用的额外标签例如， His6）。对于本文所述的实验，此步骤并非必需，但可能有助于其他实验，或在需要去除GFP时，直接位于基因与GFP之间的区域具有应用价值。

2. 血管细胞中GFP-TMEM184A的表达

1. 如先前报道的方法，在0.2%明胶包被的组织培养皿中培养内皮细胞或血管平滑肌细胞^1,6,7。
2. 向已冲洗过的100 mm或更大尺寸的融合细胞培养皿中加入5 mL 细胞培养用胰蛋白酶溶液（0.5% w/v）。在37 °C孵....

结果

理论上，任何DNA质粒转染细胞均可通过脂质体转染试剂实现，但已有文献报道表明，采用电穿孔法将GFP质粒转染入内皮细胞的效率更高¹²。本方案通常可在所用的原代内皮细胞和血管平滑肌细胞中实现超过80%的GFP质粒表达。所使用的质粒构建基于一种 commercially available system，可实现该质粒的快速构建与递送。该质粒的主要设计目的聚焦于定位问题，因此确保其正确靶向细胞膜，同时实现高效的真核蛋白表达及持续的质粒表达是首要考虑因素。其他设计考量还包括：针对不同亚细胞定位的蛋白或C末端位于折叠区域的蛋白，GFP的插入位置可能需要调整；是否需要移除GFP（例如引入蛋白酶切割位点）；以及是否添加第二个亲和标签。后者可为GFP融合蛋白的纯化提供替代方法，并有助于在结合实验中将其稳定固定于载体表面。为验证不同商业抗体针对TMEM184A的染色模式，将表达GFP-TMEM184A的血管细胞与使用商业抗体染色的相同细胞进行比较。转染后的时间长短会影响GFP-TMEM184A的分布，其表达呈现随时间累积的趋势，至少持续72小时.......

讨论

本文所报告的实验方案旨在为确认TMEM184A作为血管细胞中肝素受体的身份提供确证性证据¹。基因敲低技术通常被用作确认新蛋白鉴定的一种手段。然而，敲低后出现的某些功能丧失通常不足以证明候选蛋白确实是正确的受体（或其他功能性蛋白）。同样重要的是，必须有证据表明该候选蛋白确实表现出预期的功能。使用带有GFP标签的新型基因构建体，可进行功能获得实验，并可通过GFP亲和性实现对标签蛋白的分离。本方案中采用的电穿孔技术实现了极高的转染效率（超过80%的细胞表达了该构建体）。然而，如果无法使用或不希望使用电穿孔，也可采用其他转染方法。选择GFP标签构建体来验证新蛋白功能具有多个优势。首先，GFP可作为转染和基因表达的报告分子，若缺乏该蛋白表达的细胞系，还可通过GFP监测过表达情况。其次，GFP标签提供了一种不依赖配体亲和性或针对肽段的抗体即可纯化蛋白的工具。第三，GFP标签可用于分析复杂的免疫荧光定位，通过使用针对目标蛋白序列中独特肽段的抗体进行染色，判断实际的基因产物是否具有相似的亚细胞定位。

利用基因构建体进行功能获得性实验已被用于多种目的，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GFP-TMEM184A 载体	OriGene	RG213192
罗丹明标记的肝素	Creative PEGWorks	HP-204	避光保存
荧光素标记的肝素	Creative PEGWorks	HP-201	避光保存
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
多聚甲醛（PFA，无甲醇）	Thermo Sci Pierce Biotech，可通过 Fisher Scientific 购买	Fisher 编号 PI28908	需在通风橱中使用
Reacti-bind 链霉亲和素包被板（链霉亲和素包被的黑色 96 孔板）	Thermo Sci Pierce Biotech，通过 Fisher Scientific 提供	Fisher 编号 PI15510	注意保质期
黑色 96 孔板	Corning Life Sciences 塑料制品，通过 Fisher Scientific 购买	Fisher 编号 064432
A7r5 血管平滑肌细胞系	ATCC	CRL 1444	可转换至 MEM 培养基中培养1
BAOEC 牛主动脉内皮细胞	Cell Applications, Inc.	B304-05	初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养1,7
BAOSMC 牛主动脉平滑肌细胞	Cell Applications, Inc.	B354-05	初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养1
RAOEC 大鼠主动脉内皮细胞	Cell Applications, Inc.	R304-05a	初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养7
生物素标记的抗 GFP 抗体	Thermo Sci Pierce Biotech，通过 Fisher Scientific 提供	MA5-15256-BTIN
链霉亲和素包被的磁珠	Sigma	S1638
HeBS	可从 Bio-Rad 购得		可在实验室自行配制，pH 值为 6.8
靶向 TMEM184A N 末端的抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	目前唯一已知的靶向 TMEM184A N 末端区域的抗体。
靶向 TMEM184A C 末端的抗体	购自 ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	在 图 1 中使用
GFP 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	在 图 5 中使用
TRITC 或 Cy3 标记的二抗	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152（驴抗兔，TRITC） 715 165 150（驴抗小鼠，Cy3）	具有最小交叉反应性，以减少非特异性染色。
CHAPS	购自 Sigma	C5849	请注意，该特定货号已停产。  供应商将提供替代产品信息。
活细胞成像用 35 mm 培养皿	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
共聚焦显微镜	Zeiss	配备 63X 油镜的 LSM 510 Meta	用于 图 1、图 2 和图 3 的图像采集和活细胞成像
共聚焦显微镜	Nikon	配备 60X 油镜的 C2+ 共聚焦系统	用于 图 5 的图像采集
共聚焦显微镜	Zeiss	配备 63X 油镜的 Zeiss LSM 880	用于 图 2C 的图像采集
电穿孔设备	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell 系统
电穿孔杯	可从 MidSci 购得	EC2L	也可从设备供应商处获得
酶标仪	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro 酶标仪	读数时检测孔中心区域而非表面。
用于测量染色强度的计算机程序	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ 程序和相关信息可在线获取	可使用任何合适的软件。更多细节请参见 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html
细胞培养用胰蛋白酶溶液	Sigma	T4174	以 10 倍浓缩液形式购买