方法文章

出生后小鼠听泡的解剖：中耳听小骨的分离与组织学分析

DOI：

10.3791/55054

⸱

2017年1月4日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Biology, Keio University School of Medicine, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种从新生小鼠中分离听泡、耳囊及听小骨以进行整体封片和组织学分析的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在大多数哺乳动物中，中耳内的听小骨（包括锤骨、砧骨和镫骨）是最小的骨骼。在小鼠中，一个称为听泡的骨性结构容纳着听小骨，而听囊则包裹内耳，即耳蜗和半规管。小鼠听小骨对听力至关重要，因此在耳鼻喉科研究领域备受关注；但其骨代谢、发育及进化也与其他多个学科密切相关。成年小鼠骨代谢的改变可能影响听力功能，多种基因缺陷小鼠在子宫内即表现出听小骨形态发生的变化。in utero。尽管小鼠听小骨体积微小，只要了解其解剖方位和三维结构，对其进行操作是可行的。本文将介绍如何解剖出生后小鼠的听泡和听囊，并通过去除部分听泡来分离单个听小骨。我们还将讨论如何以不同方向包埋听泡和听囊，以制备适合生成锤骨纵切面、水平切面或冠状切面的石蜡或冰冻切片。最后，我们列举了小鼠与人类听小骨之间的解剖学差异。这些方法有助于分析小鼠听小骨及中耳在病理、发育和进化方面的特征。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中耳的三块听小骨，即锤骨、砧骨和镫骨，构成哺乳动物特有的听觉链，将声音从鼓膜传递到内耳或耳蜗1,2。通过测量听觉脑干反应（ABR）阈值，可评估小鼠的听力功能3-6，而使用激光多普勒测振法（LDV）可监测鼓膜后锤骨的振动情况7。结合ABR、LDV和畸变产物耳声发射（DPOAE）的测量，可区分传导性听力损失与感音神经性功能障碍8。

鉴于听力和耳部健康对各年龄段患者的福祉至关重要，耳部疾病的动物模型十分必要。例如，中耳炎是一种在人类婴儿和儿童中极为常见的耳部感染，若未使用适当的抗菌药物进行治疗，可发展为严重急性中耳炎并引发并发症9。中耳炎的小鼠模型有助于理解其发病机制，并可用于治疗策略的开发10,11。

小鼠听小骨（除锤骨的关节部分外）均由软骨内成骨形成12,13，在骨代谢与形态发生研究中具有重要意义。首先，其体积微小，可利用X射线或荧光显微镜对保留完整骨膜的骨骼进行高分辨率分析14。其次，可分析异常骨代谢（如骨吸收过度或不足）或骨细胞间相互作用受损15是否可能促成听力损失3,4,7。第三，多种基因缺陷小鼠模型中已报道存在听小骨形态发生异常，例如缺失Hoxa216-19、Msx120-22、Prrx123、Goosecoid（Gsc）24,25、Bapx113、Tshz126、Dusp6（Mkp3）27、Noggin（Nog）28、Fgfr129、甲状腺激素受体（Thra、Thrb）5、Bcl230等基因的小鼠1,31，或Hoxa2过表达的小鼠32。最后，尽管体积微小，与听小骨相关的结构（如肌肉33和关节34,35）仍可被观察和研究。

小鼠的听小骨比人类的听小骨更小，但值得注意的是，小鼠中耳并非人类中耳的微型复制品。例如，在小鼠中，镫骨动脉贯穿镫骨环，并终生存在36，而在人类中，胚胎期的镫骨动脉在妊娠期间即退化消失。此外，小鼠锤骨的形态也与人类骨骼不同（见图6）。在小鼠中，听泡（鼓泡）包绕着含气的中耳腔，而在人类中，听小骨则位于颞骨内由骨小梁构成的乳突气房中，而非由鼓泡包绕37。在两个物种中，耳囊（骨迷路）均包绕内耳的耳蜗和半规管。中耳的比较生物学与进化生物学已有广泛综述38-40。

以下方案首先描述了如何解剖分离听泡和耳囊，它们分别主要包含中耳和内耳结构。本方案还演示了如何从听泡中分离出锤骨、砧骨和镫骨。最后，介绍了如何对听泡和耳囊进行定向，以便包埋，为听小骨的组织切片做准备。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中进行的所有动物实验均经庆应义塾大学机构动物护理与使用委员会（IACUC - 批准号：09221）批准，并遵循庆应义塾大学关于科研中使用动物的机构实验动物使用指南。人体标本来自捐赠给庆应义塾大学医学院解剖学系的遗体，使用过程遵循机构相关规定。

1. 听泡和听囊的分离

  1. 将小鼠放入含有异氟烷或七氟烷浸湿的纸巾的广口瓶中，瓶内放置平台，确保小鼠不会直接接触浸湿的纸巾，待其呼吸停止超过一分钟后再实施颈椎脱位处死。
  2. 用双手在小鼠颈部背侧做一横向小切口，并将皮肤向头尾方向拉开，暴露下方的颈部肌肉组织。
  3. 使用14 cm锋利的手术剪在颈椎部位进行断头。
  4. 将皮肤完全剥离至鼻部，连同吻突和门齿一并切除。
  5. 将剪刀插入小鼠口腔，剪断两侧的咬肌。
  6. 小心打开下颌，将舌头和下颌骨一同取出。
  7. 使用锋利的剪刀沿正中矢状面将颅骨及颅底分为左右两半（图1A, B）。
  8. 用镊子移除大脑半球、小脑半球及脑干。听泡和听囊位于小脑和脑干的外侧。注意听泡位于听囊的更外侧（图1C, D）。
  9. 将听泡和听囊连同周围颅骨一并解剖取出（图1E）。
  10. 将标本转移至含有pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，室温保存。
  11. 在双目解剖显微镜下，用镊子分离周围的颅骨，用剪刀剪开听泡和听囊周围松动的边界（图1F）。所去除的周围骨骼包括基枕骨（腹侧边界）、外枕骨（腹后侧边界）、上枕骨（后侧边界）、顶间骨、顶骨（背侧边界）、鳞状骨（背前侧边界）、翼蝶骨（前侧边界）和基蝶骨（前腹侧边界）。注意支撑咽鼓管鼓室开口的茎突状突起（Sp）41，不同于颞骨的茎突。

2. 听小骨的分离：锤骨、砧骨和镫骨 

  1. Malleus
    1. 使用小剪刀和镊子，去除鼓沟外侧的外耳道部分，使鼓膜可见（图 2A, B）。
    2. 去除锤骨短突（环状突，见讨论部分）附近的鼓膜及鼓骨部分，包括腹侧（虚线）和后侧（#）壁（图 2C）。此时应暴露锤骨和鼓膜张肌（图 2D, E）。
    3. 抬起锤骨（图 2F），用27 G 针头的斜面切断鼓膜张肌（图 2G）。注意锤骨柄牢固地附着于鼓膜，这与其他哺乳动物相同。
    4. 小心地将鼓膜从脆弱的锤骨柄上分离，并去除鼓骨，以暴露三块听小骨。
    5. 在听小骨关节处将锤骨与砧骨分离（图 2H）。
    6. 在锤前关节（goniale）处折断前突，以分离锤骨。
  2. Incus and Stapes
    1. 切断砧骨短脚处的砧骨后韧带，以分离砧骨（图 3A）。
    2. 用27 G 针头的斜面靠近镫骨处切断镫骨动脉（图 3B, C）。如有必要，用针头在镫骨肌突处切断镫骨肌腱。
    3. 将一根缝针（或标记针）插入镫骨的前庭窗孔（obturator foramen），抬起镫骨。移除镫骨后，卵圆窗开口应清晰可见（图 3D）。

3. 听泡和听囊的包埋

  1. 石蜡包埋前准备
    1. 按照第1节所述方法分离鼓泡和囊。
    2. 用剪刀切除鼓泡前端（即杆状突），将鼓泡和囊浸入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS中，4 °C条件下固定，使固定液进入鼓泡内部。若鼓泡内有气泡滞留，可用针头和注射器将其抽出。将鼓泡和囊置于4 °C条件下，在旋转仪上过夜（O/N）固定。
      注意：PFA具有毒性，操作时应谨慎。
    3. 用PBS洗涤一次。
    4. 在2 mL离心管中，使用含10%乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA-2Na）和100 mM Tris碱（pH 7.0）的溶液，在4 °C条件下对鼓泡和囊进行脱钙处理，持续一周。每隔一天更换一次缓冲液。
    5. 用PBS洗涤一次。样本可保存于4 °C的70%乙醇水溶液中。可选步骤：通过梯度乙醇系列（30%、50%、70%水溶液）逐步转移至70%乙醇。
    6. 在组织处理机中，将样本依次经梯度乙醇溶液脱水（70%、2次95%、3次100%，每次1 h），二甲苯透明（4次，每次1 h ，40 °C），然后用熔融石蜡浸润42。可选：可用商业组织透明液（例如，Histo-Clear）替代二甲苯。
    7. 从组织处理机中取出样本，并从包埋盒中取出。
    8. 在组织包埋台系统上，将样本放入盛有熔融石蜡的模具中。继续进行包埋（第4节）。
  2. 冷冻包埋前准备（Kawamoto薄膜法）43
    1. 按照第1节所述方法分离鼓泡和囊。
    2. 用剪刀切除鼓泡前端（即杆状突），将鼓泡和囊浸入固定液中（为保留抗原性，使用PBS配制的2%或1% PFA，而非4%），4 °C条件下固定。若鼓泡内有气泡，用针头和注射器将其抽出。将鼓泡和囊置于4 °C条件下，在旋转仪上过夜（O/N）固定。
    3. 迅速用PBS洗涤鼓泡和囊，立即浸入4 °C的液态冷冻包埋剂中。
    4. 重要提示：若中耳和外耳存在气泡，需用针头抽吸去除，并用镊子小心添加包埋剂以排除气泡。继续进行包埋（第4节）。

4. 样本定向与包埋

注意：在包埋过程中，必须将整个鼓泡和囊以特定方向排列，以切出所需的切片。以下所述步骤用于以不同方向切取锤骨的切片。

  1. 锤骨的纵切（矢状切）
    1. 将鼓室或外耳道的外侧朝下放入温热的石蜡（或冷冻包埋剂）中。调整方向，使锤骨的颈部和横向板与包埋皿的水平底部平行（图4A - C）。请注意，在小鼠头部，鼓膜与垂直方向成约30°角（图4A；参见Kampen44中的图59）。
  2. 锤骨的水平切片
    1. 将鼓室和囊的背侧嵴水平放置于温热的石蜡（或冷冻包埋剂）中。调整鼓室和囊的方向，使锤骨的颈部和横向板与包埋皿底部垂直（图4D - F）。
  3. 锤突和鼓膜的额状切片（横截面）5
    1. 将锤骨柄置于温热的石蜡（或冷冻包埋剂）中，使其与包埋皿底部垂直。
  4. 将包埋块冷却至适当温度，以在组织包埋系统上固化石蜡（或 alternatively，使用干冰/正己烷浴中的冷冻包埋剂）。
  5. 按照常规程序处理组织块并切片。例如，用苏木精和伊红（H&E）、番红O（用于软骨）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色（用于破骨细胞）3，或免疫组织化学方法对石蜡切片进行染色。未脱钙的冷冻切片适用于使用荧光染料进行骨标记14、茜素红染钙以及免疫荧光染色42。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了一种从小鼠听泡中分离听小骨的方法。首先，将听泡及其囊膜作为整体从颅骨中解剖取出（图1）。随后利用解剖得到的听泡制备锤骨（图2）以及砧骨和镫骨（图3）。听泡和囊膜的解剖标志包括听泡前部的针突、背侧嵴、前半规管以及弓下窝（图1F）。显微计算机断层扫描（CT）成像可显示听泡内的听小骨结构，以及对这些听小骨进行纵向和水平切片的最佳取向（图4）。

为进行锤骨的纵向石蜡切片，将鼓室和囊在4 °C条件下用EDTA脱钙一周，按图4 A - C所示方向包埋于石蜡块中，切片厚度为4 µm，随后采用H&E染色。在P14阶段，附着于听泡鼓膜上的锤骨显示出持续进行的软骨内成骨过程（图5A）。为观察新骨形成，向一只P20小鼠腹腔注射钙黄绿素（30 µg/g体重），24小时后（P21）取其鼓室及囊组织。样本未经脱钙，直接进行冷冻包埋，并采用Kawamoto方法43结合粘附膜进行6 µm厚度的冷冻切片。切片经DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）核染色后，在荧光显微镜下观察。钙黄绿素信号（绿色）显示锤骨（m）、鼓室及囊中存在新骨形成（图5B）。为进行锤骨的水平切片，取5周龄小鼠的听泡组织，未经脱钙直接进行冷冻包埋（包埋方向见图4D - F），采用Kawamoto方法进行6 µm厚度的冷冻切片，并用H&E染色。锤骨短突（mPB）的水平切片亦可见耳蜗结构（图5C）。

从小鼠（P31）右侧分离出的听小骨的内侧观显示了典型的小鼠锤骨特征，即“滑翔海鸥翼状”（或波斯剑状45）的柄部、明显的短突（环状突起，见讨论部分）以及横向板（图6）。需要注意的是，前突（processus anterior）在围绕舌骨（goniale）的解剖过程中发生骨折，并已从鼓环（ectotympanic）分离。该代表性样本显示锤骨与砧骨之间存在完整的锤砧关节，而砧镫关节则发生脱位。锤骨肌突和镫骨肌突处的肌腱附着点可见（图6A，星号所示）。

图6B 在相同放大倍数下比较了小鼠与人类的听小骨。除尺寸外，物种间的差异包括以下方面。小鼠的锤骨柄呈翼状，而人类则呈棒状。锤骨前突与砧骨短突连线所构成的解剖轴（或旋转轴）与锤骨柄之间的夹角在小鼠中明显更小，二者几乎平行，而在人类中则接近垂直6,46-48。在人类听小骨中，振动测量研究表明，锤砧关节具有一定的活动性，而非功能上固定49。小鼠锤骨具有一宽阔、菲薄且平坦的横向板，此结构在人类中不明显47。在小鼠中，锤骨前突与膜性骨（即舌骨和鼓环）融合，而在人类中，锤骨前突退化为一小段骨刺41。小鼠与人类的镫骨也存在差异：在小鼠中，镫骨前脚呈弯曲状，后脚较直；而在人类中，前脚较直，后脚则更弯曲。值得注意的是，在金鼹等物种中，锤骨头相对于身体尺寸显著增大，表明这些“最小骨骼”的异速生长关系具有显著的变异性48。

神经科学解剖；标注解剖区域；实验组织制备装置。
图 1. 听泡与耳囊的解剖。（A） P31 小鼠颅骨被分为右侧和左侧两半。A，前侧；P，后侧；L，左侧；R，右侧。（B） 去除皮肤后头部右侧半的内侧面。Cx，大脑皮层；Cb，小脑；Bs，脑干。D，背侧；V，腹侧。（C） 使用镊子去除脑组织。（D） 右侧颅骨中耳囊的内侧观。背侧嵴（箭头）位于中颅窝（mcf）与后颅窝（pcf）之间，分隔耳囊的背前侧与腹后侧表面。比例尺，2 mm。（E） 听泡与耳囊的高倍放大图像（内侧观）。Co，耳蜗；VII，面神经；VIII，前庭蜗神经；AC，前（上）半规管；Sf，下弧形窝，容纳小脑副小结。比例尺，1 mm。（F） 分离的听泡与耳囊的显微图像（内侧观）。Sp，茎状突。比例尺，1 mm。（A - E），P31 小鼠。（F），P33 小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

解剖示意图；用于教育研究的标注部分；显微特写。
图2. 锤骨的解剖。 (A) 右侧听泡和耳囊的腹外侧视图。鼓沟（ST，虚线箭头）是鼓膜的附着部位。位于ST外侧的骨属于外耳，而ST内侧的骨构成中耳腔的底壁。A，前侧；P，后侧；D，背侧；V，腹侧。(B) 去除外耳道后显示鼓膜（TM），包括松弛部（Pf）和紧张部（Pt）。(C) 去除锤骨短突（mPB）附近鼓骨的部分结构（虚线和#所示）。m，锤骨；mM，锤骨柄。箭头所示为透过鼓膜观察到的中耳腔内的气泡。(D) 暴露的锤骨。图中指示出锤骨头。虚线表示砧骨的关节面。(E) 鼓膜张肌（TT）的肌腱附着于锤骨。(F) 当提起锤骨时，鼓膜张肌被拉紧。*，肌突。(G) 使用针切断鼓膜张肌。(H) 去除鼓膜后的三块听小骨。锤砧关节已脱位。m，锤骨；i，砧骨；s，镫骨；Go，舌骨（与锤骨及鼓环TR融合）。所有比例尺均为0.5 mm。（A, H），P33小鼠；（B - G），P31小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

显示标记结构 SA、iCB、Ow、Rw 的显微解剖图；生物学研究。
图 3. 锤骨和镫骨的解剖。（A） 移除锤骨后的砧骨和镫骨。镫骨动脉（SA）穿过镫骨（s）。虚线表示砧骨的关节面。注意砧骨（i）的短脚（iCB，crus breve）由后韧带固定（未显示）。星号，镫骨的肌突。（B） 移除砧骨后的镫骨。使用针尖切断镫骨动脉（SA）。箭头，血流方向。虚线表示镫骨的关节面。（C） 镫骨动脉从镫骨上被移除。X 表示镫骨动脉（SA）的切断端。（D） 移除镫骨后可见卵圆窗（Ow，fenestra ovalis 或 fenestra vestibuli）。Rw，圆窗（fenestra rotunda 或 fenestra cochleae）。比例尺，0.5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示纵向和水平方向解剖结构的荧光显微镜图像。
图 4. 包埋过程中听泡和关节囊的方向设定，用于锤骨的纵向（旁矢状面，A - C）和水平（D - E）切片。（A - C） 锤骨的颈和横板与包埋皿底部平行放置。（A） 侧视图：微计算机断层扫描（micro-CT）图像，显示右侧锤骨在听泡中的包埋情况（伪彩为蓝色）。锤骨和砧骨伪彩为绿色。虚线表示期望的切面，实线表示包埋皿底部。m，锤骨；箭头，背侧嵴；M，内侧；L，外侧；D，背侧；V，腹侧。（B） 顶视图：micro-CT 图像。注意听泡前部（茎突状突起）已被切除。i，砧骨。（C） 顶视图：显微照片（使用彩色滤光片拍摄）。AC，前（上）半规管；Sf，弓下窝；Sp，茎突状突起。A，前侧；P，后侧；D，背侧；V，腹侧。（D - F） 锤骨的短突垂直于包埋皿底部放置。（D） 侧视图：micro-CT 图像，显示右侧锤骨的包埋情况。虚线表示期望的切面，实线表示包埋皿底部。（E） 顶视图：micro-CT 图像。mM，锤骨柄。（F） 顶视图：显微照片（使用彩色滤光片拍摄）。比例尺，1 mm。micro-CT 图像以 5 μm 体素分辨率获取，方法如前所述7。请点击此处查看该图的放大版本。

使用H&E和钙黄绿素染色的组织切片纵向组织学图像，突出显示细胞结构。
图5. 组织学。 (A) H&E染色。P14小鼠听泡（虚线）内包埋于石蜡的右侧锤骨（m）的纵向（副矢状）切片。TM，鼓膜。 (B) 钙黄绿素骨标记。P21小鼠听泡内冷冻未脱钙的左侧锤骨（m）的纵向切片。复染剂：DAPI。 (C) H&E染色。5周龄小鼠听泡和囊内的左侧锤骨短突（mPB）冷冻未脱钙水平切片。Co，耳蜗。比例尺，1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

鸟类脑结构解剖图，标注区域，矢状面，生物学教育。
图6. 听小骨内侧视图。（A） P31小鼠右侧听小骨。A，前；P，后；D，背侧；V，腹侧。比例尺，1 mm。锤骨头（Caput mallei，Capitulum mallei）；颈（Collum mallei）；板（横板，transversal lamina）；mM（锤骨柄，Manubrium mallei）；黑色星号（锤骨肌突）；mPA（前突，Processus anterior，细长突，Processus gracilis）；mPB（短突，processus brevis）；砧骨体（Corpus incudis）；iCB（短脚，Crus breve，短突）；iCL（长脚，Crus longum，长突）；iPL（豆状突，Processus lenticularis，豆状突，Sylvian apophysis）；镫骨头（Caput stapedis）；白色星号（镫骨肌突）；sCA（前脚，Crus anterius，anterior crus）；sCP（后脚，Crus posterius，posterior crus）；底板（Basis stapedis，footplate）；sOF（闭孔，obturator foramen，间脚孔，intercrural foramen）。（B） 一名76岁女性人类右侧听小骨（由庆应义塾大学医学院解剖学系提供）。P31小鼠的听小骨（右下角）与人类听小骨采用相同放大倍数成像。弯曲箭头表示解剖轴与锤骨柄之间的夹角（虚线）。比例尺，2 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种用于分离出生后小鼠听泡及听囊的方法。在出生后第12天（P12）之前，组织较为脆弱，分离过程中容易受损；而在P12之后，听泡和听囊可较容易地从周围组织中分离出来。在切片前先将听泡从头部解剖下来具有多个优势。首先，听泡的空腔形成及生长在出生后第6天（P6）起最为活跃，并于P14左右完成50。在此过程中，鼓膜与耳蜗壁之间的间充质组织被空气取代，形成中耳腔。中耳腔内的空气可能在固定、脱钙和包埋过程中阻碍组织与液体之间的充分接触。通过切除分离后的听泡前端（茎突状突起）来排出空气，比在未分离的听泡中进行更为简便。其次，锤骨（以及鼓膜）在头颅内的方向并非垂直，因此将分离后的听泡和听囊以特定方向包埋，更便于在理想的切面上对锤骨进行切片。

分离后，听泡和听囊可用于多种分析。例如，高分辨率X射线显微CT可揭示听小骨中成骨毛细血管等骨组织微结构形态 14立体荧光解剖显微镜是观察中耳或内耳表达荧光蛋白的报告基因小鼠结构的有力工具 33此外，各种 体内 或 离体 荧光标记方法及整体免疫荧光检测可被采用。光片荧光显微镜也适用于三维分析 51尽管此处未作描述，但利用本方案还可评估与听泡和耳囊相关的多种解剖结构，例如中耳内的周围神经、血管和鼓膜。

请注意，石蜡切片在包埋前需要对骨组织进行脱钙处理，因此无法用于矿化分析。相比之下，Kawamoto 薄膜法 43 用于制备冷冻切片的样本可无需脱钙处理，适用于采用矿化研究的实验 在体 骨标记技术或特殊染色（如茜素红染色）。冷冻切片条件应根据小鼠年龄进行优化。例如，对于年龄较大的小鼠样本，建议采用相对较高的冷冻切片机腔内温度，以尽量减少切片损伤。

在小鼠中，锤骨突出的半球形突起的正确术语是"orbicular apophysis"。然而，术语"processus brevis"已被广泛用于指代orbicular apophysis超过二十年，尤其在小鼠发育生物学研究者中16,20,22-25。"Processus brevis"最初指的是侧突（processus lateralis），其与orbicular apophysis不同。在人类中，侧突呈轻微圆锥状突起，构成鼓膜的一般附着线，从锤骨柄延伸而来（在图 6B中未见，为内侧视图）。在小鼠中，侧突也是锤骨柄上位于鼓膜脐对侧末端的一个突起48。鼓膜的松弛部位于锤骨侧突的上方。人类锤骨中无明显的orbicular apophysis。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Masaki Yoda 和 Elise Lamar 对手稿的审阅，感谢 Kazumasa Takenouchi 在组织学方面的帮助，感谢 Mari Fujiwara 在显微镜技术方面的协助，以及感谢 Makoto Morikawa 在拍摄人和小鼠听小骨照片方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
工具/设备
纸巾大王制纸株式会社703347可从其他供应商购买
玻璃罐多种品牌可从其他供应商购买
14 cm 外科剪刀Fine Science Tools (F.S.T.)91400-14可从其他供应商购买
超细直头剪刀Fine Science Tools (F.S.T.)14084-08可从其他供应商购买
45°斜头精细镊子Fine Science Tools (F.S.T.)11063-07可从其他供应商购买
解剖显微镜尼康SMZ800N用于常规解剖
解剖显微镜尼康SMZ18用于拍摄视频 
27 G 注射针头TERUMONN-2719S
注射器（1 mL）TERUMOSS-01T
标记针多种品牌
试管旋转仪 RT-50TAITEC0000165-000可从其他供应商购买
冷冻切片机LeicaCM3050Shttp://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 钨合金刀片Leica14021626379用于川本固相法
不锈钢容器Leica用于川本固相法
Cryofilm IIC 型膜Leica用于川本固相法
硅烷涂层载玻片（New Silane II）武田药品工业株式会社511617可从其他供应商购买
盖玻片松野制作所可从其他供应商购买
组织处理仪Sakura FinetekVIP-5可从其他供应商购买
组织包埋台系统Sakura FinetekTissue-Tek TEC 5 可从其他供应商购买
石蜡切片滑动式切片机大和兴机工业株式会社REM-710可从其他供应商购买
硬组织专用 Path Blade+pro松野制作所PB3503C用于石蜡切片
显微CTRIGAKUR_mCT2http://www.rigaku.com/en
荧光显微镜KEYENCEBZ-9000
名称公司目录编号备注
试剂
异氟烷丸石制药株式会社
NaClwako191-01665用于PBS
KClwako285-14用于PBS
Na2HPO4 12H2Owako196-02835用于PBS
KH2PO4wako287-21用于PBS
多聚甲醛（PFA，电镜级）TAABP001
EDTA-2Nawako15111-45
Trizma 碱基SigmaT1503-1KG
超低温冷冻包埋介质Leica用于川本固相法
干冰多种品牌用于川本固相法
己烷wako080-03423用于川本固相法
Super Cryomouting Medium R2 型Leica用于川本固相法
石蜡Sakura Finetek781001A0107
组织透明剂 Histo-ClearNDSHS-200
钙黄绿素同仁化学研究所340-00433
苏木精 wako131-09665
伊红wako051-06515

参考文献

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