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外周血微囊泡的分离与表征

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DOI：

10.3791/55057

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2017年1月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology/Medical Oncology, University Medical Center Göttingen

本文内容

摘要

血液中存在的细胞外囊泡被认为可作为多种疾病的新型生物标志物。本文介绍了一种从外周血样本中分离大型质膜来源微囊泡的实验方案，并通过常规流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行后续分析。

摘要

细胞外囊泡（EVs）的释放是一种存在于所有活细胞中的基本细胞过程，其中包括由早期内体来源的小型外泌体（Exos，直径 < 100 nm）和由质膜来源的大型微囊泡（MVs，直径 > 100 nm）。这些囊泡可转运与其来源细胞特异性相关的蛋白质、脂质和核酸，体外（in vitro）研究已凸显其作为细胞间通讯介质的重要作用。EVs 已成功从多种体液中分离获得，尤其是血液中的 EVs 已被确认为癌症或传染性疾病的潜在生物标志物。为了便于研究血液中 MV 的亚群，本文提供了一种从外周血样本中标准化分离和表征 MV 的实验方案。通过差速离心法，可从 EDTA 抗凝血浆样本中沉淀获得 MV，其典型直径为 100 - 600 nm。由于其体积较大，可通过流式细胞术对其进行便捷分析，该技术在临床诊断中常规使用，且大多数实验室均具备该设备。本文将提供多个针对分离所得 MV 的质量控制检测示例，并介绍可用于区分血液中不同 MV 亚群的标志物。

引言

近年来，许多 体外 研究表明，细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中发挥着重要作用。活细胞会持续释放囊泡，这些囊泡在大小、内容物和生物发生途径上各不相同。目前研究最为深入的是外泌体（exosomes），其起源于内体系统，在多泡体中以腔内囊泡的形式储存。当多泡体与细胞质膜融合后，其所含的囊泡即被释放为外泌体（Exos，直径30–100 nm）1）。近年来受到越来越多关注的另一类细胞外囊泡（EV）是大型微囊泡（MVs，直径100 - 1,000 nm），它们直接从质膜出芽形成。 2.

两种类型的囊泡均被脂质双分子层包围，并含有核酸，例如 DNA、mRNA 或 miRNA 3-5，以及多种可转移至邻近细胞的蛋白质。尽管囊泡的蛋白质组成通常反映来源细胞的状态，但某些蛋白质似乎会被选择性地靶向并富集于细胞外囊泡（EVs）中1。当前一个重要的研究方向是表征异常及病变细胞来源的EVs，以确定特定的EV特征，从而可能将EVs用作新型生物标志物。尤其在癌症研究中，由于肿瘤组织本身往往难以获取，通过血液中靶向肿瘤特异性EVs的液体活检，可能实现对治疗反应的监测，或有助于在无需侵入性操作的情况下对原发肿瘤进行表征6。

事实上，细胞外囊泡（EVs）已成功从多种体液中分离出来，包括尿液7、脑脊液（CSF）8、母乳9和血液10。多项研究发现，在不同的人类疾病中，EVs的数量和组成均发生改变。例如，与健康个体相比，脓毒症患者中促凝微囊泡（MV）的数量显著增加11。在重症脑型疟疾患者中，血液中总微囊泡数量也升高，且血小板来源的微囊泡数量与昏迷深度和血小板减少症相关12。其他研究报道，在系统性红斑狼疮或心力衰竭患者中，内皮来源的囊泡数量升高；而在心力衰竭患者中，这一升高与心血管事件发生概率增加相关13,14。

尤其在癌症领域，血液中的细胞外囊泡（EVs）目前被认为是一类具有诊断和预后价值的新型生物标志物。表达肿瘤相关蛋白（如 MUC1、EGFR 或 FAK）的微囊泡（MVs）在乳腺癌患者血液中的水平似乎升高15,16。对于外泌体（Exos），近期研究显示，来源于血液、携带肿瘤特异性抗原（如胰腺癌相关的Glypican-1或乳腺癌相关的Del-1）的外泌体可用于高特异性和高灵敏度的早期疾病检测17,18。此外，血清来源的肿瘤外泌体可能含有DNA，可用于检测KRAS和p53等突变，提示其在治疗反应预测中的应用潜力19。最近的研究进展表明，利用特定的微流控芯片分析胶质母细胞瘤患者血液中的外泌体，可实现对治疗过程的监测20。综上所述，这些发现表明，对疾病特异性囊泡亚群的分析可为疾病的诊断、预后以及治疗选择和疗效评估提供重要信息。

然而，从血液中分离和分析外泌体（Exos）耗时较长，且需要特殊的实验设备，因此目前尚不适用于常规临床诊断。相比之下，微囊泡（MVs）的分离速度更快，且由于其体积较大，可通过流式细胞术直接进行分析，无需像外泌体那样必须与乳胶微珠偶联18,21。因此，本文介绍了一种可用于从血液样本中标准化分离微囊泡（MVs）并随后通过流式细胞术对MV亚群进行表征的实验方案。该方案将有助于在大规模患者群体中进一步研究和深入表征微囊泡的特征谱型，这对于未来将微囊泡应用于日常临床诊断至关重要。

方案

所有涉及人类受试者的实验均已获得当地伦理委员会批准（批准编号：3/2/14）。在选择患者时应注意，多种因素（如年龄、性别、当前治疗方案等）可能影响血液中微囊泡（MV）的组成，因此在样本采集前应予以充分考虑22,23。

1. 血浆样本的制备

  1. 通过21号蝶形针将每位供体的1-2管血液采集至含EDTA（1.6 mg/mL血液）的真空采血管中。采血后务必反复倒置试管数次，以确保血液充分抗凝。
    注意：后续用于流式细胞术和蛋白质印迹分析的推荐采血量为 5 - 15 mL。为防止微囊泡（MV）降解和丢失，血液样本应妥善处理 < 采血后30分钟
  2. 在室温（RT）下，以1,200 × g离心15分钟，制备血浆样品。
  3. 使用滤芯以促进血浆（上层）与剩余血细胞（下层）的分离。
  4. 将血浆转移至15 mL离心管中。
  5. 在室温下以1,500 × g离心15分钟，沉淀较大的细胞碎片并去除残留的血小板。
  6. 将上清液转移至15 mL离心管中，可直接进行MV分离，或在-20 °C保存长达6个月。
    注意：本方案也可用于从细胞培养上清液中分离微囊泡（MVs）和外泌体（Exos）。具体操作如下：将细胞在添加了无囊泡胎牛血清的培养基中培养至60–80%融合度，培养24–48小时后收集上清液。在4 °C下以750 × g离心5分钟，以去除残留的悬浮细胞；将上清液转移至新的15 mL离心管中，再于4 °C下以1,500 × g离心5分钟，以沉淀较大的细胞碎片。所得上清液即可用于后续步骤2.1–2.16所述的MVs分离。

2. 膜囊泡（MVs）的分离

  1. 将血浆样本转移至合适的离心管中。如有必要，加入磷酸盐缓冲液（PBS）补足管体积，以稀释样本并防止离心过程中薄壁管发生塌陷。
  2. 在 4 °C 条件下，以 14,000 x g 离心 35 分钟。
  3. 弃去上清液，将离心管倒置，置于纸巾上，静置3–5分钟，直至残留的上清液被纸巾完全吸收并从样品中去除。
  4. 将MV沉淀重悬于1,000 µL PBS中，转移至1.5 mL离心管，在台式离心机中于4 °C、14,000 x g离心35分钟。
  5. 吸去上清液。
  6. 将MV沉淀重悬于50–500 µL PBS中，具体体积根据沉淀大小而定。或者，可直接裂解MV。 例如，置于RIPA缓冲液（150 mM NaCl/0.1% SDS/0.5% 脱氧胆酸钠/1% Triton X-100/50 mM Tris，pH 7.2）中，用于后续Western Blot分析。将MVs于-20 °C保存，可保持数月稳定，但应避免反复冻融。
  7. 可选：使用蛋白测定法测定MV蛋白浓度（例如，Bradford 法或 Lowry 法）以评估微囊泡（MV）产量或为后续实验确定 MV 剂量。
  8. 若需从血浆样本中进一步分离外泌体（Exos），请将步骤2.3中的上清液转移至超速离心管中，在110,000 × g、4 °C条件下离心2小时。按照步骤2.3所述方法弃去上清液，将外泌体（Exo）沉淀重悬于1,000 µL PBS中，并转移至小型（1.5 mL）超速离心管中。
    1. 在 110,000 × g、4 °C 条件下超速离心 2 小时，吸除上清液，将外泌体沉淀重悬于 50–75 µL PBS 或 RIPA 缓冲液中。

3. 流式细胞术对膜囊泡（MVs）的表征

  1. 将15 µL PBS+1% 囊泡耗竭的胎牛血清（FCS）转移至流式细胞术管中。
    注意：无囊泡胎牛血清（FCS）的制备方法如下：将经热灭活（56 °C 下 30 分钟）的 FCS 在 110,000 × g 条件下离心 18 小时，然后将上清液经 0.2 µm 滤膜过滤，具体操作如前所述。 24.
  2. 加入5 µg（若产量较低，也可使用3 µg）PBS中的MVs。
  3. 在室温下孵育样品30分钟，以阻断微囊（MV）表面的非特异性结合位点，从而降低背景染色。
  4. 加入针对目标蛋白的荧光标记抗体。在使用前需对该抗体进行染色浓度的滴定，以确定最佳浓度并保证较低的信噪比。实验中须设置一管未染色的微囊泡（MVs）作为阴性对照，以及另一管以相同浓度的同型对照抗体染色的微囊泡作为同型对照例如，如果使用1 µg抗体，则也应使用1 µg同型对照抗体）以量化背景染色。
    注意：也可通过添加与不同荧光染料偶联的多种抗体来进行多色流式细胞术。
  5. 室温避光孵育20分钟。
  6. 加入250 µL PBS，然后使用流式细胞仪对样品进行检测。
    1. 若样品无法立即检测，加入150 µL PBS和50 µL 4%多聚甲醛（PFA）以固定样品，并于4 °C保存。注意：PFA具有毒性，操作时需佩戴手套并使用适当的个人防护装备。
  7. 将流式细胞仪的阈值调至尽可能低，使用对数尺度的前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）图寻找微囊泡（MV）群体。圈选MV群体，并在相应的直方图中评估荧光信号。

4. 通过蛋白质印迹法对膜囊泡进行表征

  1. 直接在适当的裂解缓冲液（例如，RIPA缓冲液）中重悬微囊泡（MV）沉淀。
    1. 如果MV沉淀已重悬于PBS中，则至少按1:1比例稀释于适当的裂解缓冲液（例如，RIPA缓冲液）中。
  2. 测定MV样品的蛋白浓度，例如，通过Lowry法。
  3. 将10 - 20 µg的MV溶于22.5 µL RIPA缓冲液中，然后加入7.5 µL 4x Laemmli上样缓冲液，在95 °C加热5分钟。
  4. 将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶，按照标准方案进行电泳和免疫印迹。
  5. 将蛋白转移至膜上后，按照标准方案进行Ponceau染色以作为上样对照。
  6. 在TBST中室温脱色5分钟。
  7. 在含5% BSA的TBST中室温封闭30分钟至1小时。
  8. 加入一抗，4 °C孵育过夜或室温孵育2小时。
  9. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
  10. 以1:10,000稀释度将HRP偶联的二抗溶于5% BSA中，与膜孵育。注意：若背景信号较高，可使用脱脂奶粉替代BSA。
  11. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
  12. 使用ECL检测试剂显影，并在化学发光胶片或化学发光成像系统中检测信号。
    注意：为区分微囊泡（MVs）与外泌体（Exos），可使用如微管蛋白（Tubulin）、α-辅肌动蛋白-4（actinin-4）或线粒体膜蛋白（mitofilin）等标志物，这些蛋白主要存在于MVs中16,25。需注意，许多用于标记外泌体的四跨膜蛋白抗体（例如，CD9、CD81）在还原条件下无法有效识别抗原，因此应使用非还原性上样缓冲液制备样品，并在70 °C加热10分钟。

结果

为了量化按照所述方案分离出的微囊泡（MVs）产量，我们计算了从10名供体血液样本中分离得到的MVs数量。通过Lowry蛋白测定法评估的MVs产量范围为10至 30 µg 平均为 19.2 µg 每毫升血液中的MVs数量（表1）。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的颗粒浓度范围为1.66 × 109 至 2.36 x 1010 平均值为 5.9 x 109 每毫升血浆样本中的颗粒数（表 2）。通过透射电子显微镜对微囊泡（MVs）进行进一步表征，结果显示一群直径为 > 100 nm，由脂质双层包围且不含任何细胞器（图1A）。NTA 结果证实，分离出的微囊泡（MVs）大小范围为 100 至 600 nm（图1B）平均MV大小为201 nm（图1C）。通过蛋白质印迹法检测典型的微囊泡（MV）和外泌体（Exo）标志物发现，分离得到的MV对微管蛋白（Tubulin）呈阳性，而CD9和CD81仅呈微弱表达；外泌体则对微管蛋白呈阴性，但富含CD9和CD81（图2).

通过流式细胞术分析分离的微囊泡（MVs）图3A) 显示出一个明确的囊泡群体，可使用通常用于分离细胞培养上清液中微囊泡（MVs）的相同参数进行设门，且该信号明显不同于仅测量PBS + 1% 去囊泡FCS（未添加MVs）时获得的背景信号图3B）。为了分析血液中不同类型的微囊泡（MV）群体，使用针对不同血细胞群体的已确立标志物对MV进行染色， 例如，CD62P用于血小板来源的微囊泡，CD45用于白细胞来源的微囊泡，CD235a用于红细胞来源的微囊泡，CD62E用于内皮细胞来源的微囊泡（图 4）。该表征结果显示，在所检测的供体血液样本中，微囊泡（MV）亚群的比例存在差异，而大多数MV似乎在所有样本中均来源于血小板。

微囊泡电泳分析；电子显微镜图像、粒径分布图、平均直径图表。
图1：从外周血中分离的微囊泡（MVs）的粒径分布。A， 通过透射电子显微镜观察分离的微囊泡。B， 微囊泡的代表性纳米颗粒追踪分析（NTA），显示囊泡的粒径分布情况。C， 通过NTA测量10次独立制备样品的微囊泡平均粒径（均值）。请点击此处查看该图的高清版本。

CD81、Tubulin、CD9 的 Western 印迹；微囊泡与外泌体的蛋白质表达分析。
图 2： 通过 Western 印迹法对分离的微囊泡进行表征。 通过 Western 印迹法检测两个供体来源的分离微囊泡（MVs）和外泌体（Exos）中差异性蛋白质表达。 请点击此处查看该图的放大版本。

微囊泡（MVs）的流式细胞术分析；来自供体的散点图和荧光直方图。
图3： 通过流式细胞术分析微囊泡（MVs）。A， 首先在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图上对MVs进行可视化，以圈定相应的MVs群体。随后，使用针对目标抗原的荧光标记抗体对这些MVs进行抗原表征。B， 来自两位供体血浆中分离的MVs的典型FSC与SSC散点图。作为对比，右侧还展示了从A549肺癌细胞培养上清液中分离的肿瘤细胞来源MVs的典型散点图，以及仅使用PBS + 1% 去囊泡FCS（不含MVs）的阴性对照图。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术直方图；CD62P、CD45、CD235a、CD62E 标记物；供体微囊泡计数分析。
图 4： 通过流式细胞术对分离的微囊泡进行表征。 来自三位供体的微囊泡通过流式细胞术检测其已知血细胞标志物（红色）的表达情况。相应的同型对照以灰色显示。请点击此处查看该图的放大版本。

样本每毫升血液中的微囊泡数量 [µg]
#129.4
#210.3
#315.2
#431.1
#518.8
#622.7
#719.1
#818.7
#915.0
#1011.9

表1：外周血样本中微囊泡（MV）蛋白产量。 显示了从10名供体采集的每毫升外周血中的微囊泡（MV）数量。MV产量通过Lowry法测定。

样本每毫升血浆中的微囊泡数量 [颗粒计数]
#16.42E+09
#22.36E+10
#31.88E+09
#46.51E+09
#53.48E+09
#64.57E+09
#72.09E+09
#81.66E+09
#92.54E+09
#106.20E+09

表2：外周血样本中微囊泡颗粒产量。 从10名供体的血浆样本中分离微囊泡，并通过纳米颗粒追踪分析测定颗粒数量。数据为三次独立测量的平均值。

讨论

近期关于血液中细胞外囊泡（EVs）的研究表明，EVs 的组成和数量在多种疾病发展过程中会发生变化。因此，对这些 EVs 进行分析和进一步表征具有重要意义，有助于评估其作为疾病诊断、预后生物标志物的潜力，或用于评价治疗反应。本文所介绍的方案可用于分离直径达 600 nm 且不含任何细胞器的囊泡。这些观察结果符合当前微囊泡（MVs）的定义，并排除了凋亡小体的存在2。通过蛋白质印迹（Western Blotting）分析，我们发现分离得到的 MVs 中微管蛋白（Tubulin）表达水平较高，而常用于外泌体（Exos）标记的四跨膜蛋白 CD9 和 CD81 仅低水平表达。这证实了 MVs 与 Exos 存在差异，也与近期通过蛋白质组学对这两类 EV 群体进行深入表征和比较的结果一致25。

在采集血样过程中，为防止微囊泡（MV）降解，必须尽可能缩短静脉穿刺与血浆制备之间的时间。此外，血液样本长时间储存可能导致血细胞活化，引起微囊泡释放增加，并最终导致细胞凋亡，从而释放凋亡小体。另一个影响MV分离的重要因素是防止微囊泡制备物被血浆蛋白或较小的外泌体（Exos）污染。因此，在以14,000 × g离心沉淀MV后，必须尽可能彻底去除上清液。由于沉淀通常可见且紧密附着于离心管管壁，可用移液器吸头轻松移除上清液。与在外泌体制备过程中因高速超速离心易形成聚集体且常难以重悬的情况不同，微囊泡不会出现此类问题。

我们的研究显示，可以通过流式细胞术对血液中存在的微囊泡（MV）亚群进行表征。尽管大多数流式细胞仪的检测下限约为 200 - 300 nm，但在供体样本以及细胞培养样本中，我们均使用相同的分析参数和设门策略，稳定地检测到了 MV，并能将其与背景信号明确区分开来。在检测前必须确认用于分析的 PBS 不含任何可能在流式细胞术中引起高背景的污染颗粒（图3）。尽管一些较小的 MV 可能无法通过流式细胞术检测到，但我们仍检测到了来自所有主要血细胞群体的 MV（例如，血小板、红细胞、白细胞、内皮细胞）。在本研究中，我们采用了先前已在 MV 上发现的不同血细胞的标准标志物26-29。需要注意的是，为了通过流式细胞术获得最佳结果，应对所有抗体的用量和浓度在表达目标抗原的 MV 样本上进行滴定。若需更高特异性地鉴定血液中特定的 MV 亚群，可对相应 MV 上存在的两种不同抗原进行双重染色，并仅将所有双阳性 MV 纳入后续分析23。目前，已有研究致力于定义健康个体血液中 MV 亚群的标准参考范围23,30。这些研究已表明，血小板来源的 MV 是血液中数量最多的 MV 群体，这与我们的观察结果一致。

使用流式细胞术表征微囊泡（MV）样本的一个优势在于，该方法在大多数临床中心已广泛用于诊断目的，这使得MV有可能在日常临床诊断中作为生物标志物使用。以往关于血液中细胞外囊泡（EV）的研究主要集中在较小的外泌体（Exos），这些研究依赖于特定的分选步骤以选择性分析目标外泌体亚群31,32，或需要耗时较长（2天）的分离过程，即在分析前将外泌体偶联到乳胶微珠上18。我们尚未发表的观察结果表明，对全血样本中的MV进行流式细胞术分析，甚至无需上述任何分选步骤，即可检测到肿瘤来源的MV等微囊泡。

综上所述，本文所述方案可利用常规实验室设备从外周血样本中快速分离微囊泡（MVs），并随后通过流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行表征。整个过程约需2小时，将有助于未来对患者血液中微囊泡谱型的研究，从而评估微囊泡作为疾病生物标志物的潜力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Meike Schaffrinski提供的出色技术协助。我们感谢以下人员在采集外周血样本方面的帮助（均来自哥廷根大学医学中心）：Henrietta Vida（输血医学科）、Kia Homayounfar、Lena-Christin Conradi（普通、内脏及小儿外科）、Leila Siam、Bawarjan Schatlo（神经外科）、Hendrik A. Wolff、Martin Canis（耳鼻喉头颈外科），以及多学科肿瘤短期病房的所有工作人员。我们感谢Dirk Wenzel（马克斯·普朗克生物物理化学研究所，哥廷根）在微囊泡电子显微镜检测方面的协助。

本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）项目MetastaSys（资助编号：0316173）以及德国癌症援助组织（资助编号：109615）提供资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蝴蝶针（21 号）Hospira Deutschland GmbH490P29201
牛血清白蛋白 V 组分Roth8076.3配制 10x TBS 时，称取 24.2 g Tris 碱和 80 g NaCl，加 H2O 至 1 L，调节 pH 至 7.6
配制 1x TBS-T 时，将 100 mL 10x TBS 与 900 mL H2O 混合，并加入 1 mL Tween-20
CD235a-PEBeckman CoulterA07792染色时使用 5 µl
CD45-FITCBeckman Coulter7782染色时使用 5 µl
CD62E-PEBiolegend336008染色时使用 0.8 µg
CD62P-PEBiolegend304905染色时使用 0.1 µg
CD81 抗体Biolegend349501以 TBS-T 中含 5% BSA 的溶液按 1:2,000 稀释；进行 Western Blot 时使用非还原条件
CD9 抗体Immunotools21270091以 TBS-T 中含 5% BSA 的溶液按 1:1,000 稀释；进行 Western Blot 时使用非还原条件
化学发光成像仪 ImageQuant LAS-4000Fujitsu Life Sciences
DC 蛋白检测试剂盒 IIBio-Rad5000112
ECL 检测试剂GE HealthcareRPN2232
用于血液采集的 EDTA 真空采血管Sarstedt01.1605.001
FACSCanto IIBD Biosciences
胎牛血清（FCS）Invitrogen10091148热灭活处理（56 °C，30 分钟）
0.22 µm 滤膜Sarstedt83.1826.001
HRP 标记的抗小鼠二抗santa cruzsc-2005以 TBS-T 中含 5% 脱脂奶粉的溶液按 1:10,000 稀释
HRP 标记的抗兔二抗santa cruzsc-2004以 TBS-T 中含 5% 脱脂奶粉的溶液按 1:10,000 稀释
4x Laemmli 上样缓冲液，Roti-Load 1RothK929.1
微量离心机 SIGMA 1-15KSigma Laborzentrifugen
脱脂奶粉（印迹级封闭剂，无脂干奶粉）BioRad170-6404
多功能离心机 multifuge 3 L-RHeraeus
NanoSight LM10NanoSight Ltd.
PBS（不含 Ca 和 Mg）Pan biotechP04-36500
50 mL 注射器（用于输液泵）Braun8728844F
Ponceau-S 染色液PanReac AppliChemA2935,0500
超速离心转子 Sw32.1 Ti（6 × 17 mL）Beckman Coulter
超速离心转子 TLA-120.2（10 × 1.5 mL）Beckman Coulter
流式细胞术用试管（5 mL，圆底）BD Biosciences352054
超速离心用试管（15 mL）Beckman Coulter344061
超速离心用试管（11 × 34 mm）Beckman Coulter343778
微管蛋白抗体Millipore05-829以含 5% BSA 的 TBST 溶液按 1:5,000 稀释
超速离心机 Optima L-80 XPBeckman Coulter
超速离心机 TL-100Beckman Coulter
Seraplas V15 阀式滤器Sarstedt53,428

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