单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

摘要

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg pooled冷冻切片中可获得高质量RNA，并可在不同应用之间直接比较检测结果。

摘要

通过该方法，可连续收集冷冻切片，从而在同一小鼠骨骼肌的相邻区域同时进行组织学显微观察以及RNA富集用于基因表达分析。通常，小体积骨骼肌样本难以实现充分的匀浆，因为缓冲液体积可能过小而无法有效进行研磨；然而，若机械破碎不充分，肌肉致密的组织结构会限制缓冲液试剂的渗透，最终导致RNA得率较低。按照本方案操作，可收集并汇集30 μm的切片，利用冷冻切片及后续的针头匀浆对肌肉组织进行机械破碎，增大组织暴露表面积，促进缓冲液渗透。该技术的主要局限在于需要使用冷冻切片机，且通量相对较低。然而，通过汇集少量肌肉冷冻切片，仍可获得高质量的RNA，因此该方法适用于多种不同骨骼肌及其他组织。此外，该技术可在单块骨骼肌的相邻区域实现匹配分析（例如，组织病理学与基因表达分析），使得不同应用间的检测结果可直接比较，从而降低实验不确定性，并减少为获取少量组织用于多项检测而必需的重复动物实验。

引言

该技术的目标是从单个小体积骨骼肌组织样本中获取可用于多种不同实验分析（如组织学和基因表达分析）的材料。显微镜相关应用对样本保存方法最为敏感，因此必须严格控制保存过程，以限制在冷冻保存期间冰晶伪影的形成。因此，本方法开发采用胫骨前肌（TA）作为起始材料，将其部分浸入包埋树脂后，置于经液氮冷却至-140 °C的2-甲基丁烷浴中快速冷冻，所得样本可同时用于免疫荧光显微镜检测和基因表达分析。

在基于肌肉内注射的实验中，使用相同来源材料以适应多种技术方法尤为重要，因为左右两侧肌肉分别代表不同的实验条件，一侧为实验组，另一侧为对照组。例如，在肌肉再生研究中，通常向一侧肌肉注射毒素以引起广泛的组织损伤，而对侧肌肉则注射载体作为对照¹。类似地，针对肌肉疾病的基因治疗研究通常首先通过肌肉内注射来验证基因治疗载体的效果，并与对侧肌肉注射的空载体、无关载体或载体对照进行比较²。因此，不可能将每块胫前肌（TA肌肉）用于不同的实验用途。

解决此问题的常用策略包括：i) 每次实验使用不同的肌群，ii) 使用额外的小鼠，或 iii) 每次实验从肌肉上切下一小块。然而，不同肌群之间存在显著差异，使得来自不同实验的数据难以比较；而增加动物数量会提高成本，若存在其他替代方案，则这种做法难以被合理化。在许多情况下，将肌肉解剖后分割成小块以用于不同实验是最佳选择。然而，这些肌肉组织块通常过小，无法在液氮中进行研磨或使....

方案

所有动物实验程序均经佐治亚大学机构动物照护与使用委员会根据动物使用协议 A2013 07-016（Beedle）批准。

1. 未固定骨骼肌的冷冻保存

1. 准备
   1. 用剃刀将软木切成小方块（约 1 cm × 1 cm），使用耐 2-甲基丁烷的细头记号笔在软木上标记来源小鼠和肌肉信息，并在软木顶面做一浅切口（约 1 mm 深）。将塑料盖玻片插入切口中，用于组织定位。重复此操作，直至为每份待冷冻保存的组织准备好软木块。
   2. 准备液氮、2-甲基丁烷、包埋树脂、低温温度计、软木块、解剖工具及实验小鼠。
      注意：液氮为压缩气体，受热可能爆炸。操作时应穿戴实验服、耐低温手套和面部防护装置；接触皮肤或眼睛可能导致灼伤或冻伤。2-甲基丁烷具有易燃性，且有毒，对健康和环境有害。操作时应穿戴个人防护装备（实验服、手套、护目镜），在通风橱内打开原装容器，将冷冻所需少量（通常为 200 至 400 ml）转移至可密封的独立容器中，并避免吸入。
   3. 在麻醉条件下采用机构批准的安乐死方法处死小鼠。简要步骤：将小鼠放入异氟烷挥发器提供的含 2.5% 异氟烷的氧气吸入室中，待小鼠停止活动后继续观察 20 秒，检查是否存在足底反射。当足底反射消失时，通过颈椎脱位法对实验小鼠实施安乐死⁶。
      注：安乐死方法须经机构伦理委员会批准。
   4. 去除后肢远....

结果

肌肉冷冻切片RNA质量高，且产量足以满足大多数应用需求

使用来自8只对照小鼠的胫骨前肌（TA）肌肉组织（19.4至41 mg）制备的16个骨骼肌RNA样品的分析结果如表1所示。在再生实验中，分别制备了左侧（L）和右侧（R）TA肌肉，通过沿肌肉纵向注射25 μl生理盐水或10 μM 心肌毒素以诱导肌肉损伤，注射后3天收集肌肉组织，实验方法参照先前报道¹。如表1所示，在这些代表性样品中，冷冻切片肌肉RNA的A260/280比值通常接近2或更高。“纯”RNA的A260/280比值为2.0，一般认为比值在1.8至2.2之间即为合格，因此这些冷冻切片RNA样品的纯度极佳⁹。每个样品的总RNA回收量通常超过10 μg，每毫克起始组织可获得0.18至超过1 μg的总RNA，足以满足大多数下游应用的需求。值得注意的是，注射毒素后3天的TA肌肉所提取的RNA浓度、总.......

讨论

为使本方法获得最佳结果，在组织冷冻保存过程中应将包埋树脂限制在肌肉的下三分之一或下半部分，因为过量的树脂会减慢 pooled cryosections 的收集速度，并可能增加RNA提取过程中包埋树脂的污染。此外，在针头匀浆过程中需格外小心，以最大化产量并尽量减少针头堵塞的可能性。可通过使用带锁扣的Luer-Lok注射器对本方案进行改进，以防针头堵塞后因需高压通液而导致样品损失。也可额外增加一步使用25或26号针头的匀浆操作，以获得更细的组织悬液，进一步提高RNA得率。虽然可用氯仿替代BCP，但不推荐这样做，因为BCP毒性较低，且在RNA有机提取过程中可减少水相中基因组DNA的污染¹²。同样不建议将pooled cryosections的切片厚度增加至超过30 μm，否则匀浆效率会降低。

如果RNA得率低于预期水平，可采用多种策略来提高回收率，例如：i) 增加起始材料的毫克量以提高可能的得率；ii) 将切片厚度减少至30 μm以下，以改善组织的机械均质化；iii) 延长样品在有机提取试剂中的孵育时间和针头均质化时间，以增强组织的机械和化学裂解；iv) 如果仍有组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
软木塞	VWR Scientific	23420-708	使用锋利刀片切成小方块。
塑料盖玻片	Fisher Scientific	12-547	用于在冷冻过程中定位肌肉组织。
低温温度计	VWR Scientific	89370-158
2-甲基丁烷	Sigma	M32631-4L	注意：危险化学品。应储存在易燃物品柜中。
包埋介质："cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	其他包埋介质可替代 cryomatrix 使用。
冷冻切片机	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 配一次性刀片架	任何正常工作的冷冻切片机均可满足本实验方案要求。
一次性冷冻切片机刀片	Thermo Fisher Scientific	3052835	应根据所用冷冻切片机选择合适的刀片或刀具。
RNase 去污染溶液："RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
分析天平	Mettler Toledo	XS64
画笔	Daler Rowney	214900920	用于操作冷冻切片。可在普通美术用品商店购得。
剃须刀片	VWR Scientific	55411-050
显微镜载玻片	VWR Scientific	48311600
RNA 有机提取试剂：TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	注意：TRIzol 为危险化学品。注意：仅推荐使用有机提取试剂从骨骼肌中提取 RNA。
18 号针头	VWR Scientific	BD305185
22 号针头	VWR Scientific	BD305155
26 号针头	VWR Scientific	BD305115	可选。可用于 RNA 提取方案中的第三次样本匀浆步骤。
1 ml 注射器	VWR Scientific	BD309659	对于极高价值样本，建议使用鲁尔锁式注射器（例如，VWR BD309628）。
1-溴-3-氯戊烷（BCP）	Sigma	B9673
用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：200 证明酒精	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。
用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：DEPC 处理水	Thermo Fisher Scientific	AM9922	将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。
RNA 纯化试剂盒：PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	RNA 制备的最后步骤。
DNase/RNase-free 水	Gibco	10977	也可使用 DEPC 处理水。
分光光度计：Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	在进行下游应用前，用此酶处理纯化的 RNA 以去除任何 DNA 污染。
疏水笔	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	用于免疫荧光实验方案的 PBS。
驴血清	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	根据制造商说明复溶正常驴血清原液，然后将一份等分试样稀释至 5% 用于免疫荧光。  也可使用正常山羊血清。
eMHC 抗体	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
胶原蛋白 VI 抗体	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
驴抗兔 AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
山羊抗小鼠 IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）	Thermo Fisher Scientific	D1306
水性封片剂：Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	仅使用专为荧光应用设计并具有抗淬灭特性的封片剂。
玻璃盖玻片	VWR Scientific	16004-314	用于免疫荧光实验方案结束时的封片
图像分析软件：ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express 或更高级产品	免费软件 ImageJ 也可用于手动计数。具有分割功能的更高级软件可能实现部分自动化；例如，ImageProPremier。
合并与映射切片图像：Photoshop	Adobe	Photoshop
心脏毒素	Sigma	C9659	Sigma C9659 已停产。其他心脏毒素选项包括 EMD Millipore #217503；American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618；或 Ge Script # RP17303；但这些尚未经过验证。
逆转录试剂盒：Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	可使用任何经过验证的高质量逆转录试剂。
标准 PCR：GoTaq Flexi 聚合酶系统	Promega	M8298	可使用任何经过验证的高质量 Taq 聚合酶系统。如果 PCR 后续应用涉及 DNA 测序，则应改用高保真 PCR 系统。
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	在未使用专用 qPCR 预混液时用于 qPCR。需与 SuperROX（适用于 Applied Biosystems 仪器）以及 GoTaq Flexi 聚合酶和缓冲液配合使用。
ROX：SuperROX，15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX 在 PCR 反应中更稳定，因此作为 qPCR 被动参比染料优于 ROX（羧基-X-罗丹明）。适用于 Applied Biosystems 仪器的 qPCR。
实时 PCR	Applied Biosystems	7900HT