收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg pooled冷冻切片中可获得高质量RNA，并可在不同应用之间直接比较检测结果。
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本文内容
摘要
摘要
通过该方法，可连续收集冷冻切片，从而在同一小鼠骨骼肌的相邻区域同时进行组织学显微观察以及RNA富集用于基因表达分析。通常，小体积骨骼肌样本难以实现充分的匀浆，因为缓冲液体积可能过小而无法有效进行研磨；然而，若机械破碎不充分，肌肉致密的组织结构会限制缓冲液试剂的渗透，最终导致RNA得率较低。按照本方案操作，可收集并汇集30 μm的切片，利用冷冻切片及后续的针头匀浆对肌肉组织进行机械破碎，增大组织暴露表面积，促进缓冲液渗透。该技术的主要局限在于需要使用冷冻切片机，且通量相对较低。然而，通过汇集少量肌肉冷冻切片，仍可获得高质量的RNA，因此该方法适用于多种不同骨骼肌及其他组织。此外，该技术可在单块骨骼肌的相邻区域实现匹配分析（例如，组织病理学与基因表达分析），使得不同应用间的检测结果可直接比较，从而降低实验不确定性，并减少为获取少量组织用于多项检测而必需的重复动物实验。
引言
该技术的目标是从单个小体积骨骼肌组织样本中获取可用于多种不同实验分析（如组织学和基因表达分析）的材料。显微镜相关应用对样本保存方法最为敏感，因此必须严格控制保存过程，以限制在冷冻保存期间冰晶伪影的形成。因此，本方法开发采用胫骨前肌（TA）作为起始材料，将其部分浸入包埋树脂后，置于经液氮冷却至-140 °C的2-甲基丁烷浴中快速冷冻，所得样本可同时用于免疫荧光显微镜检测和基因表达分析。
在基于肌肉内注射的实验中，使用相同来源材料以适应多种技术方法尤为重要，因为左右两侧肌肉分别代表不同的实验条件，一侧为实验组，另一侧为对照组。例如，在肌肉再生研究中，通常向一侧肌肉注射毒素以引起广泛的组织损伤，而对侧肌肉则注射载体作为对照1。类似地，针对肌肉疾病的基因治疗研究通常首先通过肌肉内注射来验证基因治疗载体的效果，并与对侧肌肉注射的空载体、无关载体或载体对照进行比较2。因此，不可能将每块胫前肌（TA肌肉）用于不同的实验用途。
解决此问题的常用策略包括：i) 每次实验使用不同的肌群，ii) 使用额外的小鼠，或 iii) 每次实验从肌肉上切下一小块。然而，不同肌群之间存在显著差异，使得来自不同实验的数据难以比较；而增加动物数量会提高成本，若存在其他替代方案，则这种做法难以被合理化。在许多情况下，将肌肉解剖后分割成小块以用于不同实验是最佳选择。然而，这些肌肉组织块通常过小，无法在液氮中进行研磨或使用机械研磨技术实现有效匀浆2-5。由于肌肉是一种结构高度致密的组织，富含细胞外基质和收缩蛋白，机械匀浆不充分将导致后续DNA、RNA或蛋白质的得率较低。本文详述的方法可使来自同一块肌肉组织的少量样本用于多种实验应用，结合冷冻切片和针头吹打技术，可改善机械匀浆效果，从而提高RNA得率。
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方案
所有动物实验程序均经佐治亚大学机构动物照护与使用委员会根据动物使用协议 A2013 07-016（Beedle）批准。
1. 未固定骨骼肌的冷冻保存
- 准备
- 用剃刀将软木切成小方块（约 1 cm × 1 cm），使用耐 2-甲基丁烷的细头记号笔在软木上标记来源小鼠和肌肉信息，并在软木顶面做一浅切口（约 1 mm 深）。将塑料盖玻片插入切口中，用于组织定位。重复此操作，直至为每份待冷冻保存的组织准备好软木块。
- 准备液氮、2-甲基丁烷、包埋树脂、低温温度计、软木块、解剖工具及实验小鼠。
注意：液氮为压缩气体，受热可能爆炸。操作时应穿戴实验服、耐低温手套和面部防护装置；接触皮肤或眼睛可能导致灼伤或冻伤。2-甲基丁烷具有易燃性，且有毒，对健康和环境有害。操作时应穿戴个人防护装备（实验服、手套、护目镜），在通风橱内打开原装容器，将冷冻所需少量（通常为 200 至 400 ml）转移至可密封的独立容器中，并避免吸入。 - 在麻醉条件下采用机构批准的安乐死方法处死小鼠。简要步骤：将小鼠放入异氟烷挥发器提供的含 2.5% 异氟烷的氧气吸入室中，待小鼠停止活动后继续观察 20 秒，检查是否存在足底反射。当足底反射消失时，通过颈椎脱位法对实验小鼠实施安乐死6。
注：安乐死方法须经机构伦理委员会批准。 - 去除后肢远端覆盖的皮肤，使用尖头解剖剪在踝关节上方切断远端前侧肌腱。用精细镊子夹住远端肌腱，轻轻向上并向膝关节方向牵拉，同时切开外侧筋膜以释放肌肉。将肌肉垂直于膝关节方向拉出，并进行最终切割以完整切除胫前肌（TA 肌）7。
注：此处以 TA 肌为例，但根据用户实验目的，本方案中可用其他小鼠骨骼肌或心脏组织替代 TA 肌。唯一限制是组织必须足够小，以确保在整个厚度方向上实现快速冷冻保存；建议最大组织尺寸为 1 cm × 1 cm。 - 对另一侧后肢重复上述操作，并解剖取出其他需收集的组织。解剖过程应尽可能迅速，以减少组织在冷冻保存前的降解。
- 将每块肌肉按横切面方向放置于预先标记的软木块上。使肌肉垂直于软木，远端肌腱接触软木，肌肉顶端向外延伸，并由盖玻片支撑保持直立。
- 解剖完成后应尽快对所有组织进行冷冻保存以用于组织学分析，最好在 5 分钟内完成，且自供体动物安乐死后不得超过 15 分钟。
- 冷冻保存
- 在解剖结束前 5 分钟开始冷却冷冻浴。将 2-甲基丁烷倒入敞口金属烧杯中，深度约 3 cm；将液氮倒入保温容器中，深度为 2 至 4 cm。将盛有 2-甲基丁烷的烧杯置于液氮中，液氮会开始沸腾。注意避免液氮溅入 2-甲基丁烷烧杯中。
注意：冷冻浴应在通风橱或通风良好的区域中配制。 - 将低温温度计插入 2-甲基丁烷中监测温度，并频繁用叉子搅拌以确保均匀冷却。持续搅拌并冷却至 2-甲基丁烷温度达到 -140 °C，必要时向外部液氮浴中补充新鲜液氮。
注：-140 °C 是减少横纹肌中冰晶伪影的最佳温度；其他组织的最佳冷冻保存温度可能不同（例如，脑组织为 -90 °C）。 - 仅在肌肉与软木接触的下部 35–50% 区域涂抹包埋树脂，随后立即将软木块投入 -140 °C 的 2-甲基丁烷中。每批冷冻最多可快速重复此操作处理 8 份组织。搅拌 30 秒，刮擦烧杯底部，确保组织不会冻结在凝固的 2-甲基丁烷中。
- 使用叉子、带孔勺或大号镊子将各组织软木块从 2-甲基丁烷中取出。迅速移除盖玻片，轻蘸烧杯内壁以去除多余 2-甲基丁烷，然后将软木块投入外部液氮浴中。对烧杯中剩余的所有软木块重复此操作。
- 将样本置于液氮或干冰中转移至 -80 °C 冰箱中保存。
- 若仍有组织待冷冻保存，重复步骤 1.2.3 至 1.2.4。根据需要向烧杯中补充 2-甲基丁烷或向外部液氮浴中补充液氮，并重新冷却至 -140 °C。使用过的 2-甲基丁烷应作为危险废物妥善处理。
- 在解剖结束前 5 分钟开始冷却冷冻浴。将 2-甲基丁烷倒入敞口金属烧杯中，深度约 3 cm；将液氮倒入保温容器中，深度为 2 至 4 cm。将盛有 2-甲基丁烷的烧杯置于液氮中，液氮会开始沸腾。注意避免液氮溅入 2-甲基丁烷烧杯中。
2. 收集冷冻切片用于组织学和RNA应用
- 准备
- 在分析天平上预先称量一个无DNase/RNase且经高压灭菌的离心管，然后将其放入冷冻切片机舱室内预冷。重复此步骤，直至为所有待收集的 pooled 冷冻切片样本准备好相应数量的预冷离心管。
- 进行骨骼肌切片时，通过冷冻切片机内置恒温器确认切片舱温度为 -21 至 -22 °C。将含有待切组织的容器转移至切片舱内，并在打开容器前至少静置 15 分钟，使容器及组织温度与冷冻切片机环境温度达到平衡。
- 插入新的一次性冷冻切片机刀片。或者，取下现有刀片，喷洒RNase去污染溶液，用ddH₂O冲洗2O，并重新放回冷冻切片机中冷却。用70%乙醇喷洒一块洁净的组织，仔细擦拭刀片和刀片夹紧平台。
- 用RNase去污染溶液喷洒干净的纸巾，擦拭冷冻切片机刷子。用ddH₂O喷洒纸巾2O，再次擦拭刷子，并将其放置在冷冻切片机腔室内干净的表面上。
注意： 使用完毕后，应将冷冻切片机刀片用刀片保护罩盖好。此外，RNase去污染溶液具有毒性，且在低温冷冻切片机腔室内会冻结形成沉淀物，因此需小心操作，避免在冷冻切片机腔室内使用该溶液。
- 用RNase去污染溶液喷洒干净的纸巾，擦拭冷冻切片机刷子。用ddH₂O喷洒纸巾2O，再次擦拭刷子，并将其放置在冷冻切片机腔室内干净的表面上。
- 在冷冻切片机腔室内，取约300 μl（直径约等于10美分硬币大小）包埋树脂滴加至预热的组织样本头上，将组织软木塞置于树脂上，轻压固定，随后将样本头放入冷冻架或置于快速冷冻装置（如有）上。
- 包埋树脂凝固（白色）后，在软木塞顶部、组织下部35%周围添加额外的包埋树脂，并将散热器压入包埋树脂中，以实现快速冷冻，从而更好地稳定组织。切片前等待5分钟，使树脂充分硬化。
- 确保标本夹处于最回缩的位置，即距离刀片最远的位置。将组织标本夹头插入标本夹中。
- 冷冻切片制备
- 松开刀片架固定座，将刀片的间隙角调整至10°（或根据所用刀片架选择合适的角度），然后重新拧紧。松开制动器，转动手动轮使肌肉组织向刀片方向下降。估测组织与刀片之间的最近距离，随后将组织移离刀片，并锁紧手动轮制动器。
- 松开高度调节杆，如果组织末端距离刀片超过约2 mm，或刀片触碰到组织，则相应地将刀片架向前或向后移动。拧紧后再次降低组织，以检查与刀片的距离。重复调整，直至通过目测估计刀片距离组织末端1至2 mm为止。
- 将组织朝向刀片降低，并调整组织角度以获取横切面。锁紧手轮并松开标本夹持杆。向左或向右移动标本夹，直至组织的水平方向与刀片垂直。
- 上下移动标本夹以调节 "y" 调整方向，使组织切片与肌肉长轴垂直。拧紧标本夹紧杆。
- 使用粗调和微调进样装置推进样品，直至其轻轻接触刀片。若需获取特定组织深度的切片，应将切片厚度总和重置为零（即组织顶部）。
- 将冷冻切片机设置为修块模式，切片厚度为 30 μm。切片并弃去，直至达到预先选定的组织采集深度（例如， 距顶部400 μm。
- 收集冷冻切片用于RNA提取。
- 打开收集切片的离心管，将其放置在刀架附近。使用预先冷却的洁净毛笔逐片拾取从刀片上切下的组织，将冷冻切片转移至离心管中。重复此操作，直至收集的组织总量达到30 mg或达到所需的组织深度。
注意：对于成年小鼠的胫骨前肌，从组织深度约400至4,000 μm处采集，通常可获得25–40 mg组织。不建议使用金属镊子转移切片至收集管，因为切片容易黏附并聚集在金属表面。 - 如果肌肉冷冻切片周围包埋有树脂，请锁紧手刹，然后用刀片削去树脂的小块，直至肌肉顶部仅剩一层薄薄的树脂。削除树脂时，刀片始终应朝远离肌肉的方向倾斜切割。
注意：包埋树脂薄层不会显著影响后续的RNA制备。若存在较厚的包埋树脂，应在将冷冻切片转移至收集管之前，使用刷子将其从肌肉组织上轻轻去除。 - 或者，将刀片载体上的切片汇集后，批量转移至收集管中。
注意：然而，该方法速度较慢，且切片更容易粘连和聚集，这可能会降低后续步骤中针头匀浆的效率。 - 迅速将收集好的冷冻切片管放入分析天平称重，并记录管重。立即将管子放回低温恒冷切片机舱内，以维持切片温度接近 -20 °C。计算收集切片的重量。
注意：如果RNA提取将在另一天进行，请将汇集的冷冻切片管保存于-80 °C，直至使用。
- 打开收集切片的离心管，将其放置在刀架附近。使用预先冷却的洁净毛笔逐片拾取从刀片上切下的组织，将冷冻切片转移至离心管中。重复此操作，直至收集的组织总量达到30 mg或达到所需的组织深度。
- 收集冷冻切片用于组织学分析。
- 按压切片厚度按钮以进行精细切片，并使用箭头键将冷冻切片机的切片厚度设置为 7 μm（或其他合适的切片厚度，通常为 6 至 10 μm）。
注意：组织学应用应使用较薄的切片（6至10 μm），以确保染色试剂能够渗透到组织切片的深层。冷冻切片过程中可从任意深度获取薄切片，但更推荐较深部的切片，因为包埋树脂随组织深度增加而增多，但不会影响组织学染色效果。 - 切去并弃除4到7个切片，以获得一致且平整的组织表面。记录组织的深度。
- 切割组织片段并将其放置在刀片载体表面进行定位。用预热（室温）的显微镜载玻片轻轻快速接触刀片载体上的组织片段，以拾取该片段。将载玻片恢复至室温。重复此操作直至获得所需数量的载玻片。记录最终的组织深度。
注意：建议为每种组织收集第二个（重复）切片。 - 切片完成后，锁紧手轮制动器，将样本移回最后位置，并取下组织样本夹。使用冷冻切片机的加热元件熔化固定组织块在样本夹上的包埋树脂。取出组织块，用纸巾擦干后放回储存处。
- 对每个剩余组织重复步骤2.1.2。所有组织贴片完成后，让载玻片干燥20分钟。随后，直接用于组织学或免疫荧光染色，或置于载玻片盒中于-80 °C冻存备用。
- 按压切片厚度按钮以进行精细切片，并使用箭头键将冷冻切片机的切片厚度设置为 7 μm（或其他合适的切片厚度，通常为 6 至 10 μm）。
3. 从汇集的冷冻切片中分离 RNA
- RNA 提取
- 将汇集的冷冻切片管置于冰上。立即加入有机 RNA 提取试剂，每 50 mg 冷冻切片组织约使用 1 ml 试剂，通常每管加入 600 μl。
注意： RNA 分离试剂具有毒性、腐蚀性并可引起刺激。请遵循制造商提供的安全操作说明。 - 使用带 18 号针头的 1 ml 注射器，吸取 RNA 提取液并冲洗管壁，直至所有组织悬浮于溶液中。在针头匀浆过程中尽量减少气泡产生。
- 用针头尖端压碎并分散附着在管壁上的结块冷冻切片组织。通过将样品在针头中反复抽吸 5 次进行吹打匀浆，然后将样品放回冰上。重复上述两个步骤 3 至 5 次，或根据需要重复足够次数，以彻底破坏所有结块，并使样品能顺利通过针头。
- 取下 18 号针头，更换为 22 号针头。小心地将样品吹打 5 次，然后放回冰上。重复吹打 3 至 4 次，以获得高度分散的组织匀浆液。
注：若在吸取样品时组织颗粒开始堵塞针头，应将注射器内样品全部排出，并换回 18 号针头继续进行匀浆。可额外增加一步使用 25 或 26 号针头的吹打步骤以获得最大得率。但需注意针头可能堵塞，存在样品溢出的风险。 - 将样品从冰上转移至室温。室温孵育 5 分钟，以破坏分子复合物。
- 在通风橱中，每使用 1 ml RNA 分离试剂（步骤 3.1.1）加入 0.1 ml 1-溴-3-氯戊烷（BCP），通常每管加入 60 μl。用手剧烈振荡试管 15 秒（不可使用涡旋振荡器）。室温孵育 2 至 3 分钟，随后在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
注意： BCP 易燃且有毒。操作时应在通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜。 - 小心收集含有 RNA 的上层水相（无色），转移至洁净离心管中。加入等体积的 70% 乙醇（溶于 DEPC 水），涡旋混匀。室温孵育最多 10 分钟。
注：中间的界面层和下层酚-BCP 相可根据制造商说明分别用于基因组 DNA 和蛋白质的提取，或收集至含酚-BCP 的危险废物容器中进行妥善处理。
- 将汇集的冷冻切片管置于冰上。立即加入有机 RNA 提取试剂，每 50 mg 冷冻切片组织约使用 1 ml 试剂，通常每管加入 600 μl。
- RNA 纯化
- 按照制造商说明进行样品结合、洗涤和洗脱操作，可进行轻微调整8。例如：
- 将一份 DNase/RNase-free 水置于 37 °C 水浴或培养箱中预热，用于步骤 3.2.4。
- 将上述步骤 3.1.8 中获得的 RNA 样品加入纯化柱中，在室温下以 12,000 × g 离心 15 秒。将流出液倒回同一纯化柱中，再次离心。额外重复一次以最大化 RNA 结合效率，然后弃去最终流出液。
- 根据制造商说明进行洗涤步骤8。向柱中加入 700 μl 洗涤缓冲液（不含乙醇），以 12,000 × g 离心 15 秒，弃去流出液。
- 向柱中加入 500 μl 洗涤缓冲液（含乙醇），以 12,000 × g 离心 15 秒，弃去流出液。重复此步骤一次。
- 将空柱以 12,000 × g 离心 1 分钟，以干燥膜。
- 将离心柱转移至一支洁净的无 RNase、无 DNase 的离心管中。向柱膜中心加入 40 μl 预热的 DNase/RNase-free 水（来自步骤 3.2.1）。室温孵育 2 分钟，然后以 12,000 × g 离心 2 分钟。
注：对于 30 mg 汇集的冷冻切片组织，40 μl 的洗脱体积约为每毫克原始组织 1.3 μl。应根据起始组织重量适当调整洗脱体积，但不得低于 32 μl。可额外进行第二次洗脱，使用约每毫克原始组织 0.7 μl 的体积，以提高总 RNA 得率。 - 使用分光光度计、电泳和/或生物分析仪检测 RNA（柱洗脱液）的浓度和纯度。将 RNA 储存于 -80 °C，直至用于下游实验，如定量 PCR 的逆转录反应4。
注：建议在下游应用前进行 DNase 处理。该处理可在某些 RNA 纯化柱的洗涤步骤前、柱洗脱后的此特定时间点，或作为任何下游应用的第一步对 RNA 分装样品进行。RNA 可稳定保存数年。
4. 肌肉冷冻切片免疫荧光染色的组织学分析
- 简单的免疫荧光实验步骤。
- 使用疏水性画笔在每张载玻片上的组织区域周围画圈。轻轻将 PBS 滴加至画圈区域内（小面积约 80 μl，大面积可达 500 μl），注意不要触碰组织。室温孵育 5 分钟。
注意：若使用冷冻切片，需先从 -80 °C 冰箱中取出载玻片，在室温下放置 20 至 30 分钟以解冻并干燥，然后按上述步骤进行。至少需要两张载玻片：一张为实验组切片，用于一抗和二抗孵育；另一张为对照组切片，不加一抗，仅加二抗，即"仅二抗"对照。 - 倾斜载玻片倒掉 PBS。向画圈区域加入含 5% 驴血清的 PBS（封闭液），注意确保肌肉切片不干燥。室温孵育 30 分钟（或在湿盒中孵育数小时）。
- 配制用于分析肌肉再生的一抗溶液。将封闭液与 eMHC 抗体（1:40）和 ColVI 抗体（1:1,000）混合。根据切片面积大小，分别准备约 150 μl、300 μl 或 500 μl。涡旋振荡 5 秒，然后在 15,000 × g 离心 2 分钟，以沉淀任何不溶物。
- 对于实验组切片，倾斜载玻片倒掉封闭液，然后加入步骤 4.1.3 中配制的一抗溶液。对于二抗对照切片，倾斜载玻片倒掉封闭液，然后加入新鲜封闭液（不含抗体）。将所有载玻片置于湿盒中，4 °C 过夜孵育。
注意：向载玻片上加样抗体溶液时，应始终从一抗溶液管的上层吸取液体，避免扰动管底的沉淀物。 - 倾斜载玻片倒掉溶液。逐滴加入 PBS 至每张载玻片的画圈区域进行洗涤，倾斜倒掉 PBS，再加入新的 PBS，孵育 3 至 5 分钟。重复此步骤共洗涤三次。
注意：洗涤时间具有较大灵活性，可根据需要延长至 20 分钟。通常，换液次数比单次洗涤时间更为重要。 - 为所有载玻片（包括二抗对照切片）配制二抗溶液，使用 1:500 稀释的红色和绿色荧光标记二抗分别检测小鼠 IgG1（eMHC）和兔 IgG（ColVI），并使用 1:10,000 稀释的 DAPI 核染料。
- 例如，将 1 μl DAPI 与 9 μl ddH2O 混合，配制成 1:10 稀释的 DAPI 溶液。然后，为获得 500 μl 的终体积，向 447.5 μl 封闭液中加入 1.0 μl 抗小鼠 IgG1-红色抗体 + 1.0 μl 抗兔 IgG-绿色抗体 + 0.5 μl 1:10 稀释的 DAPI。涡旋混匀后，在 15,000 × g 离心 2 分钟以沉淀不溶物。
注意：理想情况下，所有二抗应来源于同一宿主物种。
- 例如，将 1 μl DAPI 与 9 μl ddH2O 混合，配制成 1:10 稀释的 DAPI 溶液。然后，为获得 500 μl 的终体积，向 447.5 μl 封闭液中加入 1.0 μl 抗小鼠 IgG1-红色抗体 + 1.0 μl 抗兔 IgG-绿色抗体 + 0.5 μl 1:10 稀释的 DAPI。涡旋混匀后，在 15,000 × g 离心 2 分钟以沉淀不溶物。
- 倾斜载玻片倒掉最后一次 PBS 洗涤液。加入二抗溶液覆盖所有组织。用遮光材料覆盖载玻片以避光，室温孵育 30 分钟。
注意：所有二抗均应经过验证，在双标实验中对其他物种具有最小交叉反应性。 - 按照步骤 4.1.5 的方法洗涤载玻片。最后一次洗涤后，倾斜载玻片倒掉 PBS，并将载玻片置于纸巾上。沿一侧滴加 3 至 4 滴水性封片剂。
- 将玻璃盖玻片的一边置于封片剂外缘处。用镊子缓慢将盖玻片向下放低至组织表面，然后松开镊子，轻压使其就位。最后，轻轻按压盖玻片的每个角以固定。
- 避光保存于 4 °C，待后续使用。
注意：如需长期保存，可在盖玻片边缘涂一层薄薄的指甲油，以防止切片干燥。
- 使用疏水性画笔在每张载玻片上的组织区域周围画圈。轻轻将 PBS 滴加至画圈区域内（小面积约 80 μl，大面积可达 500 μl），注意不要触碰组织。室温孵育 5 分钟。
- 组织学评估。
- 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜，配合适当的滤光片对切片成像，以检测 eMHC（红色）、ColVI（绿色）以及 DAPI 染色的细胞核（蓝色），通常使用 20X 物镜1,5。
- 确认实验组切片的荧光信号与二抗对照切片存在差异，以证明 eMHC 和 ColVI 检测的特异性4。
注意：eMHC 阳性的再生肌纤维通常在肌肉损伤后约 2 至 7 天可见，在肌营养不良小鼠中亦可变性出现。胶原蛋白 VI（ColVI）存在于肌纤维、血管和神经周围的细胞外基质，以及肌束膜和肌外膜中的较大结缔组织束中。DAPI 核染有助于区分具有中央核或周边核的肌纤维，从而判断纤维是否再生，并可识别浸润细胞的存在。由于内源性 IgG 可通过受损的肌膜进入肌纤维，坏死或损伤的肌纤维可能因小鼠 IgG 二抗的非特异性结合而呈现弱阳性染色。 - 为定量分析再生情况，使用每种荧光滤光片在整个切片区域连续拍摄多张部分重叠的显微图像。对每个位置的 eMHC、ColVI 和 DAPI 图像进行合并，然后拼接图像以重建整个切片的完整图谱1,5。
- 使用图像分析软件，统计 eMHC 阳性肌纤维数量及总肌纤维数量，计算近期再生率（100×(eMHC+ 肌纤维数 / 总肌纤维数)）。同时，统计中央核肌纤维占总肌纤维的比例，以评估较长时间范围内的再生程度（100×(中央核+ 肌纤维数 / 总肌纤维数)）1,5。
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结果
肌肉冷冻切片RNA质量高，且产量足以满足大多数应用需求
使用来自8只对照小鼠的胫骨前肌（TA）肌肉组织（19.4至41 mg）制备的16个骨骼肌RNA样品的分析结果如表1所示。在再生实验中，分别制备了左侧（L）和右侧（R）TA肌肉，通过沿肌肉纵向注射25 μl生理盐水或10 μM 心肌毒素以诱导肌肉损伤，注射后3天收集肌肉组织，实验方法参照先前报道1。如表1所示，在这些代表性样品中，冷冻切片肌肉RNA的A260/280比值通常接近2或更高。“纯”RNA的A260/280比值为2.0，一般认为比值在1.8至2.2之间即为合格，因此这些冷冻切片RNA样品的纯度极佳9。每个样品的总RNA回收量通常超过10 μg，每毫克起始组织可获得0.18至超过1 μg的总RNA，足以满足大多数下游应用的需求。值得注意的是，注射毒素后3天的TA肌肉所提取的RNA浓度、总...
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讨论
为使本方法获得最佳结果，在组织冷冻保存过程中应将包埋树脂限制在肌肉的下三分之一或下半部分，因为过量的树脂会减慢 pooled cryosections 的收集速度，并可能增加RNA提取过程中包埋树脂的污染。此外，在针头匀浆过程中需格外小心，以最大化产量并尽量减少针头堵塞的可能性。可通过使用带锁扣的Luer-Lok注射器对本方案进行改进，以防针头堵塞后因需高压通液而导致样品损失。也可额外增加一步使用25或26号针头的匀浆操作，以获得更细的组织悬液，进一步提高RNA得率。虽然可用氯仿替代BCP，但不推荐这样做，因为BCP毒性较低，且在RNA有机提取过程中可减少水相中基因组DNA的污染12。同样不建议将pooled cryosections的切片厚度增加至超过30 μm，否则匀浆效率会降低。
如果RNA得率低于预期水平，可采用多种策略来提高回收率，例如：i) 增加起始材料的毫克量以提高可能的得率；ii) 将切片厚度减少至30 μm以下，以改善组织的机械均质化；iii) 延长样品在有机提取试剂中的孵育时间和针头均质化时间，以增强组织的机械和化学裂解；iv) 如果仍有组...
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披露
作者声明其不存在任何竞争性经济利益。
致谢
Madison Grant、Steven Foltz、Halie Zastre 和 Junna Luan 提供了技术协助。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所，资助编号为 AR065077。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 软木塞 | VWR Scientific | 23420-708 | 使用锋利刀片切成小方块。 |
| 塑料盖玻片 | Fisher Scientific | 12-547 | 用于在冷冻过程中定位肌肉组织。 |
| 低温温度计 | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-甲基丁烷 | Sigma | M32631-4L | 注意：危险化学品。应储存在易燃物品柜中。 |
| 包埋介质："cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | 其他包埋介质可替代 cryomatrix 使用。 |
| 冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 配一次性刀片架 | 任何正常工作的冷冻切片机均可满足本实验方案要求。 |
| 一次性冷冻切片机刀片 | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | 应根据所用冷冻切片机选择合适的刀片或刀具。 |
| RNase 去污染溶液："RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | XS64 | |
| 画笔 | Daler Rowney | 214900920 | 用于操作冷冻切片。可在普通美术用品商店购得。 |
| 剃须刀片 | VWR Scientific | 55411-050 | |
| 显微镜载玻片 | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA 有机提取试剂：TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | 注意：TRIzol 为危险化学品。注意：仅推荐使用有机提取试剂从骨骼肌中提取 RNA。 |
| 18 号针头 | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 号针头 | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 号针头 | VWR Scientific | BD305115 | 可选。可用于 RNA 提取方案中的第三次样本匀浆步骤。 |
| 1 ml 注射器 | VWR Scientific | BD309659 | 对于极高价值样本，建议使用鲁尔锁式注射器（例如，VWR BD309628）。 |
| 1-溴-3-氯戊烷（BCP） | Sigma | B9673 | |
| 用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：200 证明酒精 | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | 将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。 |
| 用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：DEPC 处理水 | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | 将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。 |
| RNA 纯化试剂盒：PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA 制备的最后步骤。 |
| DNase/RNase-free 水 | Gibco | 10977 | 也可使用 DEPC 处理水。 |
| 分光光度计：Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | 在进行下游应用前，用此酶处理纯化的 RNA 以去除任何 DNA 污染。 |
| 疏水笔 | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | 用于免疫荧光实验方案的 PBS。 |
| 驴血清 | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | 根据制造商说明复溶正常驴血清原液，然后将一份等分试样稀释至 5% 用于免疫荧光。 也可使用正常山羊血清。 |
| eMHC 抗体 | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| 胶原蛋白 VI 抗体 | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| 驴抗兔 AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| 山羊抗小鼠 IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| 水性封片剂：Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | 仅使用专为荧光应用设计并具有抗淬灭特性的封片剂。 |
| 玻璃盖玻片 | VWR Scientific | 16004-314 | 用于免疫荧光实验方案结束时的封片 |
| 图像分析软件：ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express 或更高级产品 | 免费软件 ImageJ 也可用于手动计数。具有分割功能的更高级软件可能实现部分自动化；例如，ImageProPremier。 |
| 合并与映射切片图像：Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| 心脏毒素 | Sigma | C9659 | Sigma C9659 已停产。其他心脏毒素选项包括 EMD Millipore #217503；American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618；或 Ge Script # RP17303；但这些尚未经过验证。 |
| 逆转录试剂盒：Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | 可使用任何经过验证的高质量逆转录试剂。 |
| 标准 PCR：GoTaq Flexi 聚合酶系统 | Promega | M8298 | 可使用任何经过验证的高质量 Taq 聚合酶系统。如果 PCR 后续应用涉及 DNA 测序，则应改用高保真 PCR 系统。 |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | 在未使用专用 qPCR 预混液时用于 qPCR。需与 SuperROX（适用于 Applied Biosystems 仪器）以及 GoTaq Flexi 聚合酶和缓冲液配合使用。 |
| ROX：SuperROX，15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX 在 PCR 反应中更稳定，因此作为 qPCR 被动参比染料优于 ROX（羧基-X-罗丹明）。适用于 Applied Biosystems 仪器的 qPCR。 |
| 实时 PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
参考文献
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