利用软琼脂覆盖技术筛选细菌产生的抑制性化合物

摘要

我们介绍一种用于筛选细菌培养物是否产生对其他细菌具有抑制作用化合物的简单方法。

摘要

软琼脂覆盖技术最初在70多年前开发，已广泛应用于微生物学研究的多个领域，包括噬菌体和细菌素（一类蛋白质性质的抗菌物质）的相关研究。该方法成本相对较低，对资源的需求极少。该技术包括将供体菌株（可能含有毒性物质）的上清液点样到接种了受试细菌菌株（可能对毒性物质敏感）的凝固软琼脂覆盖层上。我们利用该技术筛选了一个Pseudomonas syringae菌株文库，以寻找种内杀伤作用。通过将该方法与沉淀步骤及靶向基因缺失相结合，可区分同一菌株产生的多种毒性物质。使用该技术通常可分离出两类拮抗物质：噬菌体和细菌素。这两类物质可通过两个简单的附加实验加以区分。对含有噬菌体的上清液进行系列稀释时，随着稀释倍数增加，形成的单个噬菌斑数量会逐渐减少；而对含有细菌素的上清液进行系列稀释时，随着稀释倍数增加，透明圈会整体逐渐变得更为浑浊。此外，将含有噬菌体的样品点样到接种了相同菌株的新鲜软琼脂覆盖层上时，会形成透明圈；而将细菌素转移至新鲜的软琼脂菌层时则不会形成透明圈，这是由于细菌素在转移过程中被稀释所致。

引言

近年来，人们越来越关注深入理解微生物生态学（特别是各种环境中的微生物组），以及发现新的抗菌化合物以应对耐药性病原菌^1,2。这些研究兴趣之间的一个共同主题是了解细菌菌株在自然环境中的拮抗相互作用。细菌可通过多种方式对竞争者产生拮抗作用³。细菌素是一类多样化的蛋白质性质的抗菌化合物，长期以来被用于研究其在介导细菌间拮抗作用中的功能，其中研究最多的两种细菌是重要的人类病原菌Pseudomonas aeruginosa^4,5和Escherichia coli⁶。除了细菌素之外，诱导型前噬菌体也可作为抗竞争因子，使某一菌株能够侵入已被其他菌株占据的生态位点⁷。Pseudomonas syringae是一种植物病原菌，已知可产生多种抗菌物质，包括单蛋白细菌素⁸、噬菌体尾部衍生的细菌素⁹（称为尾素，tailocins），以及非蛋白质类次级代谢产物¹⁰。最近，人们开始关注这些抗菌物质如何影响该生物的生态学特性，以及如何利用它们来控制植物病害¹¹。

研究细菌素和噬菌体的常用方法之一是软琼脂覆盖技术。该方法最早由Gratia于1936年描述，最初用于噬菌体的计数^12,13。

本文介绍了软琼脂覆盖法结合靶向遗传操作和聚乙二醇（PEG）沉淀技术的应用，用于区分单个细菌菌株产生的三种不同抗菌物质（一种噬菌体、一种高分子量细菌素和一种低分子量细菌素）。该方法的优势在于操作相对简单且成本低廉，因此尽管其属于明显的“低技术”方法，至今仍被广泛使用。

方案

1. 活性检测用上清液的制备

1. 通过将适量的丝裂霉素C溶解于无菌的0.1 M MgSO₄中，配制浓度为0.5 mg/ml的丝裂霉素C储备液₄ 缓冲液（例如 1 mg 丝裂霉素C/2 ml 缓冲液。将储备液置于4 °C避光容器中保存（丝裂霉素C对光敏感）。
2. 接种单个菌落 P. syringae 到3 ml的King's B培养基（KB）肉汤中¹⁴在室温（21–25 °C）下振荡孵育过夜（200 rpm）。
3. 次日早晨，将肉汤培养物按1/100比例稀释至3 ml新鲜KB肉汤中，于室温振荡培养3–4小时。加入丝裂霉素C（终浓度0.5 µg/ml），于室温振荡过夜培养。
   注意：丝裂霉素C可引起双链DNA断裂，从而激活细胞的SOS反应，诱导产生噬菌体和细菌素。
4. 在台式微量离心机中，以20,000 × g离心5分钟，沉淀1-2 ml丝裂霉素C诱导的培养物。
5. 去除培养上清液，并通过以下任一方法进行灭菌：将上清液经0.22 µm孔径滤膜过滤，或用氯仿处理上清液（每1 ml上清液加入100 µl氯仿）。
   1. 若使用氯仿，将混合物涡旋振荡15秒，并在室温下孵育1小时。孵育结束后，以20,000 × g离心5分钟。
      注意：氯仿通过溶解细胞膜有效杀灭细胞。与过滤除菌相比，使用氯仿的优势在于成本更低，且在处理大量样本时更易于放大操作。>每次处理 20 个样品。由于氯仿处理后活性物质可能分配至有机相，导致部分杀伤活性丧失。
   2. 使用1 ml移液器小心移除上层水相至新的无菌1.5或2.0 ml微量离心管中。注意避免转移下层氯仿相（为避免交叉污染，宁可少取水相）。
   3. 在通风橱中将转移的上清液敞口孵育，使残留的氯仿挥发（数小时）。将上清液于 4 °C 保存。

2. 通过聚乙二醇（PEG）沉淀分离和浓缩高分子量杀菌化合物

1. 向无菌上清液中加入 NaCl 和 PEG 8000，使其终浓度分别为 1 M 和 10%。反复倒置样品，直至 NaCl 和 PEG 完全溶解。将样品置于冰浴中孵育 1 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
2. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 30 分钟。离心管底部应形成沉淀。弃去上清液，并用缓冲液（10 mM Tris，10 mM MgSO₄，pH 7.0）重悬沉淀，缓冲液体积为原始上清液体积的 1/10 或 1/100，通过反复吹打实现重悬。
3. 用等体积氯仿连续萃取两次，以去除残留的 PEG。
   1. 将氯仿与重悬的沉淀混合，涡旋振荡 10 至 15 秒，然后在 20,000 × g 下离心 5 分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中。重复此萃取步骤，直至水相与有机相之间无可见白色界面（通常共需 2 次）。将萃取后的上清液置于通风橱中，使残留氯仿完全挥发。

3. 准备覆盖层并检测上清液的活性

1. 挑取待测敏感性的 P. syringae 菌株单菌落接种于 3 ml KB 培养基中，于室温下振荡培养过夜。
2. 次日早晨，将菌液按 1/100 比例转接到新鲜 KB 培养基中，于室温下振荡培养 3–4 小时。
3. 通过高压灭菌超纯水中含 0.35–0.7%（w/v）琼脂的悬浮液，制备无菌水琼脂。
   注意：软水琼脂储备液可经微波炉熔化后重复使用，每次实验无需重新配制新的覆盖层。若重复使用水琼脂，必须确保微波加热后完全熔化。否则，覆盖层凝固后将呈现颗粒状质地，影响结果判读。若出现此情况，应比前次多加热数分钟以彻底熔化琼脂。
4. 使用前将熔化的软琼脂置于 60 °C 水浴中保温。用无菌移液管吸取 3 ml 软琼脂加入无菌培养管中，并将培养管放回水浴中以维持其熔融状态。
5. 倾注覆盖层前，需先让熔融琼脂稍冷却（触感温热但不烫手），但不得使其凝固。
6. 在无菌操作台内，向软琼脂中加入 100 µl 测试菌株菌液，涡旋混匀。手动轻轻旋转培养管 10–15 秒，然后将其倾注于底层琼脂（KB 琼脂）表面。倾斜培养皿，使软琼脂均匀覆盖整个底层琼脂。
   注意：底层琼脂可为任何能使测试菌株旺盛生长的固体培养基（含 1.5% 琼脂）。对于标准的 100 mm 直径培养皿，使用约 20 ml 熔化的培养基。底层琼脂可提前数周制备（若保存于 4 °C 且未干燥），也可在当天制备。若在当天制备，建议在步骤 3.4 之前完成。
7. 盖上培养皿，静置 20–30 分钟使其凝固。凝固过程中避免扰动培养皿。
8. 待琼脂凝固后，在覆盖层表面点加 2–5 µl 上清液（来自上述第 1 和第 2 部分）。将培养皿于室温下培养过夜，次日早晨观察并记录结果。
   注意：可考虑对上清液进行系列稀释后点样。这有助于研究人员区分噬菌体与细菌素的清除活性。在此情况下，建议进行 1:5 或 1:10 的稀释。

结果

通过结合软琼脂覆盖法和聚乙二醇沉淀法，可用于鉴定和表征同一菌株产生的不同抗菌物质。图1展示了两种P. syringae菌株（A和B），它们均被同一种的第三种菌株所抑制。然而，这两种菌株受到不同的细菌素抑制。菌株A上的透明圈边缘清晰，而菌株B的透明圈更大且边界不清晰。通过对产生菌株进行遗传操作，特异性失活尾素（尾素缺陷型）或低分子量细菌素（细菌素缺陷型），可证实菌株A和B对不同的细菌素敏感。图2显示，通过比较系列稀释液，可将噬菌体介导的杀灭作用与其他非复制型抗菌物质区分开来。由于细菌素和前噬菌体均可通过丝裂霉素C处理诱导产生，因此这两种物质的活性可能非常相似（特别是当激活的噬菌体含量较高时）。在噬菌体介导的透明圈情况下，上清液稀释后会形成单个噬菌斑（透明区），而细菌素介导的透明圈则不会形成此类噬菌斑。

图1：同一菌株产生的多种抗菌物质的表型区分。 菌株A对高分子量细菌素（尾素）敏感，但对另一种低分子量细菌素不敏感，这由尾素缺陷菌株中无抑菌圈、而细菌素缺陷菌株中存在抑菌圈的结果所证实。相反，菌株B对尾素不敏感，但对低分子量细菌素敏感。尾素在PEG沉淀后可被有效回收，而低分子量细菌素则不能。WT = 野生型。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：区分非复制性抗菌剂与噬菌体。（A）高滴度噬菌体的稀释会产生数量逐渐减少的单个噬菌斑（上方为高滴度，下方为低滴度）。（B）细菌素的稀释导致透明区域均匀减小，且不会形成单个噬菌斑。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

此处所述的软琼脂覆盖技术已被研究噬菌体或细菌素的科研人员广泛应用数十年。该方法的主要优势在于操作简单、成本低廉且结果相对易于解读。通过将软琼脂覆盖法与聚乙二醇沉淀及系列稀释相结合，可将抗菌物质区分为高分子量与低分子量物质，以及可复制性与非复制性物质。即 噬菌体与尾丝蛋白毒素）。最后，通过靶向遗传操作（缺失和互补）对假定的细菌素或原噬菌体位点进行改造，可明确鉴定特定拮抗物质的身份。我们最近已利用该方法描述了一种在多种细菌中广泛存在的新型噬菌体来源的细菌素 Pseudomonas syringae 菌株⁹.

本方案中指出的培养基和培养条件适用于Pseudomonas syringae，对于在这些条件下生长旺盛的其他革兰氏阴性菌也可能适用。然而，使用该方法的研究人员需要针对自身研究体系优化诱导时间、培养基、诱导方法和培养温度。关键参数包括：在产菌培养物处于对数生长期时进行诱导；在软琼脂覆盖层中接种足够量的对数生长期培养物，以确保细菌分布均匀，但接种量不宜过多，以免掩盖潜在的透明圈。许多细菌素并非通过SOS反应诱导产生，而是通过基于肽类的群体感应系统诱导（尤其是革兰氏阳性菌产生的细菌素¹⁵），因此研究人员可能需要筛选多种不同的诱导方法（例如调整诱导培养基的营养成分，或延长产菌株的培养时间）。

使用该技术时，软琼脂覆盖层必须完全融化，并在加入接种菌株前保持在 55–60 °C。我们曾多次遇到软琼脂看似已融化但实际上未完全融化的情况，导致覆盖层呈现颗粒状外观。颗粒状覆盖层的结果通常仍可大致解读，但其可读性取决于抑制作用的强弱（较弱的抑制作用更难观察）。使用该技术时还需考虑另一个干扰因素：熔融琼脂在接种接种菌株前必须有足够时间冷却，以避免杀死接种菌株。为避免此问题，我们确保软琼脂触感温热但不烫手。此外，我们还发现，若在倾注覆盖层前未给予接种菌液足够时间适应熔融琼脂环境，则通常会获得较差的细菌生长，从而使特异性抑制作用的判断变得困难甚至无法解读。因此，我们在涡旋混匀后与倾注覆盖层前额外静置孵育 10–15 秒。保持琼脂完全熔融状态（越热越有利）与避免对接种菌株造成致死伤害（越热越不利）之间的权衡，通常需要研究人员通过反复试验来确定最佳条件。

如果使用聚乙二醇（PEG）沉淀步骤，建议设置一个阴性对照，即对无菌肉汤培养基进行与培养上清液完全相同的处理。这将确保杀菌活性并非由样品上清液中残留的PEG或氯仿所致。

由于噬菌体和细菌素通常具有高度特异性，因此在特定菌株组合中未观察到明显的杀伤活性是常见现象。这可能源于多种菌株特异性的抗性机制，其中之一是测试菌株缺乏某种受体，或具有无法识别的受体变体，而该受体是特定细菌素或噬菌体靶向作用所必需的。

一种替代方法，即细菌素筛选方法，已由Kawai描述 等，但存在缺点，尚未被广泛采用¹⁶具体而言，该技术需要以可能较为繁琐的时间间隔观察肉汤样品，且无法区分噬菌体介导与细菌素介导的杀菌活性。

该技术的主要局限性在于，它不太适用于生长不旺盛的生物体（因此缺乏明显可辨的透明区），或在实验室条件下无法稳定产生前噬菌体或细菌素的生物体。若能将该技术改进用于检测环境样品中产生的细菌素，将不仅拓展该技术的应用价值，也有助于更深入地理解细菌素在自然环境中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丝裂霉素C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	致癌性物质。配制储备液时务必使用适当的个人防护装备（例如手套、护目用具和面罩）。
氯仿	Sigma-Aldrich	34854	急性毒性，具有呼吸系统危害。使用适当的个人防护装备（手套和护目罩），在化学通风橱内操作敞口容器。
聚乙二醇（PEG）	Amresco	0159
细菌学级琼脂	Genesee Scientific	20-274