利用微尺度热泳技术绘制适配体在ATP上的结合位点

摘要

微量热泳（MicroScale Thermophoresis，MST）是一种用于表征适配体与靶标相互作用的高灵敏度技术。本文描述了一种利用MST技术表征适配体与小分子相互作用的实验方案。

摘要

以结合亲和力、化学计量比和热力学等基本结合参数来表征分子间相互作用，是基础科学与应用科学中的关键步骤。微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）是一种灵敏的生物物理方法，可用于获取这些重要信息。该技术基于一种称为热泳的物理效应，即分子在温度梯度中的移动行为，从而能够在溶液中快速而精确地测定结合参数，并可自由选择缓冲条件（从缓冲液到裂解液或血清）。MST利用了游离分子与结合成复合物的分子在热泳行为上的差异。在发生分子相互作用时，由于分子的大小、电荷和水合层发生变化，其热泳行为也随之改变。通过比较两种结合伙伴在不同分子比例下的运动曲线，可定量测定结合亲和力（pM至mM范围）等参数。即使是小分子之间具有挑战性的相互作用，例如适配体与小分子化合物之间的相互作用，也可通过MST进行研究。本文以DH25.42 DNA适配体与ATP之间已被广泛研究的模型相互作用为例，提供了一种表征适配体-小分子相互作用的实验方案。本研究证明，MST具有高度灵敏性，并可将7.9 kDa DNA适配体的结合位点精确定位于ATP的腺嘌呤部分。

引言

分子间的相互作用是自然界的基础。因此，许多基础与应用研究领域的科学家都致力于理解不同类型分子相互作用的基本原理。微尺度热泳（MicroScale Thermophoresis, MST）技术使科学家能够在溶液中快速、精确、低成本且质量可控地表征分子相互作用，并可自由选择缓冲体系。仅在2016年就有超过1000篇使用MST技术的文献发表，涵盖了多种分析类型，包括文库筛选、结合事件验证、竞争性结合实验以及涉及多个结合伙伴的实验^1-8。通常情况下，MST可用于研究各类分子相互作用的经典结合参数，如结合亲和力（pM至mM）、化学计量比和热力学特性。MST的一大优势在于其能够不受相互作用分子大小限制地研究结合事件，甚至可以对小分子核酸适配体（15–30 nt）与小分子、药物、抗生素或代谢物等靶标之间的高难度相互作用进行定量分析。

目前用于表征适配体-靶标相互作用的前沿技术，要么实验操作繁琐且极为复杂，要么无法定量检测适配体与小分子之间的相互作用^9,10。基于表面等离子共振（SPR）的检测方法^11,12以及真正无标记的量热技术，如等温滴定量热法（ITC）^13-15、等度洗脱¹⁶、平衡过滤法^17,18、原位探针技术¹⁹、凝胶迁移实验、停流荧光光谱法^20,21、荧光各向异性（FA）^22,23、单分....

方案

1. 适配体工作液的制备

1. 按照制造商说明，将寡核苷酸（5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3，序列来自参考文献¹⁸）溶解于水中，配制成终浓度为 100 µM 的溶液。
2. 用结合缓冲液（20 mM Tris，pH 7.6；300 mM NaCl；5 mM MgCl₂；0.01% Tween20）将寡核苷酸储备液稀释至 200 nM，制备适配体工作液。
3. 将混合物在 90 °C 下孵育 2 分钟，立即置于冰上冷却，并在室温下使用该样品。

2. 配体稀释系列的制备

1. 针对每种配体（三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、单磷酸腺苷（AMP）、腺嘌呤、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、脱氧三磷酸腺苷（dATP）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）；每种储备液浓度为10 mM），在200 µl微量反应管中进行16步连续稀释。
   注意：将配体储备液在14,000 × g下离心5分钟，有助于去除聚集物。建议使用低吸附、低体积的反应管，以避免分子吸附到管壁上。
2. 起始浓度应至少为预估亲和力的50倍，并在每一步稀释中将配体浓度降低50%。
   注意：控制软件中集成的浓度查找工具可模拟结合数据，有助于确定稀释系列的合适浓度范围。
3. 在1号管中加入20 µl配体储备液....

结果

本研究采用 MST 技术表征 DH25.42 DNA 适体¹⁸在 ATP 上的结合位点。与以往研究中通过随机标记一个或多个荧光基团的蛋白质来分析 ATP 或 ATP 模拟小分子相互作用的方法不同^38-40，本研究使用了在 5´ 端标记一个 Cy5 分子的 7.9 kDa 单链 DNA 适体。通过使用多种 ATP 衍生物及相关分子（这些分子在 ATP 的不同位置上存在差异），对 ATP 分子上的结合位点进行定位。将不同配体分别进行 16 个梯度的稀释（每步稀释 50%），并与固定量的 Cy5 标记适体混合。样品在标准毛细管中以 25% LED 和 20% 激光功率进行分析。记录微尺度热泳动曲线（MST 时间轨迹），并将来自 T-Jump 阶段的荧光单位对配体浓度作图（参见图 1C）。采用 Hill 方程进行曲线拟合，获得 EC₅₀ 值。在 5 次独立的生物学重复实验中（涉及 4 名不同操作者、2 批不同的适体储备液和 2 批不同的 ATP 储备液），ATP 与适体的相互作用表.......

讨论

质量控制：

样品物质在表面的非特异性粘附/吸附以及聚集效应，会对亲和力数据的质量产生显著影响。然而，目前仅有少数先进技术能够提供准确且快速的监测和规避这些效应的方法。微尺度热泳（MST）提供了集成的质量控制手段，可检测并帮助克服这些问题，从而实现对技术条件的逐步优化。通过毛细管扫描和毛细管形状（步骤 5.2 和 7.5），可以获取有关粘附和荧光效应的重要信息；而聚集/沉淀效应（步骤 7.7）则可在分子运动谱型中进行监测。这些质量控制措施有助于持续提升数据质量，是本实验方案中的关键步骤。

吸附效应的检测与故障排除：

毛细管扫描主要作为初始步骤，通过扫描样品槽支架上的荧光信号来确定毛细管的位置。每个峰代表一根毛细管，指示MST测量的起始点。通过目视检查峰形，可判断分子是否吸附到玻璃表面，这是在开始MST实验前必须进行的关键质量控制步骤。毛细管形状叠加功能有助于快速识别扁平化、不规则波动或呈U形的峰形，这些特征提示分子已吸附或粘附在毛细管内壁玻璃表面（图3A

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
适配体结合缓冲液			20 mM Tris pH 7.6；300 mM NaCl；5 mM MgCl2；0.01% Tween-20
荧光标记的ATP适配体	IDT，比利时鲁汶		序列：DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich，德国	A2383	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
ADP	Sigma Aldrich，德国	A2754	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
AMP	Sigma Aldrich，德国	A2252	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
腺嘌呤	Sigma Aldrich，德国	A8626	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
SAM	Sigma Aldrich，德国	A7007	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
dATP	Sigma Aldrich，德国	11934511001	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
CTP	Sigma Aldrich，德国	C1506	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
GTP	Sigma Aldrich，德国	G8877	10 mM 储存液，保存于 -20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑	MO-G008	蓝/红通道 MST设备配备标准检测器，Monolith NT115 pico为配备高灵敏度检测器的MST设备
Monolith NT.115 毛细管 标准型	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑	MO-K002
Eppendorf PCR管	Eppendorf，德国	30124537
Monolith 控制软件 2.1.33，预装于设备中	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software