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利用微尺度热泳技术绘制适配体在ATP上的结合位点

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DOI：

10.3791/55070

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2017年1月7日

 , 
12bind GmbH

本文内容

摘要

微量热泳（MicroScale Thermophoresis，MST）是一种用于表征适配体与靶标相互作用的高灵敏度技术。本文描述了一种利用MST技术表征适配体与小分子相互作用的实验方案。

摘要

以结合亲和力、化学计量比和热力学等基本结合参数来表征分子间相互作用，是基础科学与应用科学中的关键步骤。微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）是一种灵敏的生物物理方法，可用于获取这些重要信息。该技术基于一种称为热泳的物理效应，即分子在温度梯度中的移动行为，从而能够在溶液中快速而精确地测定结合参数，并可自由选择缓冲条件（从缓冲液到裂解液或血清）。MST利用了游离分子与结合成复合物的分子在热泳行为上的差异。在发生分子相互作用时，由于分子的大小、电荷和水合层发生变化，其热泳行为也随之改变。通过比较两种结合伙伴在不同分子比例下的运动曲线，可定量测定结合亲和力（pM至mM范围）等参数。即使是小分子之间具有挑战性的相互作用，例如适配体与小分子化合物之间的相互作用，也可通过MST进行研究。本文以DH25.42 DNA适配体与ATP之间已被广泛研究的模型相互作用为例，提供了一种表征适配体-小分子相互作用的实验方案。本研究证明，MST具有高度灵敏性，并可将7.9 kDa DNA适配体的结合位点精确定位于ATP的腺嘌呤部分。

引言

分子间的相互作用是自然界的基础。因此，许多基础与应用研究领域的科学家都致力于理解不同类型分子相互作用的基本原理。微尺度热泳（MicroScale Thermophoresis, MST）技术使科学家能够在溶液中快速、精确、低成本且质量可控地表征分子相互作用，并可自由选择缓冲体系。仅在2016年就有超过1000篇使用MST技术的文献发表，涵盖了多种分析类型，包括文库筛选、结合事件验证、竞争性结合实验以及涉及多个结合伙伴的实验1-8。通常情况下，MST可用于研究各类分子相互作用的经典结合参数，如结合亲和力（pM至mM）、化学计量比和热力学特性。MST的一大优势在于其能够不受相互作用分子大小限制地研究结合事件，甚至可以对小分子核酸适配体（15–30 nt）与小分子、药物、抗生素或代谢物等靶标之间的高难度相互作用进行定量分析。

目前用于表征适配体-靶标相互作用的前沿技术，要么实验操作繁琐且极为复杂，要么无法定量检测适配体与小分子之间的相互作用9,10。基于表面等离子共振（SPR）的检测方法11,12以及真正无标记的量热技术，如等温滴定量热法（ITC）13-15、等度洗脱16、平衡过滤法17,18、原位探针技术19、凝胶迁移实验、停流荧光光谱法20,21、荧光各向异性（FA）22,23、单分子荧光成像24,25和生物膜层干涉技术（BLI）26，也均存在精度不足或不适用于适配体-小分子相互作用的问题。这些方法的其他主要缺陷还包括灵敏度低、样品消耗量大、需固定化操作、表面传质受限，和/或缓冲体系受限。仅有少数技术能够提供针对聚集和吸附效应的整合性对照措施。

MST 是一种强大的工具，可帮助科学家克服这一限制，用于研究适配体与小分子27-29以及其他靶标（如蛋白质）30-33之间的相互作用。该技术依赖于分子在温度梯度中的运动。这种定向运动称为“热泳”，其特性取决于分子的大小、电荷和水合层34,35。配体与分子结合后会直接改变这些参数中的至少一个，从而导致热泳迁移率发生变化。尺寸较小的配体在未结合态与结合态之间的尺寸变化可能不显著，但其对水合层和/或电荷可能产生显著影响。分子在与结合伴侣相互作用后热泳运动的变化，使得基本结合参数的定量分析成为可能2,7,34,36,37。

如图1A所示，MST（微量热泳）装置利用与荧光检测相同的光学系统，将红外激光聚焦至玻璃毛细管内的样品上。在激光建立温度梯度（ΔT为2–6 °C）的同时，可通过色氨酸的内在荧光6或荧光标记的相互作用分子3,8来监测蛋白质的热泳运动。空间中由此产生的温度差异ΔT会导致分子在升温区域发生耗尽或富集，该现象可通过索雷特系数（ST）进行量化：

热力学方程，\( S_T \times \frac{c_{hot}}{c_{cold}} = \exp(-S_T \Delta T) \)，公式。

chot 表示加热区域中的浓度，ccold 表示初始冷区域中的浓度。

如图1B所示，典型的微量热泳（MST）实验会得到一条MST运动曲线（时间轨迹），该曲线包含多个可依据其各自时间尺度区分的不同阶段。在无温度梯度的前5秒内测量初始荧光值，以确定精确的起始荧光强度，并检测是否存在光漂白或光增强现象。温度跃变（T-Jump）阶段是指在热泳运动发生前荧光发生变化的阶段。该阶段荧光的初始下降程度取决于荧光团量子产率随温度变化的特性。随后进入热泳阶段，由于分子的热泳运动，荧光强度随之下降（或上升），直至达到稳态分布。当激光关闭后，可观察到反向T-Jump及荧光分子伴随的反向扩散过程，如图1B所示。为了获取基本的结合参数，需分析并比较不同摩尔比例的相互作用组分。通常，在一次MST实验中研究16种不同的比例，其中光学可见分子的浓度保持恒定，而未标记配体的浓度逐步增加。两个结合组分之间的相互作用会引起热泳行为的变化，从而导致归一化荧光值Fnorm的变化，其计算方法如下：

静力平衡公式；Fnorm=F(热)/F(冷)；方程；热力学分析；物理学研究。

Fhot 和 Fcold 代表 MST 谱图中特定时间点的平均荧光强度。通过曲线拟合可计算结合亲和力（Kd 或 EC50 值）（图 1C）。

总体而言，微量热泳动（MST）是一种研究各类分子相互作用的有力工具。本文提供了一种用于表征小分子三磷酸腺苷（ATP；0.5 kDa）与25个核苷酸长度的单链DNA适配体DH25.42（7.9 kDa）之间相互作用的实验方案。在本研究过程中，确定了该适配体在ATP分子上的结合位点，精确定位于ATP的腺嘌呤基团。

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方案

1. 适配体工作液的制备

  1. 按照制造商说明，将寡核苷酸（5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3，序列来自参考文献18）溶解于水中，配制成终浓度为 100 µM 的溶液。
  2. 用结合缓冲液（20 mM Tris，pH 7.6；300 mM NaCl；5 mM MgCl2；0.01% Tween20）将寡核苷酸储备液稀释至 200 nM，制备适配体工作液。
  3. 将混合物在 90 °C 下孵育 2 分钟，立即置于冰上冷却，并在室温下使用该样品。

2. 配体稀释系列的制备

  1. 针对每种配体（三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、单磷酸腺苷（AMP）、腺嘌呤、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、脱氧三磷酸腺苷（dATP）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）；每种储备液浓度为10 mM），在200 µl微量反应管中进行16步连续稀释。
    注意：将配体储备液在14,000 × g下离心5分钟，有助于去除聚集物。建议使用低吸附、低体积的反应管，以避免分子吸附到管壁上。
  2. 起始浓度应至少为预估亲和力的50倍，并在每一步稀释中将配体浓度降低50%。
    注意：控制软件中集成的浓度查找工具可模拟结合数据，有助于确定稀释系列的合适浓度范围。
  3. 在1号管中加入20 µl配体储备液（10 mM），并向2至16号微量反应管中各加入10 µl适配体结合缓冲液。
  4. 将1号管中的10 µl溶液转移至2号管，通过反复吹打数次充分混匀。再将10 µl溶液转移至下一管，依此类推完成后续各管的稀释。
  5. 从最后一管中弃去10 µl多余液体，避免缓冲液稀释效应。1号管与2–16号管中的缓冲液必须完全相同。

3. 最终反应混合液的制备

  1. 为尽量减少移液误差，将每个结合反应体系配制为20 µl（10 µl适配体工作液 + 10 µl相应配体稀释液）。仅需4 µl即可充满毛细管。
  2. 将10 µl浓度为200 nM的适配体工作液加入到10 µl各配体稀释液中，并通过反复吹打数次充分混匀。
  3. 室温孵育5分钟，然后将样品通过将毛细管浸入样品中装入标准毛细管。某些相互作用可能需要更长的孵育时间，但大多数情况下5分钟已足够。仅可触碰毛细管的侧壁，切勿触碰中部区域，因为光学测量将在该区域进行。
  4. 将毛细管放置于毛细管托盘上，并启动MST仪器。

4. 启动 MST 设备

注意：该设备提供两个预装软件包，即“control"”软件，用于实验条件的技术设置，以及“analysis"”软件，用于对生成的数据进行解读。

  1. 在将毛细管托盘放入MST设备之前，启动控制软件，并通过在“温度控制"下拉菜单中选择“启用手动温度控制"来调节所需的总体温度。以这种方式将温度调节至25 °C。
    注意：MST仪器的温度控制范围为22至45 °C。
  2. 等待温度达到预期值后，再将毛细管托盘放入MST设备中。
  3. 将LED通道设置为“红色"以用于Cy5染料，并调节LED功率，使在标准传感器的MST设备上获得300至1,000荧光单位的荧光信号。本研究中使用25%的LED功率。
    注意：对于配备高灵敏度传感器的MST，建议荧光信号范围为6,000至18,000荧光单位。

5. 毛细管扫描

  1. 在开始 MST 测量之前，通过在 "control" 软件中选择毛细管位置并点击 "start cap scan" ，执行毛细管扫描以检查样品的多种质量指标。
  2. 在软件中检查毛细管扫描结果，观察是否存在荧光增强/猝灭以及粘附效应（U 形或扁平峰）。
    注：有关荧光效应和粘附效应的检测与处理的更多细节，请参见讨论部分。

6. 微尺度热泳动测量

注意：在开始 MST 测量之前，务必排除粘附效应、增强/猝灭效应或移液误差，并确保毛细管扫描显示荧光信号足够强。更多细节请参见讨论部分。

  1. 在“control"软件中，将稀释系列的配体浓度分配至相应的毛细管位置。注意适配体与配体混合时的稀释步骤（1:1）。
  2. 在毛细管#1中输入配体的最高浓度（5 mM），选择正确的稀释类型（此处为1:1），点击最大浓度，并使用拖拽功能自动分配毛细管#2–16中的剩余浓度。最低浓度为152.6 nM。
  3. 在控制软件的相应区域输入荧光标记适配体的浓度（此处为100 nM）。
  4. 使用默认设置，即荧光检测5秒，随后记录30秒的微量热泳（MST）信号，激光关闭后再继续记录5秒荧光信号，以监测分子的回扩散过程。
  5. 在控制软件的相应区域将激光功率调整为20%。
    注意：为获得最佳信噪比并避免非特异性效应，建议使用20–40%的激光功率。在特定情况下，可能需要更高的激光功率以实现未结合与结合分子之间的良好分离。
  6. 选择目标文件夹后保存实验，并点击“Start MST measurement"按钮开始MST测量。
    注意：目标文件夹中将生成.ntp文件。采用此设置，单次测量持续10–15分钟。
  7. 为更准确地确定EC50值，至少重复实验两次。
    注意：为检验技术重复性，可对同一毛细管进行多次扫描（技术重复）。

7. MST 数据分析

注意：分析软件可在测量过程中实时分析数据。该分析软件会绘制 MST 时间轨迹以及归一化荧光（Fnorm）随配体浓度的变化曲线37。

  1. 启动MST分析软件（MO.Affinity Analysis），从目标文件夹中加载.ntp文件。选择 "MST" 作为数据分析菜单中的分析类型。
    注意：若存在配体依赖性荧光效应，可选择初始荧光值进行分析。
  2. 通过拖放或按下相应按钮，将各自的技术重复或生物学重复添加到新分析中 "+" 相应实验运行下方的按钮
  3. 点击相应实验运行下方的信息按钮，可获取有关实验性质、MST曲线、毛细管扫描、毛细管形状、初始荧光及漂白速率的信息。
    注意：这些原始数据也可在后续分析步骤中进行检查。
  4. 目视检查MST曲线中是否存在聚集和沉淀效应，这些效应表现为凸起和尖峰。
    注意：有关聚集效应的检测与处理的更多信息，请参阅讨论部分。
  5. 目视检查毛细管扫描图及毛细管形状叠加图，观察是否存在吸附效应，表现为峰形扁平或呈U形。目视检查毛细管扫描图及初始荧光信号，观察荧光相关效应。目视检查漂白速率，评估光漂白效应。
  6. 切换至剂量-反应模式，并将分析设置更改为 "专家" 通过按下相应按钮选择模式。选择 "T-跳跃" 作为MST评估策略。
  7. 选择 "希尔" 用于曲线拟合的模型。结合参数将自动计算。通过选择相应的归一化类型对数据进行归一化处理 "比较结果" 菜单。将数据导出为 .xls 或 .pdf 格式。
    注意：结合曲线图下方的表格总结了计算得到的结合参数。

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结果

本研究采用微量热泳动（MST）技术表征DH25.42 DNA适配体18 在ATP分子上的结合位点。与以往研究中通过随机标记一个或多个荧光基团的蛋白质来分析ATP或ATP模拟小分子相互作用的方法不同38-40，本研究使用了一种经标记的7.9 kDa单链DNA适配体，其5´端连接一个Cy5荧光分子。通过多种ATP衍生物及相关分子（这些分子在ATP的不同位置上存在结构差异）对ATP分子上的结合位点进行定位分析。将不同配体分别进行16个梯度的系列稀释（每步浓度降低50%），并与固定浓度的Cy5标记适配体混合。样品在标准毛细管中以25% LED光强和20%激光功率进行检测。记录热泳动曲线（MST时间轨迹），并将来自T-Jump阶段的荧光信号值对配体浓度作图（参见图1C）。采用Hill方程进行曲线拟合，获得EC50值。在5次独立的生物学重复实验中（涉及4名不同操作者、2批不同的适配体储备液和2批不同的ATP储备液），ATP与适配体的相互作用表现出6至13个单位的负结合信号幅度，平均EC...

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讨论

质量控制：

样品物质在表面的非特异性粘附/吸附以及聚集效应，会对亲和力数据的质量产生显著影响。然而，目前仅有少数先进技术能够提供准确且快速的监测和规避这些效应的方法。微尺度热泳（MST）提供了集成的质量控制手段，可检测并帮助克服这些问题，从而实现对技术条件的逐步优化。通过毛细管扫描和毛细管形状（步骤 5.2 和 7.5），可以获取有关粘附和荧光效应的重要信息；而聚集/沉淀效应（步骤 7.7）则可在分子运动谱型中进行监测。这些质量控制措施有助于持续提升数据质量，是本实验方案中的关键步骤。

吸附效应的检测与故障排除：

毛细管扫描主要作为初始步骤，通过扫描样品槽支架上的荧光信号来确定毛细管的位置。每个峰代表一根毛细管，指示MST测量的起始点。通过目视检查峰形，可判断分子是否吸附到玻璃表面，这是在开始MST实验前必须进行的关键质量控制步骤。毛细管形状叠加功能有助于快速识别扁平化、不规则波动或呈U形的峰形，这些特征提示分子已吸附或粘附在毛细管内壁玻璃表面（图3A

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披露

C.E. 和 T.S. 是 2bind GmbH 的员工，该公司提供生物物理分析服务。 本视频文章的出版费用由 2bind GmbH 支付。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
适配体结合缓冲液20 mM Tris pH 7.6；300 mM NaCl；5 mM MgCl2；0.01% Tween-20
荧光标记的ATP适配体IDT，比利时鲁汶序列：DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATPSigma Aldrich，德国 A238310 mM 储存液，保存于 -20 °C
ADPSigma Aldrich，德国 A275410 mM 储存液，保存于 -20 °C
AMPSigma Aldrich，德国 A225210 mM 储存液，保存于 -20 °C
腺嘌呤Sigma Aldrich，德国 A862610 mM 储存液，保存于 -20 °C
SAMSigma Aldrich，德国 A700710 mM 储存液，保存于 -20 °C
dATPSigma Aldrich，德国 1193451100110 mM 储存液，保存于 -20 °C
CTPSigma Aldrich，德国 C150610 mM 储存液，保存于 -20 °C
GTPSigma Aldrich，德国 G887710 mM 储存液，保存于 -20 °C
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies，德国慕尼黑MO-G008蓝/红通道
MST设备配备标准检测器，Monolith NT115 pico为配备高灵敏度检测器的MST设备
Monolith NT.115 毛细管 标准型NanoTemper Technologies，德国慕尼黑MO-K002
Eppendorf PCR管Eppendorf，德国30124537
Monolith 控制软件 2.1.33，预装于设备中NanoTemper Technologies，德国慕尼黑
MO.affinity analysis v2.1.1NanoTemper Technologies，德国慕尼黑
Kaleidagraph 4.5.2Synergy Software

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