映射的适体对ATP的结合部位使用MicroScale程序热泳

Summary

MicroScale Thermophoresis （MST） 是一种表征适配体-靶标相互作用的灵敏技术。本手稿描述了一种表征适配体-小分子相互作用的 MST 方案。

Abstract

根据基本结合参数（如结合亲和力、化学计量学和热力学）表征分子相互作用是基础科学和应用科学中必不可少的步骤。MicroScale Thermophoresis （MST） 是一种获取这些重要信息的灵敏生物物理方法。该技术依赖于一种称为热泳的物理效应，它描述了分子在温度梯度中的运动，该技术可以快速、精确地测定溶液中的结合参数，并允许自由选择缓冲液条件（从缓冲液到裂解物/血清）。MST 利用了这样一个事实，即未结合的分子与与结合伴侣复合的分子表现出不同的热泳运动。由于大小、电荷和水合壳的变化，热泳运动在分子相互作用的瞬间发生变化。通过比较两个结合伴侣的不同分子比例的运动曲线，可以确定结合亲和力（pM 到 mM）等定量信息。即使是小尺寸分子之间具有挑战性的相互作用，例如适配体和小化合物，也可以通过 MST 进行研究。利用 DH25.42 DNA 适配体和 ATP 之间经过充分研究的模型相互作用，本手稿提供了一种表征适配体-小分子相互作用的方案。本研究表明，MST 高度敏感，并允许将 7.9 kDa DNA 适配体的结合位点定位到 ATP 的腺嘌呤。

Introduction

分子之间的相互作用是自然的基础。因此，科学家基础和应用研究的众多领域尝试了解不同种类的分子相互作用的基本原则。 MicroScale程序热泳（MST），科学家可以在溶液中进行快速，精确，成本效益和质量控制的分子间相互作用的特征，与缓冲区的自由选择。目前已经有超过1000出版物使用MST，2016年独自一人，描述不同类型的分析，包括图书馆放映，结合事件验证，竞争分析，和实验与多个合作伙伴的结合^1-8。在一般情况下，台MST允许古典结合参数，如任何类型的分子相互作用的结合亲和力（1pM至毫米），化学计量，和热力学，研究。 MST的一大优点是研究独立的互动合作伙伴的大小结合事件的能力。即使CHAL目标小核酸适体之间有挑战性相互作用（15-30个核苷酸）和诸如小分子，药物，抗生素，或代谢产物可以定量。

当前国家的最先进的技术来表征适体靶相互作用或者是实验室强烈和高度复杂的或无法量化适配子的小分子的相互作用^9,10。表面等离子体共振（SPR）为基础的试验^11,12和真正的无标记热量的方法，如温滴定量热^{（ITC）13-15}度洗脱^16，平衡渗透^17,18，在线探测^19，凝胶-移位测定，stopped-溢流FL荧光光谱^20,21，荧光各向异性^{（FA）22,23，}单分子FL荧光成像^24,25，和生物层干涉测量^（BLI）26也无论是不精确或适体-小分子不相容互动。其他principa这些方法升问题是灵敏度低，高样品消耗，固定化，在表面上的质量传递的限制，和/或缓冲的限制。只有少数这些技术提供了聚集和吸附作用的综合控制。

台MST表示一个强大的工具为科学家克服这种限制，研究其它靶的适体和小分子^27-29之间的相互作用，以及如蛋白质^30-33。该技术依赖于分子通过温度梯度的运动。这种定向运动，被称为"热泳，"取决于大小，电荷，并且该分子^34,35的水化外壳。配体分子的结合将直接改变这些参数中的至少一个，从而产生改变热泳迁移率。小尺寸的配体可能没有从绑定尺寸的变化对束缚态方面相当大的影响，但可以拥有博士上水合壳和/或电荷amatic影响。在分子与结合配偶体相互作用后的热泳运动的变化使得基本结合参数^2,7,34,36,37的量化。

如在图1A中所描绘的MST装置由红外激光聚焦到使用相同的光学元件作为用于荧光检测的玻璃毛细管内的试样。而激光建立温度梯度（2-6℃的ΔT）可监控的蛋白质经由色氨酸⁶或荧光标记的相互作用配偶^3,8的固有FL荧光的热泳的运动。在空间，ΔT，所产生的温度差会导致在升高的温度下的区域耗尽或分子的积累，这可通过索瑞量化系数音响cient（S _T）的 :

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C _热表示在被加热区域的浓度，和c _冷是在初始冷区域中的浓度。

如图1B所示 ，一个典型的MST试验结果在MST运动轮廓（时间跟踪），由不同的相位，这可以通过它们各自的时间尺度来分离的。初始荧光在第一5秒中不存在温度梯度的测量来定义的精确开始荧光和检查漂白或p​​hotoenhancement。温度跳跃（T-跳转）表示相，其中热泳动前的荧光变化。荧光这个初始下降取决于uorophore量子产率FL的热依赖性变化。热泳相位如下，其中达到荧光减少（或增加），由于分子直至稳态分布的热泳运动。如在图1B中所示的激光被关闭后，可以观察到的反向TJump和FL uorescent分子伴随背面扩散。为了获得基本的绑定参数，相互作用伙伴不同的摩尔比进行了分析和比较。通常情况下，16个不同的比例进行了研究一个MST实验，而光可见分子被保持恒定，并且与未标记的配体的增加量供给。两个结合配偶之间的相互作用诱导的热泳的变化，并因此在规范化FL荧光，女_范数 ，这是因为以下计算:

˚F _热和F _冷代表在MST痕迹德科幻奈德时间点的平均荧光FL强度。结合亲和力（K _D或EC ₅₀值）可以通过CURV计算易连接（ 图1C）。

总体来看，MST是一个强大的工具来研究任何种类的分子间的相互作用。这份手稿提供了一个协议来表征小分子三磷酸腺苷（ATP 0.5 kDa的）之间的相互作用充满挑战和25-nt的单链DNA短适体DH25.42（7.9 kDa的）。在手稿的过程中，在ATP分子的适体的结合位点被映射下来到腺嘌呤基团的ATP。

Protocol

1.适体工作股票的制备

1. 遵循制造商的指示和（从基准¹⁸ 5-的Cy5- CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3，序列）溶于水的寡核苷酸，达到100μM的最终浓度。
2. 通过稀释寡库存至200nM用结合缓冲液制备的适体的工作溶液（20毫摩尔Tris，pH值7.6; 300毫摩尔NaCl; 5mM的MgCl ₂的0.01％吐温20）。
3. 孵育2分钟，混合物在90℃，让样品立即冷却在冰上，并在室温下使用的样本。

2.配体稀释系列的研制

1. 对于各配体（三磷酸腺苷（ATP），腺苷二磷酸（ADP），腺苷一磷酸（AMP），腺嘌呤，鸟苷三磷酸（GTP），三磷酸胞苷（CTP），脱氧腺苷三磷酸（的dATP），和S-腺苷甲硫氨酸（SAM） ;每个10毫米股票），准备一个16级串行diluti关于在200μl微反应管。
   注:5分钟在14000 XG可能有助于除去聚集配股票的离心。低量，推荐使用低结合反应管，以避免分子吸附到所述管的壁。
2. 开始的比估计的亲和力高至少50倍的最大浓度和50％在各稀释步骤减少配体的浓度。
   注:在控制软件实施的集中查找工具结合模拟数据，并寻找合适的浓度范围稀释系列帮助。
3. 填写20μl，以管1.配股票（10毫米）的加10μl适体结合缓冲液到微反应管2至16。
4. 转移10微升管1的向管2及通过上下吹打几次适当地混合。转移10微升到下管，并重复此稀释剩余的管子。
5. 丢弃10微升过剩从上管。避免以下buffer稀释效应。在管1和管2-16缓冲区必须相同。

3.最终反应预混液的制备

1. 制备具有20微升体积的各个结合反应（10微升适体工作溶液+10微升的各配位体稀释的），以最小化移液误差。只有4微升的体积是苏夫网络cient到FI LL毛细管。
2. 添加10微升200nM的适体工作溶液到10微升各配体稀释，并通过上下抽吸数次适当地混合。
3. 通过浸渍毛细血管进入样品孵育在室温和音响LL样品为标准毛细管5分钟的样品。潜伏期较长时间可能对一些互动是必要的;然而，5分钟是足够的大多数。触摸仅在侧面的毛细管，而不是在中间的部分，其中该光学测量将采取。
4. 放置到毛细血管第Ë毛细盘和启动MST设备。

4.启动MST设备

注:设备提供了两个预安装的软件包，在'控制"软件的实验条件和技术设置'分析"，为产生的数据解释软件。

1. 将毛细管盘成MST设备之前，开始控制软件，并调整通过选择''"温度控制下拉菜单中的"启用手动温度控制"的总体要求的温度。调整温度至25℃以这种方式。
   注:MST仪器就能温度控制在22至45℃。
2. 等待温度达到预期的水平，然后将毛细管盘成MST设备。
3. 设置LED通道到'红色"对的Cy5染料和调节LED的功率以获得一个FL uorescenc在一个标准的传感器MST设备300到1000荧光单位E信号。 25％的LED功率在该研究中使用。
   注:6000至18000荧光单元被推荐用于MST具有高灵敏度的传感器。

5.毛细管扫描

1. 开展毛细管扫描选择了"控制"软件毛细血管位置，点击检查样品的不同质量等方面"开始扫描帽" 出发前的MST测量。
2. 检查是否有荧光增强/淬火坚持效果（U形或扁平峰）在软件毛细管扫描。
   注:更多关于检测和荧光的处理和贴效果的详细信息可以在讨论中被发现。

6. MST测量

注:在开始测量MST之前，确保排除粘附作用，增强/淬火效果，或移液误差，并确保在毛细管扫描表明FL荧光信号是萨夫音响充分的。有关详细信息，请参阅讨论。

1. 分配从稀释系列中的'控制"的软件的各毛细管位置的配位体浓度考虑混合的适体和配体的稀释步骤。（1:1）。
2. 进入配体毛细管＃1的最高浓度（5毫米），选择正确的稀释型（在这里，1:1），点击最高浓度，使用拖动功能来自动分配的毛细血管其余浓度＃2 16。的最低浓度是152.6纳米。
3. 输入在控制软件的各个部分中的FL uorescent适体（这里，100纳米）的浓度。
4. 使用默认设置，其检测所述FL荧光持续5秒，记录台MST为30秒，并且激光的t灭活后记录再5秒的荧光 O监控分子的反扩散。
5. 调整激光功率，以20％的在控制软件的各部分。
   注意:为了得到最好的信噪比，并避免非特异性的效果，推荐的20-40％的激光功率。在特定情况下，可能需要更高的激光功率，以便获得未结合的和结合的分子的良好分离。
6. 保存实验中选择目标文件夹后按'开始MST测量"按钮开始测量MST。
   注:.ntp文件将在目标文件夹中生成。使用这种设置，一个测量持续10-15分钟。
7. 重复实验过程至少两次以便更准确地确定EC ₅₀值。
   注意:为了测试技术再现性，相同的毛细管可以扫描多次（技术性重复）。

7. MST数据分析

核苷酸">注:分析软件能够在FL Y数据的分析测定时的分析软件绘制相对于配体浓度³⁷ MST时间迹线和在规范化FL荧光（F _范数 ）的变化。

1. 启动MST分析软件（MO.Affinity分析）和加载从目标文件夹中.ntp文件。选择"MST"作为在数据选择菜单中的分析类型。
   注:在配体依赖性荧光效应的情况下，最初的荧光可以被选择用于分析。
2. 通过拖放和下降，或者按相应的实验运行下面的"+"按钮，各自的技术或生物的run（S）添加到一个新的分析。
3. 按各自的实验运行下面的信息按钮以获得关于该实验中，MST痕迹，毛细管扫描，毛细管形状，初始荧光，和漂白率的属性信息。
   注意:这些原始数据，可以人因此在分析的后续步骤进行检查。
4. 目视检查MST痕迹的聚集和沉淀的效果，可见的颠簸和尖峰。
   注:有关检测和聚集效应处理的详细信息，请阅读讨论。
5. 目视检查毛细管扫描和毛细管状覆盖吸附效果，扁平形或U形的山峰可见。目视检查毛细管扫描和荧光效应的初始荧光。目视检查漂白效果的漂白率。
6. 切换到剂量反应模式，按下相应的按钮改变分析设置为"专家"模式。选择"T-JUMP"作为MST评估策略。
7. 选择曲线拟合的"山"的模式。结合参数将自动进行计算。通过选择在"比较结果"菜单的各类型正常化的正常化的数据。导出数据无论是作为一个.xls或.pdf格式。
   注:绑定图表下表总结了计算的结合参数。

Results

在这项研究中，MST施加以表征DH25.42的DNA适体¹⁸的结合位点上的ATP。相对于其他的研究表征的ATP或ATP的模拟与一个或更多个荧光团^38-40随机标记的蛋白质的小分子的相互作用，本研究包括的7.9 kDa的单链DNA适体与一种Cy5的分子标记的版本上的5'端。不同的ATP衍生物和相关分子，都在不同的位置从ATP的不同的，分别用于映射的ATP分子的结合位点。稀释系列（在16步，由每个降低50％的配体浓度）的不同配体的制备和用Cy5标记的适体的恒定量混合。样品在标准的毛细管在25％的LED和20％的激光功率进行分析。运动轮廓（MST时间轨迹）记录和荧光单位，从T-跳转相衍生，被作图配体精矿过程中（比较图1C）。进行曲线拟合施加Hill方程，导致EC ₅₀值。在5个独立的生物重复（4个不同的运营商，2个不同的适体的股票，2种不同的三磷酸腺苷的股票），ATP的适配子相互作用示出的6至13个单元的阴性结合幅度和52.3±5.0微米的平均EC ₅₀值（...

Discussion

质量控制:

非特异性粘着/样品材料的表面，以及聚集效应的吸附，对亲和数据的质量有巨大影响。但是，只有少数国家的最先进的技术提供准确，快速的选择，监督和避免这些影响。台MST提供了检测和帮助克服这些问题，从而允许技术设置的逐步优化集成质量控制。上粘附和荧光效果的重要信息可以从毛细管扫描和毛细管形状（步骤5.2和7.5）被提取，而聚集/沉淀的效果（步骤7.7）所用的运动轮廓进行监测。这些控制功能使数据质量的不断改善，并表示该协议的关键步骤。

吸附效应和故障诊断检测:

毛细管扫描作为一个ini主要是进行TiAl金属步骤通过在它扫描荧光来确定在托盘支架的毛细血管的位置。每个峰代表一个毛细管，指示用于台MST的测量的起始点。峰形状的目视检查使分子的吸附到玻璃表面上，这是应该开始MST实验之前进行的基本的质量控制的确定。毛细管形状覆盖允许容易地检测扁平，颠簸峰形，甚至类似于一个U形的峰，这表明分子与毛细管（ 图3A，上图）的内玻璃表面的吸附/粘附。不同涂覆毛细管...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
适配子结合缓冲液			20 mM Tris pH 7.6;300 mM NaCl;5 mM MgCl2; 0.01% 吐温-20
荧光标记的 ATP 适配体	IDT，比利时		序列：DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich，德国	A2383	10 mM 储备液，储存温度为 - 20 °C
ADP	Sigma Aldrich，德国	A2754	10 mM 储备液储存在 - 20 °C
AMP	Sigma Aldrich，德国	A2252	10 mM 储备液储存在 - 20 °C
腺嘌呤	Sigma Aldrich，德国	A8626	10 mM 储备液，储存温度为 - 20 °C
SAM	Sigma Aldrich，德国	A7007	10 mM 储备液储存在 - 20 °C
dATP	Sigma Aldrich，德国	11934511001	10 mM 储备液，储存温度为 - 20 °C
CTP	Sigma Aldrich，德国	C1506	10 mM 储备液，储存温度为 - 20 °C
GTP	Sigma Aldrich，德国	G8877	10 mM 储备液储存在 - 20 °C
巨石 NT.115	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑	MO-G008	蓝/红通道 带标准检测器的 MST 设备，Monolith NT115 pico 是带高灵敏度检测器的 MST 设备
Monolith NT.115 毛细管 标准	NanoTemper Technologies，德国慕尼黑	MO-K002
Eppendorf PCR 管	Eppendorf，德国	30124537
Monolith 控制软件。2.1.33，预装在设备	NanoTemper Technologies，德国
MO.亲和力分析 v2.1.1	NanoTemper Technologies，德国
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software