一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统

摘要

本方案描述了在雌性C57BL/6J小鼠中建立原位膀胱肿瘤并监测肿瘤生长的方法。

摘要

本方案描述了使用经改造可分泌人前列腺特异性抗原（PSA）的小鼠膀胱癌细胞系MB49，在雌性C57BL/6J小鼠中诱导膀胱肿瘤的建立方法，以及确认肿瘤植入的操作流程。简言之，采用注射类麻醉药物使小鼠麻醉，并使其呈仰卧位固定。排空膀胱内尿液后，使用24 G静脉导管以10 µL/20 s的速度缓慢灌注50 µL聚-L-赖氨酸（PLL）。通过封闭导管使PLL在膀胱内保留20分钟。随后拔除导管，并轻柔按压膀胱以排出PLL。接着以相同速度（10 µL/20 s）灌注小鼠膀胱癌细胞系（1 × 10⁵ 细胞/50 µL），并封闭导管以防止细胞悬液过早排出。1小时后，使用拮抗药物使小鼠苏醒，并排空膀胱。缓慢灌注至关重要，因其可减少膀胱输尿管反流，避免肿瘤在上尿路及肾脏中形成。细胞悬液应充分重悬，以减少细胞团块形成，否则可能导致植入后肿瘤大小不均。

该技术可高效诱导肿瘤形成。通过检测尿液中PSA的分泌来监测肿瘤生长。与超声或荧光成像相比，PSA标志物监测在检测膀胱内肿瘤存在方面更为可靠。若不进行治疗，小鼠体内的肿瘤通常在约3至4周内达到最大尺寸，对健康产生负面影响。通过监测肿瘤生长情况，可以区分真正被治愈的小鼠与未成功植入肿瘤的小鼠。若仅进行终点分析，后者可能被错误地认为已通过治疗实现治愈。

引言

本方法的目的是建立小鼠原位膀胱肿瘤模型，并尽可能准确地监测移植的肿瘤，以避免在实验终点分析时将未成功移植肿瘤的小鼠误判为已治愈。总体而言，该方法将减少实验分析所需的小鼠数量，并提高治疗效果判定的准确性。

建立癌症原位模型非常重要，因为皮下接种肿瘤细胞无法模拟临床疾病的微环境，也无法支持治疗策略的开发。膀胱的结构特点允许将膀胱癌治疗药物直接灌注至膀胱内，从而产生最小的全身性影响。因此，能够模拟这种环境的动物模型（例如原位模型）对于评估新疗法至关重要。任何实验设计所得出的结论都取决于模型本身的局限性。

已开发出多种技术用于在小鼠体内建立原位膀胱肿瘤模型。这些技术依赖于破坏膀胱的糖胺聚糖层，从而使肿瘤细胞得以植入。其中一种方法是电灼法，该方法在膀胱壁上造成单个损伤点，导致肿瘤在膀胱内单一位置形成^1,2。然而，电灼法的肿瘤植入成功率依赖于操作者，成功率范围为10–90%，且存在膀胱壁被穿孔的风险，可能导致肿瘤在腹腔内形成。化学灼烧法使用硝酸银破坏膀胱壁³。类似地，也曾使用酸性物质损伤膀胱壁⁴。此外，胰蛋白酶也被用于破坏膀胱组织⁵。这些方法可能导致膀胱内形成多个肿瘤。此外，若化学试剂与膀胱壁接触时间过长，存在造成膀胱严重损伤的风险。Ninalga 等建立的方法利用带正电荷的聚-L-赖氨酸（PLL）⁶分子包....

方案

所有动物实验均遵循新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）关于动物使用与操作的指南（方案编号 084/12）。

1. 培养 MB49-PSA 细胞 体外 以及前列腺特异性抗原（PSA）分泌的测定

1. 维持小鼠膀胱癌细胞 MB49-PSA¹⁵ 在添加了10%胎牛血清的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中 (FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺和0.05 mg/mL青霉素-链霉素，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养₂加入200 μg/mL潮霉素B以维持对分泌PSA细胞的选择压力。
2. 为测定PSA分泌，将1 × 10⁵个细胞接种于96孔板中⁶ 6孔培养板中的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 48 小时。
3. 两天后，收集上清液用于PSA检测。
   1. 使用巴斯德吸管将上清液转移至15 mL离心管中。
   2. 离心5分钟，250 × g，以去除漂浮的细胞和碎片。若前列腺特异性抗原（PSA）检测在另一天进行，将上清液置于1.5 mL微量离心管中，于-30 °C保存。若非如此，则立即进行下一步操作。
   3. 使用人游离PSA ELISA试剂盒测定PSA浓度⁷.
4. 计....

结果

MB49细胞的PSA分泌量随培养基的不同而变化。MB49-PSA在DMEM培养基中培养，因为这能促进PSA分泌量的增加。图1A). 为了确定PSA ELISA和实时PCR的灵敏度，将不同数量的MB49-PSA分泌细胞与MB49亲本细胞混合。PSA ELISA可检测到最低1 × 10⁵ PSA 分泌细胞/1 × 10⁶ 细胞 (图1B），而实时 PCR 分析可检测到每 1 × 10⁶ 个细胞中 100 个分泌 PSA 的细胞⁶ 细胞（图 1C）。因此，实时PCR比ELISA更敏感，但仅能用于整个膀胱的检测，限制了其在终点分析中的应用。PLL法肿瘤植入会导致多个肿瘤形成（图 2A)在膀胱中发育。使用代谢笼过夜收集尿液（图2B，上图）和随机尿样（图2B，下图）可用于ELISA法检.......

讨论

该实验方案中最关键的步骤包括：1）成功维持细胞系的致瘤性；2）在将肿瘤细胞植入小鼠前确保可检测到前列腺特异性抗原（PSA）的分泌；3）制备单细胞悬液以进行植入，从而减少肿瘤大小的差异；4）以缓慢速率注入细胞，防止发生膀胱输尿管反流，避免肿瘤细胞植入肾脏。

长期传代后 体外MB49/MB49-PSA 细胞可能会丧失其致瘤性，表现为无法在小鼠体内形成肿瘤。这可能成为判断治疗后小鼠是否被治愈的一个混杂因素。当缺乏肿瘤时，无法区分经治疗治愈的小鼠、因肿瘤具有免疫原性而自发痊愈的小鼠，或原本就未形成肿瘤的小鼠（因细胞系本身失去致瘤能力）。为应对这一问题，可通过在小鼠体内传代、建立皮下肿瘤来重新激活细胞。若传代过于频繁，则可能产生过度侵袭性的肿瘤。因此，需谨慎把握细胞重新传代的时机。通常情况下，在开展重要实验系列之前，应复苏细胞系并将其皮下接种至小鼠体内，以确认其成瘤能力。随后需对肿瘤进行数周的监测，确保未出现自发消退现象。若观察到自发消退，则应执行步骤3中的方案。同样，在将 MB49-PSA 细胞用于肿瘤接种前，必须始终验证其产生 PSA 的能力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MB49-PSA 细胞	N/A	N/A	参考文献（Wu QH, 2004）
RPMI 1640 培养基	HyClone	SH30027.01
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养基	Biowest	L0102
南美胎牛血清（FBS）	Biowest	S1810
南美胎牛血清（FBS），优级	Biowest	S181B
胎牛血清（FBS）	HyClone	SH30088.03
L-谷氨酰胺	Biowest	X0550
青霉素-链霉素	Biowest	L0022
潮霉素 B	Invitrogen	10687-010
游离 PSA（人）ELISA 试剂盒	Abnova	KA0209
用于 RNA 提取的 TRIzol 试剂	Ambion	15596026
含 RNase 抑制剂的高容量 cDNA 反转录试剂盒	Applied Biosystems	4374967
TaqMan 通用 PCR 主混合液	Applied Biosystems	4304437
TaqMan 基因表达检测 – 小鼠 Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan 基因表达检测 – 人 KLK3	Applied Biosystems	4331182	Hs00426859_g1
C57BL/6J 雌性小鼠	In Vivos		4–6 周龄
麻醉剂（75 mg/kg 氯胺酮和 1 mg/kg 美托咪啶）	本地药房
拮抗剂（1 mg/kg 阿替美唑）	本地药房
耳标钳	Electron Microscopy Sciences	72893-01
哈特曼溶液或复方乳酸钠溶液	B Braun
眼科软膏 - Duratears 无菌眼用润滑软膏	Alcon
暖热包 - HotHands 暖手器	Heatmax Inc
Introcan Certo 静脉留置针	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel 润滑胶	本地药房
聚-L-赖氨酸溶液，0.01%	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693159001
Quantichrom 肌酐检测试剂盒	BioAssay Systems	DICT-50
荧光染料 - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000
RNAlater-ICE 冷冻组织过渡溶液	Ambion	4427575
名称	公司	货号	备注
仪器与软件
7500 实时 PCR 系统	Applied Biosystems
7500 软件 v2.3	Applied Biosystems
代谢笼	Tecniplast	12 个笼位的立式支架
BD FACSCanto I 系统	BD Biosciences
BD FACSDiva 软件 v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT 活体成像系统	Caliper Life Sciences
Living Image 软件 v3.1	Caliper Life Sciences
Vevo 2100 成像系统	VisualSonics